Het huidige protocol schetst een methode voor het opzetten van een kosteneffectief rocker-platformgebaseerd apparaat dat wordt gebruikt voor het induceren van slaaptekort bij muizen. Dit apparaat heeft bewezen effectief te zijn in het veroorzaken van verstoringen in door elektro-encefalogram (EEG) bewezen slaappatronen, evenals het induceren van metabole en moleculaire veranderingen die verband houden met slaaptekort.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het opzetten van een apparaat voor slaaptekort bij muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Verstoring van het circadiane ritme verwijst naar de desynchronisatie tussen de externe omgeving of het gedrag en de endogene moleculaire klok, wat de gezondheid aanzienlijk schaadt. Slaaptekort is een van de meest voorkomende oorzaken van verstoring van het circadiane ritme. Er zijn verschillende modaliteiten (bijv. platforms op het water, zachte behandeling, glijdende staafkamers, roterende trommels, orbitale shakers, enz.) gerapporteerd voor het induceren van slaaptekort bij muizen om de effecten ervan op de gezondheid te onderzoeken. De huidige studie introduceert een alternatieve methode voor slaaptekort bij muizen. Er is een geautomatiseerd apparaat op het rockerplatform ontworpen dat kosteneffectief is en de slaap efficiënt verstoort bij muizen in groepshuisvesting met instelbare tijdsintervallen. Dit apparaat induceert karakteristieke veranderingen van slaaptekort met minimale stressrespons. Bijgevolg kan deze methode nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de effecten en onderliggende mechanismen van slaaptekort op de pathogenese van meerdere ziekten. Bovendien biedt het een kosteneffectieve oplossing, vooral wanneer er meerdere slaapdeprivatie-apparaten parallel moeten werken.
Inleiding
Verstoring van het circadiane ritme verwijst naar de desynchronisatie tussen de externe omgeving of het gedrag en de endogene biologische klok. Een van de meest voorkomende oorzaken van verstoring van het circadiane ritme is slaaptekort1. Slaaptekort heeft niet alleen een negatieve invloed op de menselijke gezondheid, maar verhoogt ook aanzienlijk het risico op vele ziekten, waaronder kanker2 en hart- en vaatziekten3. De mechanismen die ten grondslag liggen aan de schadelijke effecten van slaaptekort blijven echter grotendeels onbekend, en het opstellen van modellen voor slaaptekort is essentieel om ons begrip in dit opzicht te vergroten.
Er zijn verschillende methoden voor slaaptekort bij muizen gemeld, zoals het gebruik van waterplatforms4, zachte behandeling5, schuifstangkamers6, roterende trommels7 en kooiagitatieprotocollen 5,8,9. Schuifstangkamers vegen automatisch tralies over de bodem van de kooi, waardoor de muizen eroverheen moeten lopen en wakker moeten blijven. Protocollen voor het agiteren van kooien omvatten het plaatsen van kooien op orbitale shakers in het laboratorium, wat resulteert in een efficiënte slaapverstoring. Hoewel deze methoden automatisch en effectief zijn, kunnen ze duur zijn wanneer meerdere apparaten parallel moeten worden uitgevoerd, vooral voor specifieke onderzoeksontwerpen waarbij een groot aantal muizen met slaaptekort betrokken is die nodig zijn voor circadiane genprofilering. Aan de andere kant zijn waterplatforms en zachte behandelingsprotocollen goedkopere en eenvoudigere methoden die vaak worden gebruikt om slaaptekort op te wekken. Het waterplatform staat echter geen automatische controle toe van vooraf gespecificeerde deprivatie-rustcycli10,11, en een zachte behandeling vereist voortdurende waakzaamheid van de onderzoekers om de slaap te verstoren. Bovendien kunnen andere modaliteiten, zoals roterende vaten, worden verward door sociaal isolement of stress12.
Geïnspireerd door de orbitale shaker-gebaseerde methode, willen we een protocol introduceren voor het opzetten van een rocker-platform-gebaseerd apparaat voor slaaptekort bij muizen. Deze methode is goedkoop, effectief, minimaal stressvol, controleerbaar en geautomatiseerd. Het huidige protocol stelt ons in staat om een op het rockerplatform gebaseerd apparaat te maken tegen een prijs die ongeveer tien keer goedkoper is dan die van orbitale shakers, op basis van onze toegankelijkheid. Dit apparaat verstoorde effectief de slaap bij muizen in groepshuisvesting en induceerde karakteristieke veranderingen van slaaptekort met minimale stressrespons. Het zal vooral nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het onderzoeken van de effecten en onderliggende mechanismen van slaaptekort op de pathogenese van meerdere ziekten, vooral wanneer de studie parallel slaaptekort met meerdere groepen omvat.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierexperimentele protocollen in deze studie zijn goedgekeurd door de Laboratory Animal Welfare Ethics Committee van Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University. Mannelijke C57BL/6J-muizen, in de leeftijd van 8 tot 10 weken, werden in het onderzoek gebruikt. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel). De belangrijkste onderdelen die nodig zijn voor het opzetten van het apparaat worden vermeld in figuur 1A.
1. Voorbereiding van het slaapdeprivatieapparaat
- Zet het ene uiteinde van een stalen sleufkanaal van 50 cm vast in het midden van een stalen kanaal met sleuven van 40 cm met schroeven (zie Materiaaltabel) om een T-vormige structuur te maken; herhaal het proces en maak twee van dergelijke T-vormige structuren (Figuur 1B-a).
- Laat de twee T-vormige constructies evenwijdig 30 cm uit elkaar staan en verbind de onderkant van de twee T-vormige constructies met een 30 cm schroefcompatibele stalen cilinder (zie Materiaaltabel) met schroeven (Figuur 1B-b).
- Plaats een stalen rechthoekig platform (20 × 25 cm) (zie Materiaaltabel) tussen de twee T-vormige structuren (Figuur 1B-c).
NOTITIE: Als er geen kant-en-klare stalen rechthoekige platforms van de gespecificeerde maat beschikbaar zijn, kan men er een maken door 2 mm dik plat staal te lassen. - Bevestig elk uiteinde van een schroefcompatibele stalen cilinder van 30 cm die in het platform is bevestigd aan twee lagers die op elk van de T-vormige constructies zijn bevestigd op 10 cm van boven (Figuur 1B-d).
- Bevestig een motorsteun (zie Materiaaltabel) op een van de T-vormige constructies op 25 cm van bovenaf met schroeven (Figuur 1B-e).
NOTITIE: Als alternatief kan constructielijm worden gebruikt om de motorsteun op de T-vormige structuur te bevestigen in plaats van op bemanningen. - Installeer een motor (zie Materiaaltabel) op de motorsteun met schroeven (Figuur 1B-f).
- Bevestig een koelventilator (zie Materiaaltabel) met zelfborgende banden op de T-vormige structuur onder de motor (Figuur 1B-g).
- Bevestig het lageruiteinde van een drijfstang met schroeven aan een platformhoek die naar de motor is gericht (Figuur 1B-h).
- Bevestig een ander uiteinde van de drijfstang aan de as van de motor met schroeven (Figuur 1B-i).
- Boor met een elektrische boormachine twee gaten van 4 mm op elk van de vier hoeken van een plastic bak of standaard dierenkooi (zie Materiaaltabel) en boor twee gaten van 4 mm en een onderste gat van 6 mm aan de linkerkant van de kooi (Figuur 1B-j).
- Zet de kooi vast op het rechthoekige platform met zelfsluitende banden door de hoekgaten (Figuur 1B-k).
- Boor met een elektrische boor een gat van 5 mm in de dop van een centrifugebuis van 50 ml en sluit het gat af met een lang mondstuk dat is uitgerust met een kogelkraan om waterlekkage te voorkomen.
OPMERKING: Hydrogel zou een alternatieve optie zijn voor watervoorziening als het aanpassen van waterflessen moeilijk is. - Zet de op maat gemaakte waterfles aan de linkerkant van de kooi vast met behulp van zelfsluitende banden door de twee gaten van 4 mm, waarbij het mondstuk door het gat van 6 mm gaat (Figuur 1B-l).
- Sluit de elektrische uitgangsdraden van de voedingssteenadapter aan op de twee klemmen van de motor (Figuur 1B-l).
NOTITIE: Er is geen specifieke polariteitsvereiste voor het aansluiten van de draden op de motorklemmen. - Sluit de elektrische ingangsdraden van de power brick-adapter aan op de tijdschakelaar (Figuur 1B-m).
2. Inductie van slaaptekort
- Druk op de meest rechtse plustekenknoppen op respectievelijk de linker- en rechterhelft van de tijdschakelaar (zie Materiaaltabel) totdat "M" verschijnt op de mechanische tellers aan beide zijden (Figuur 1C-a).
- Druk op de middelste plustekenknoppen op de linker- en rechterhelft van de tijdschakelaar totdat "5M" verschijnt op de mechanische tellers aan beide zijden (Figuur 1C-b).
- Druk op de meest linkse plustekenknop op de linkerhelft van de tijdschakelaar totdat "15M" verschijnt op de linker mechanische teller (Figuur 1C-c).
NOTITIE: De tijdschakelaar is dan 15 minuten aan en 5 minuten uitgeschakeld in een cyclische modus. - Zet muizen ad libitum in de kooi met water en voedsel.
- Voorzie de tijdschakelaar en de koelventilator van stroom.
OPMERKING: Het platform schommelt nu met 10 tpm. - Weeg elke muis elke dag op Zeitgeber tijd 0 (ZT0).
NOTITIE: Het licht brandt van 8 uur (ZT0) tot 8 uur (ZT12).
3. Orale glucosetolerantietest
- Meet de nuchtere glucosespiegels bij nuchtere muizen door bloed uit staartaderen te bemonsteren.
- Injecteer glucoseoplossing intraperitoneaal in elke muis (2 g/kg lichaamsgewicht) met behulp van spuiten van 1 ml.
- Verzamel bloedmonsters via de staartader en test de bloedglucose respectievelijk 15 min, 30 min, 60 min en 120 min na glucose-injectie.
- Zet de muizen na de test ad libitum terug in de kooi met het voer en water.
4. Het oogsten van de hersenweefsels
- Onthoofd de muizen na adequate anesthesie door ze gedurende 3-5 minuten bloot te stellen aan isofluraan (2%).
- Leg de schedel bloot en maak een verticale snede van 1 cm bij de schedel met een chirurgische schaar.
- Verwijder de schedel met behulp van muggenhemostaten (zie Materiaaltabel) om het hersenweefsel bloot te leggen.
- Beweeg voorzichtig de hele hersenen uit de schedelholte met behulp van een gebogen pincet.
OPMERKING: Hersenweefsel moet worden verwijderd volgens het lokale beleid. - Was het hersenweefsel met koude, fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS, 4 °C).
- Vries het intacte hersenweefsel snel in vloeibare stikstof in en breng het weefsel over naar -80 °C voor langdurige opslag.
OPMERKING: Bij opslag bij -80°C is het snel ingevroren hersenweefsel minimaal 6 maanden stabiel.
5. Detectie van genexpressie door polymerasekettingreactie (PCR)
- Ontdooi de hersenweefsels bij 4 °C of op ijs.
- Breng het weefsel over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en extraheer het totale RNA met behulp van de op TRIzol gebaseerde methode13.
- Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer (zie Materiaaltabel) na RNA-extractie.
- Voer omgekeerde transcriptie uit van het totale RNA (1 μg) in complementair DNA (cDNA) met behulp van een commerciële kit14.
- Meet genexpressieniveaus door real-time reverse transcriptie polymerasekettingreactie15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het gevestigde apparaat voor slaaptekort bij muizen is weergegeven in figuur 1D. Op dag 7 na het begin van het slaaptekort gaven elektro-encefalogram (EEG) en elektromyografie (EMG) monitoring16 aan dat het apparaat de slaapduur aanzienlijk verkortte en de waakzaamheid bij muizen verlengde (Figuur 2A-D). Ondertussen verhoogde het huidige protocol de opbouw van adenosine en de mRNA-niveaus van Homer1a<...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Muismodellen van slaaptekort zijn essentieel voor het bestuderen van de effecten van slaapverstoring op verschillende ziekten, waaronder hart- en vaatziekten21, psychiatrische aandoeningen22 en neurologische aandoeningen23. Van de bestaande strategieën voor slaaptekort bij muizen worden fysieke benaderingen waarbij de slaap op korte termijn herhaaldelijk wordt onderbroken het meest gebruikt 5,7,12<...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82230014, 81930007, 82270342), het Shanghai Outstanding Academic Leaders Program (18XD1402400), de Science and Technology Commission van de gemeente Shanghai (22QA1405400, 201409005200, 20YF1426100), Shanghai Pujiang Talent Program (2020PJD030), SHWSRS (2023-62), Shanghai Clinical Research Center for Aging and Medicine (19MC1910500) en Postgraduate Innovation Program van Bengbu Medical College (Byycxz21075).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 50 mL centrifuge tube | NEST | 602002 | |
| Adenosine ELISA kit | Ruifan technology | RF8885 | |
| Animal cage | ZeYa tech | MJ2 | |
| Blood glucose meter | YuYue | 580 | |
| C57BL/6J Mice | JieSiJie Laboratory Animal | N/A | Leeftijd: 8-10 weken |
| Connecting rod | ShengXiang Tech | N/A | Lengte: 20 cm |
| Cooling fan | LiMing | EFB0805VH | Voedingsspanning: 5 V; Stroomverbruik: 1,2 W; Luchtstroom: 26,92 cfm; Afmetingen: 40 mm * 40 mm * 56 mm |
| Corticosterone ELISA kit | Elabscience | E-OSEL-M0001 | |
| EEG/EMG opname- en analysesysteem | Pinnacle Technology | 8200-K1-iSE3 | |
| Isoflurane | RWD | 20071302 | |
| mosquito hemostats | FST | 13011-12 | Chirurgisch instrument |
| Motor en motorbevestiging | MingYang | MY36GP-555 | Voedingsspanning: 24 V dc; Schachtdiameter: 8 mm; Maximaal uitgangsmoment: 100 Kgf.cm; Maximale uitgangssnelheid: 10 tpm |
| NanoDrop 2000c | Thermo Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Power brick adapter | MingYang | QiYe-0243 | Ingangsspanning: 110-220V ac; Uitgangsspanning: 24 V dc; Uitgangsstroom: 2 A; Kabellengte: 2 m |
| qPCR commercieel kit | Vazyme | Q711-02 | |
| qPCR meetapparatuur | Roche | 480 | |
| Rechthoekig platform bevestigd met een schroef-compatibel stalen cilinder | Aangepast | N/A | Breedte: 20 cm; lengte: 25 cm; lengte van de cilinder: 30 cm, dikte: 2 mm |
| Reverse RNA naar cDNA commercieel kit | Vazyme | R323-01 | |
| Schroef en moer | Guwanji | N/A | Binnendiameter: 6 mm, 12 mm |
| Schroef-compatibel stalen cilinder | Aangepast | N/A | Lengte: 300 mm |
| Gespleten stalen kanalen | Aangepast | N/A | Lengte: 400 mm of 500 mm, dikte: 2 mm |
| Tijdcontactor | LiXiang | DH48S-S | Voedingsspanning: 110-220 V ac; Gemeten eenheden: uur, minuten, seconden; Contactconfiguratie: DPDT |
| TRIzol | Vazyme | R401-01 |
Referenties
- Yang, D. F., et al. Acute sleep deprivation exacerbates systemic inflammation and psychiatry disorders through gut microbiota dysbiosis and disruption of circadian rhythms. Microbiological Research. 268, 127292(2023).
- Alanazi, M. T., Alanazi, N. T., Alfadeel, M. A., Bugis, B. A. Sleep deprivation and quality of life among uterine cancer survivors: systematic review. Supportive Care In Cancer : Official Journal of the Multinational Association of Supportive Care In Cancer. 30 (3), 2891-2900 (2022).
- Tobaldini, E., et al. Sleep, sleep deprivation, autonomic nervous system and cardiovascular diseases. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 74, 321-329 (2017).
- Arthaud, S., et al. Paradoxical (REM) sleep deprivation in mice using the small-platforms-over-water method: polysomnographic analyses and melanin-concentrating hormone and hypocretin/orexin neuronal activation before, during and after deprivation. Journal of Sleep Research. 24 (3), 309-319 (2015).
- Saré, R. M., et al. Chronic sleep restriction in developing male mice results in long lasting behavior impairments. Frontiers In Behavioral Neuroscience. 13, 90(2019).
- Roman, V., Vander Borght, K., Leemburg, S. A., Vander Zee, E. A., Meerlo, P. Sleep restriction by forced activity reduces hippocampal cell proliferation. Brain Research. 1065 (1-2), 53-59 (2005).
- Zhao, H. Y., et al. Chronic sleep restriction induces cognitive deficits and cortical beta-amyloid deposition in mice via BACE1-antisense activation. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (3), 233-240 (2017).
- Lord, J. S., et al. Early life sleep disruption potentiates lasting sex-specific changes in behavior in genetically vulnerable Shank3 heterozygous autism model mice. Molecular Autism. 13 (1), 35(2022).
- Sinton, C. M., Kovakkattu, D., Friese, R. S. Validation of a novel method to interrupt sleep in the mouse. Journal of Neuroscience Methods. 184 (1), 71-78 (2009).
- Rotenberg, V. S. Sleep after immobilization stress and sleep deprivation: common features and theoretical integration. Critical Reviews in Neurobiology. 14 (3-4), 225-231 (2000).
- Kim, T. K., et al. Melatonin modulates adiponectin expression on murine colitis with sleep deprivation. World Journal of Gastroenterology. 22 (33), 7559(2016).
- Barf, R. P., Scheurink, A. J. Sleep disturbances and glucose homeostasis. European Endocrinology. 7, 14-18 (2011).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
- Libus, J., Štorchová, H. Quantification of cDNA generated by reverse transcription of total RNA provides a simple alternative tool for quantitative RT-PCR normalization. Biotechniques. 41 (2), 156-164 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nature Protocols. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Mang, G. M., et al. Evaluation of a piezoelectric system as an alternative to electroencephalogram/electromyogram recordings in mouse sleep studies. Sleep. 37 (8), 1383-1392 (2014).
- Maret, S., et al. Homer1a is a core brain molecular correlate of sleep loss. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (50), 20090-20095 (2007).
- Li, K., et al. Olfactory deprivation hastens Alzheimer-like pathologies in a human tau-overexpressed mouse model via activation of cdk5. Molecular neurobiology. 53, 391-401 (2016).
- Sousa, M. E., et al. Invariant Natural Killer T cells resilience to paradoxical sleep deprivation-associated stress. Brain, Behavior, and Immunity. 90, 208-215 (2020).
- Zhao, Y., et al. Disruption of circadian rhythms by shift work exacerbates reperfusion injury in myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 79 (21), 2097-2115 (2022).
- Miller, M. A., Cappuccio, F. P. Inflammation, sleep, obesity and cardiovascular disease. Current Vascular Pharmacology. 5 (2), 93-102 (2007).
- Minkel, J., et al. Sleep deprivation potentiates HPA axis stress reactivity in healthy adults. Health Psychology. 33 (11), 1430(2014).
- Bishir, M., et al. Sleep deprivation and neurological disorders. BioMed Research International. 2020, 5764017(2020).
- Franken, P., Tobler, I., Borbély, A. A. Cortical temperature and EEG slow-wave activity in the rat: analysis of vigilance state related changes. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 420 (5-6), 500-507 (1992).
- Li, Y., et al. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response. Sleep. 37 (1), 51-64 (2014).
- Jones, C. E., et al. Early-life sleep disruption increases parvalbumin in primary somatosensory cortex and impairs social bonding in prairie voles. Science Advances. 5 (1), (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
