Methodenartikel

Immunocytochemische visualisatie van eiwitten van cyanobacteriële cellen met hoge autofluorescentie van fycoerythrine en phycourobiline

DOI:

10.3791/65168

⸱

15 september 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Microbiology, The Czech Academy of Sciences, 2Japan Fisheries Research and Education Agency, 3National Marine Fisheries Research Institute, 4Graduate School of Bioagricultural Sciences, Nagoya University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst de visualisatie en kwantificering van een bepaald eiwit in cellen op cellulair niveau voor de fycoerythrin-bevattende cyanobacterie, Crocosphaera watsonii.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gepresenteerd wordt een protocol voor het visualiseren en kwantificeren van een specifiek eiwit in cellen op cellulair niveau voor de mariene cyanobacterie Crocosphaera watsonii, een cruciale primaire producent en stikstofbinder in oligotrofe oceanen. Een van de uitdagingen voor mariene autotrofe N2-fixers (diazotrofen) is het onderscheiden van van sonde afgeleide fluorescentiesignalen van autofluorescentie. C. watsonii werd geselecteerd om chlorofyl-, fycoerythrin- en phycourobiline-bevattende cyanobacteriën te vertegenwoordigen. Het protocol maakt een eenvoudige en semi-kwantitatieve visualisatie van eiwitten in C. watsonii op eencellig niveau mogelijk, waardoor onderzoek naar eiwitproductie onder verschillende omgevingsomstandigheden mogelijk is om de metabolische activiteiten van de doelcyanobacteriën te evalueren. Bovendien zijn de fixatie- en permeabilisatiemethoden geoptimaliseerd om de fluorescentiesignalen van doeleiwitten te verbeteren om ze te onderscheiden van autofluorescentie, vooral van fycoerythrine en fycourobiline. Het verbeterde signaal kan worden gevisualiseerd met behulp van confocale of breedveldfluorescentiemicroscopie. Bovendien werd de fluorescentie-intensiteit semi-gekwantificeerd met behulp van Fiji-software. Deze workflow voor analyse van één cel maakt de evaluatie van cel-tot-cel variaties van specifieke eiwitinhoud mogelijk. Het protocol kan in elk biowetenschappelijk laboratorium worden uitgevoerd, omdat het alleen standaardapparatuur vereist en ook gemakkelijk kan worden aangepast aan andere fycoerythrin-bevattende cyanobacteriële cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De fysiologische variatie van cel tot cel (gewoonlijk "heterogeniteit" genoemd) in metabolische activiteiten binnen micro-organismen, waaronder cyanobacteriën, is gedocumenteerd door middel van studies op kloonculturen 1,2,3,4. Deze heterogeniteit omvat diverse metabolische activiteiten zoals celdeling5, koolstofassimilatie 6,7,8 en stikstofassimilatie 9,10. Recent onderzoek heeft bijvoorbeeld aangetoond dat N 2-fixatieactiviteit in koloniale cyanobacteriën C. watsonii en C. subtropica (Cyanothece) variabiliteit op celniveau vertoont, waarbij het aanwezig is in subpopulaties van cellen terwijl het afwezig is in andere binnen de gemeenschap. Met name de stikstofopname of N 2-fixatieactiviteiten vertonen ook variabiliteit tussen cellen in situ11,12,13. Deze bevindingen zijn onderbouwd door stabiele 15N isotopenanalyses uitgevoerd met isotopenverhouding massaspectrometers (NanoSIMS)14,15. Ondanks dat NanoSIMS een nieuwe manier biedt om de isotopensamenstelling op individueel celniveau te analyseren, blijft het gebruik ervan beperkt vanwege de technische complexiteit en kosten.

Een alternatieve benadering om intracellulaire heterogeniteit in metabole activiteiten te observeren, is door middel van immunodetectie. Eerdere rapporten hebben de immunodetectie van nitrogenase in individuele cellen aangetoond, maar dit brengt uitdagingen met zich mee vanwege de autofluorescentie die wordt uitgezonden door hun fotosynthetische pigmenten 16,17,18. Mariene cyanobacteriën, met name die welke zijn aangepast aan oceanische wateren zoals de grote oceanische diazotrofen C. watsonii en Trichodesmium, bevatten aanzienlijke hoeveelheden phycobilines die autofluorescentie uitzenden in kortere golflengten: phycoerythrin en phycourobilin19. Om deze autofluorescentie te omzeilen, hebben blauwemitterende fluorochromen met UV-excitatie de voorkeur gekregen voor studies naar cyanobacteriën 16,20,21. Deze strategie heeft echter niet consequent succes opgeleverd, aangezien cellen die uitsluitend met primaire antilichamen werden behandeld, sterke blauwe tot blauwgele autofluorescentie uitzonden onder UV-excitatie20,21. Er zijn inspanningen geleverd om dit probleem te verminderen door cellen voorafgaand aan observatie bloot te stellen aan blauw of UV-licht en door halfgeleidende nanokristallente gebruiken 22. De huidige studie maakt gebruik van een andere strategie die eiwitfluorescentiesignalen verbetert met behulp van het tyramide-signaalversterkingssysteem (TSA) om eiwitten met een lage cellulaire inhoud te visualiseren.

TSA, ook bekend als gekatalyseerde reporterdepositie (CARD), is een zeer gevoelige enzymatische methode die de detectie van doelen met een lage abundantie in immunocytochemie mogelijk maakt. Deze techniek maakt gebruik van de katalytische activiteit van peroxidase om covalent gelabeld tyramide af te zetten in de nabijheid van doeleiwitten in situ23,24. In aanwezigheid van waterstofperoxide katalyseert peroxidase de oxidatieve condensatie van tyramide tot reactieve tyramideradicalen, die zich vervolgens binden aan elektronenrijke delen zoals tyrosine, fenylalanine en tryptofaan25. Dit verbetert signalen tot 10 tot 200 keer in vergelijking met standaardmethoden, waardoor het signaal detecteerbaar is via standaard chromogene of fluorescerende technieken. Bijgevolg vergemakkelijkt deze techniek de snelle en gelijktijdige beoordeling van meerdere eiwitten naast fenotypische markers in heterogene populaties en subsets van zeldzame cellen. Met name is de samensmelting van immunolabeling- en TSA-systemen voor cyanobacteriën tot nu toe beperkt tot een enkele studie die saxitoxine visualiseerde in Cylindrospermopsis raciborskii26.

De hierin beschreven methode maakt het mogelijk om de eiwitproductie onder verschillende omgevingsomstandigheden op eencellig niveau te onderzoeken, waardoor de metabolische activiteiten in doelcyanobacteriën kunnen worden beoordeeld. De beschikbaarheid van detectie van immunofluorescentie-eiwitten van hele cellen maakt een snelle en semi-kwantitatieve visualisatie van eiwitten in C. watsonii op eencellig niveau mogelijk. Bovendien kan deze methode gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met andere cyanobacteriële cellen die phycourobiline en phycoerythrin bevatten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Teelt van cyanobacteriën

  1. Kweek Crocosphaera watsonii PS0609-cellen in erlenmeyers of fotobioreactoren in YBCI-medium27. Om de kweekdichtheid te bepalen, meet u de celdichtheid met behulp van een methode naar keuze (bijv. microscopie, flowcytometrie, celteller, enz.).
  2. Houd de celdichtheden tussen ~1 × 104 tot ~5 × 106 cellen ml-1.

2. Bereiding van de reagentia

  1. Bewaar 100% methanol bij -20 °C.
  2. Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS): Los 1,36 g KH2PO4, 1,42 g Na2HPO4, 8,0 g NaCl en 0,224 g KCl op in 0,8 l gedestilleerd water, vul tot 1 l, pas de pH aan op 7,4 en autoclaaf (zie materiaaltabel).
  3. 1% paraformaldehyde (PFA) in PBS
    1. Voeg 50 ml PBS toe aan een glazen bekerglas op een roerplaat in een geventileerde kap, verwarm het tot 60 °C en meng met een roerder.
    2. Breng 0,5 g paraformaldehydepoeder toe aan de verwarmde PBS-oplossing. Verhoog geleidelijk de pH door 1 N NaOH druppelsgewijs uit een pipet te druppelen totdat de oplossing transparant wordt.Nadat het paraformaldehyde volledig is opgelost, verlaagt u de temperatuur en gaat u verder met het filteren van de oplossing.
    3. Stel het volume van de oplossing in op 40 ml met PBS. Pas de pH met kleine hoeveelheden verdund HCl aan tot ongeveer 6,9. Bewaar de oplossing bij -20 °C.
  4. PBG-blokkerende oplossing (0,2% gelatine + 0,5% runderserumalbumine; BSA, zie materiaaltabel)
    1. Los 0,2 g gelatine en 0,5 g BSA op in 100 ml PBS in een glazen bekerglas van 200 ml. Verwarm het mengsel tot 60 °C en roer. Doe het vervolgens in een tube van 15 ml en bewaar het bij -20 °C.
  5. 0,2% Triton X-100 in PBS: Voeg 20 μL Triton X-100 toe aan 10 ml PBS. Bereid het in een tube van 15 ml en bewaar het bij -20 °C.
  6. 0,5 M EDTA: Los 1,46 g EDTA op in 10 ml gedestilleerd water (DW) en stel de pH in op 8,0 (EDTA lost niet op in pH < 8,0). Bereid het in een tube van 15 ml en bewaar het bij -20 °C.
  7. 1 M Tris HCl: Los 1,58 g Tris HCl op in 10 ml DW en stel de pH in op 8,0. Bereid het in een tube van 15 ml en bewaar het bij -20 °C.
  8. 50 mM Tris HCl: Los 0,079 g Tris HCl op in 10 ml DW en stel de pH in op 7,0. Bereid het in een tube van 15 ml en bewaar het bij -20 °C.
  9. Voeg 10 mg/ml lysozym toe: Voeg 100 mg lysozym, 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8) en 1 ml 1 M Tris HCl (pH 8) toe. Voeg DW tot 10 ml toe aan een tube van 15 ml. Bereid het vers op de dag van gebruik.
  10. 10.000 eenheden/ml achromopeptidase: Los 0,011 g van 900 eenheden/mg achromopeptidase (zie materiaaltabel) op in 1 ml DW, meng goed en bewaar bij -20 °C.
  11. 60 eenheden/ml achromopeptidase werkoplossing: Voeg 3 μL van 10.000 eenheden/ml achromopeptidase toe aan 0,5 ml 50 mM Tris HCl. Bereid het vers op de dag van gebruik.
  12. Bereid 100x tyramide stockoplossing: Los het tyramidereagens op in 150 μL dimethylsulfoxide (DMSO). Bewaren bij 2-8 °C gedurende maximaal 6 maanden.
  13. 1x Reactiebuffer: Voeg 1 druppel 20x Reactiebuffer toe aan 1 ml DW. Deze kan worden vervangen door Tris-buffer, pH 7,4.
  14. Oplossingen voor reactiestop reagens
    1. Voorraadoplossing voor reactiestopreagens: Voeg 1,45 ml 95% ethanol toe aan één injectieflacon met reactiestopreagens in de tyramidesignaalversterkingskit (zie materiaaltabel). Bewaren bij -20 °C gedurende 6 maanden
    2. Werkingsoplossing van het reactiestopreagens: verdun de voorraadoplossing van het reactiestopreagens (1:11) in PBS. Bereid het vers op de dag van gebruik.
  15. 100x H2O2 oplossing: Voeg 1 druppel (ongeveer 50 μL) H2O2 toe aan 1 ml DW. Bereid het vers op de dag van gebruik.
  16. Tyramide werkoplossing (voor een eindvolume van 510 μl): Voeg 5 μl 100x tyramidestockoplossing, 5 μl 100x H2O2-oplossing en 500 μl 1x reactiebuffer toe aan de buis van 1,5 ml in de aangegeven volgorde en meng voorzichtig goed door te pipetteren. Bereid het vers op de dag van gebruik.

3. Cellen oogsten

  1. Oogst 10 ml C. watsonii-cultuur in een buis van 15 ml, verzamel cellen door centrifugatie bij 5.500 × g bij 4 °C gedurende 8 minuten en gooi het bovenstaande weg. Bewaar de monsters tussen de ingrepen door op ijs.
  2. Resuspendeer de pellet met het resterende supernatant, breng het geresuspendeerde submonster over in een buis van 1,5 ml en voeg 1 ml PBS toe aan de was. Verzamel cellen door centrifugatie (5.500 × g, 4 °C, 5 min) en gooi het supernatant weg.

4. Fixatie en behoud van cellen

  1. Voeg 1 ml 1% PFA-oplossing toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Centrifugeer de cellen bij 5.500 × g, 4 °C, 5 min, verwijder het bovenstaande met een pipet en gooi het weg in de toegewezen chemische afvalbak, voeg 1 ml PBS toe en suspendeer het opnieuw.
  3. Centrifugeer de cellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), verwijder het bovenstaande door te pipetteren en gooi het weg. Voeg 1 ml 100% methanol toe (bewaard bij -20 °C) en suspendeer opnieuw met behulp van een vortexmixer. Bewaar de subsamples gedurende 15 minuten tot een nacht bij -20 °C.

5. Permeabilisatie en blokkering

  1. Centrifugeer de cellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), verwijder het bovenstaande (methanol) met een pipet en gooi het weg in de toegewezen chemische afvalbak, voeg 1 ml PBS toe en suspendeer het opnieuw.
  2. Centrifugeer de cellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), verwijder het bovenstaande met een pipet en gooi het weg, voeg 1 ml 0,2% Triton X-100 toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Centrifugeer de cellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), verwijder het Triton X-100-supernatans met een pipet en gooi het weg, voeg 1 ml PBS toe en suspendeer het opnieuw.
  4. Centrifugeer de cellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), verwijder het bovenstaande met een pipet, voeg 0,5 ml lysozym (zie materiaaltabel) en 0,5 ml PBG (stap 2.4) toe en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.
  5. Centrifugeer de cellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), verwijder het bovenstaande voorzichtig met behulp van een pipet en gooi het weg in een daarvoor bestemde afvalbak, voeg 0,5 ml 60 eenheden achromopeptidase (stap 2.10) en 0,5 ml PBG toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  6. Centrifugeer de cellen (5.500 × g, 4 °C, 5 min), verwijder het achromopeptidase-supernatans met behulp van een pipet, gooi het weg in de toegewezen afvalbak en voeg de benodigde hoeveelheid PBS toe.
    OPMERKING: De benodigde hoeveelheid moet worden bepaald door het aantal submonsters dat moet worden waargenomen (één submonster is 90 μL voor een cirkel met een diameter van ~2 cm). Zorg ervoor dat negatieve controle(s) worden voorbereid; zonder 1st of 2e antilichaam, en zonder 1st antilichaam.

6. Voorbereiding van monsters voor beeldvorming

  1. Leg de monsters op een glasplaatje en voeg het 1e antilichaam28 toe.
    1. Teken twee cirkels met een diameter van ongeveer ~2 cm op een met polylysine gecoat diaglas met een vloeistofafstotende diamarkeerstift (zie Materiaaltabel). Breng 90 μL subsamples aan op de cirkels. Droog het aangebrachte deelmonster in een chemische kap. Het duurt ongeveer 30-60 minuten.
    2. Rehydrateer het submonster en was het met 90 μL PBS, incubeer gedurende 2 minuten en gooi de PBS weg. Herhaal de stappen 2 keer.
    3. Verdun het 1eantilichaam 28 (1 mg ml-1) 200 keer in PBG-blokkerende oplossing. Pas de hoeveelheid oplossing aan afhankelijk van het aantal monsters.
      1. Breng 90 μL primair (1st) antilichaam28 aan op elk submonster, behalve de negatieve controle. Leg gedestilleerd, waternat tissuepapier in een kamer, sluit het af met een deksel en wikkel het in met enttape. Incubeer een nacht bij 4 °C.
  2. Breng 2e antilichaam aan.
    1. Verwijder het teveel aan 1st antilichaam door het glasplaatje op zijn lange zijde op tissuepapier te laten staan, draai het om de cellen omhoog te brengen en voeg 0,2% Triton X-100 toe aan elke cirkel met behulp van een pipet en incubeer 2 minuten om de cellen te spoelen. Herhaal 5 keer.
    2. Breng voorzichtig poly-mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd secundair (2e) antilichaam (geit, anti-konijn IgG) aan (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Spoel de cellen voorzichtig met PBS gedurende 10 minuten; Herhaal 3 keer.
  3. Tyramide signaalversterking
    1. Voeg 90 μL tyramide werkoplossing toe aan de monsters en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de oplossing weg door de glasplaat aan de lange zijde op een papieren zakdoekje te laten staan. Voeg 90 μl reactiestopreagens toe en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Gooi de oplossing weg.
      OPMERKING: De incubatietijd moet worden getest voor elk doeleiwit of voor elke microscoop. De incubatietijd kan worden verkort, of de stap kan worden weggelaten om de eiwittoewijzing te observeren met behulp van een confocale microscoop om oververzadiging van het signaal te voorkomen.
  4. Spoel de cellen elke 30 minuten (5 keer) met PBS. Spoel de cellen af met DW. Verwijder het water snel. Voeg een druppel montagemedium toe (zie Materiaaltabel) en plaats het afdekglas.
  5. Druk voorzichtig op het afdekglas om het overtollige montagemedium te verwijderen en laat het ongeveer 30 minuten drogen. Sluit het af met transparante nagellak en bewaar het in het donker.

7. Detectie van fluorescentiesignaal met behulp van een fluorescentiemicroscoop

  1. Schakel de fluorescentiemicroscoop, computer en UV-lichtbron in. Open de software voor de camera die op de microscoop is aangesloten (zie Materiaaltabel). Ingesteld om live-beelden te monitoren. Doe het licht in de kamer uit.
    1. Plaats het glasplaatje met de cellen op de objecttafel van het monster. Gebruik de lens met de kleinste vergroting en pas het objectief en de condensorlens aan om de scherpstelling te verfijnen. Vervang de lens één voor één naar grotere vergrotingen.
    2. Doe onderdompelingsolie op het dekglas en vervang de lens door de 100x lens voor olie-onderdompeling. Bedek de lichtbron vanaf de lichtbron, selecteer de DAPI-filterset voor Tyramide-350-analyse en open de sluiter voor excitatie UV-licht.
    3. Test 3-4 belichtingstijden en bepaal de beste belichtingstijd zonder oververzadiging. Selecteer de FITC-filterset voor fycoerythrin-observatie, herhaal de procedure en bepaal de beste belichtingstijd. Overweeg om een verhoogde versterkings- of binning-modus op de camera te gebruiken om de procedure te versnellen en signaaldegradatie als gevolg van fototoxiciteit te verminderen. Stel de versterkings- en binning-modus terug voor beeldacquisitie.
  2. Selecteer het gezichtsveld, maak een momentopname voor een helder veldbeeld, tyramide-afbeelding en phycoerythrin-afbeelding met de geselecteerde belichtingstijd voor elke afbeelding.

8. Detectie onder een confocale microscoop

  1. Schakel de confocale microscoop en computer in en start de microscopiesoftware. Verwarm de laser gedurende 60 minuten. Doe het licht in de kamer uit. Plaats het glasplaatje met de cellen op de objecttafel met behulp van dompelolie op een objectieflens.
  2. Selecteer de 405 nm-laser en stel de hoofdstraalsplitsers (MBS) in op 405. Stel het laservermogen in op 0,5%. Stel de meetparameters in om een pixelgrootte van 0,03 μm te verkrijgen, zoom 10 (beeldgrootte 512 x 512 pixels). Stel de verblijftijd van de pixel in op 0,02 ms, wat de totale scantijd op 5,06 s geeft.
  3. Stel het detectorbereik in van 410 nm tot 695 nm op de GaAsP spectrale detector die een spectrale resolutie van 9 nm mogelijk maakt. Stel de optimale versterking in (800-900). Start de lambdascan.
    OPMERKING: De optimale versterking moet voor elke microscoop worden geoptimaliseerd.

9. Kwantificeer de intensiteit van het signaal met behulp van Fiji

  1. Open het beeld dat is vastgelegd met het DAPI-filter onder de fluorescentiemicroscoop. Selecteer cellen in de afbeelding van het heldere veld en definieer het interessegebied (ROI). Nadat u de ROI voor alle cellen hebt gedefinieerd, slaat u de ROI op.
  2. Sluit het helderveldbeeld en open het fluorescentiebeeld. Scheid het RGB-beeld in rood, blauw en groen om het Tyramide-350-signaal te extraheren.
  3. Pas ROI toe die is voorbereid door een helderveldbeeld op een blauw beeld en meet de intensiteit van het signaal29. Sla de resultaten op.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het fluorescentiesignaal werd waargenomen van extracellulaire stoffen in de negatieve controle, waarbij het 1eantilichaam niet werd gebruikt (Figuur 1A-C). Het fluorescentiesignaal van het met tyramide versterkte reagens, geconjugeerd aan de grote subeenheid van het Rubisco-eiwit (RbcL), werd met succes gedetecteerd in C. watsonii onder een fluorescentiemicroscoop met behulp van een DAPI-filter met UV-exc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor cyanobacteriën is het TSA-systeem wijdverbreid gebruikt in TSA-fluorescentie in situ hybridisatie (TSA-FISH, CARD-FISH), gericht op specifiek rRNA. De toepassing ervan voor eiwitten blijft echter beperkt26. In deze studie werd een TSA-procedure toegepast om immunodetectie van de hele cel van de N2-fixerende cyanobacterie C. watsonii mogelijk te maken, met aanpassingen op basis van een eerdere referentie20. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bevestigen dat er geen belangenconflicten zijn in verband met deze studie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We waarderen Dr. Radek Kana en Barbora Šedivá voor hun hulp bij confocale microscopische analyse en Dr. Roman Sobotka en Dr. Kateřina Bišová voor advies bij immunodetectie en fluorescentiemicroscopie-analyse. Dit onderzoek werd financieel ondersteund door de Tsjechische Onderzoeksstichting GAČR (project 20-17627S naar OP en TM), het Mobiliteit plus-project tussen JSPS en de Tsjechische Academie van Wetenschappen (JPJSBP 120222502) en JSPS KAKENHI (project 23H02301).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AchromopeptidaseFUJIFILM014-09661
Alexa Fluor350Thermo ScientificB40952Tyramide-350
Alexa Fluor405Thermo ScientificB48254Tyramide-405
Alexa Fluor488 Tyramide SuperBoost KitThermo ScientificB40922Geit anti-rabbit IgG
Bovine serum albuminSigma-AldrichA2153
CentrifugeEppendorf5804 R
Centrifuge tubes (15 mL)VWR525-1085Voor het oogsten van cellen
Confocale microscoopZeissLSM880 Uitgerust met Airyscan
FluorescentiemicroscoopOlympusBX51DAPI-filter: Ex.360-370 nm, Em. 420-460 nm
GelatineMerk4070
Hoge precisie microscoopglazen voor confocale microscoopDeckgläserNo. 1.5H
Liquid Blocker Regular/MiniDaido Sangyo Co., Ltd.Part 6505Voor het houden van de cellen op het glasplaatje
LysozymITW ReagentsA4972
MethanolCarl Roth67-56-1
MonokaliumfosfaatPenta12290
MontagemediumSigma-Aldrich345789-20MLFluorSave Reagens
MontagemediumVectashieldH-1300
Objectieflens gebruikt in de confocale microscoopZeissPlan-Apochromat 63x/1.4 Oil DIC M27
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
Poly-lysine gecoat glasplaatjeSigma-AldrichP0425-72EA
Kaliumchloride Lach-Ner
Safe lock tube (1.5 mL)Eppendorf0030 120.086Voor het behandelen van cellen en het opslaan van chemicaliën
Natriumchloride Penta16610
Natriumwaterstoffosfaat Penta15130
Triton X-100Sigma-AldrichX100

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ackermann, M. A functional perspective on phenotypic heterogeneity in microorganisms. Nature Reviews Microbiology. 13 (8), 497-508 (2015).
  2. Schreiber, F., Ackermann, M. Environmental drivers of metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Biotechnology. 62, 202-211 (2020).
  3. Takhaveev, V., Heinemann, M. Metabolic heterogeneity in clonal microbial populations. Current Opinion in Microbiology. 45, 30-38 (2018).
  4. van Heerden, J. H., et al. Lost in transition: start-up of glycolysis yields subpopulations of nongrowing cells. Science. 343 (6174), 1245114(2014).
  5. Lindemann, D., Westerwalbesloh, C., Kohlheyer, D., Grunberger, A., von Lieres, E. Microbial single-cell growth response at defined carbon limiting conditions. RSC advances. 9 (25), 14040-14050 (2019).
  6. Kotte, O., Volkmer, B., Radzikowski, J. L., Heinemann, M. Phenotypic bistability in Escherichia coli's central carbon metabolism. Molecular Systems Biology. 10 (7), 736(2014).
  7. Nikolic, N., et al. Cell-to-cell variation and specialization in sugar metabolism in clonal bacterial populations. PLoS Genetics. 13 (12), 1007122(2017).
  8. Solopova, A., et al. Bet-hedging during bacterial diauxic shift. The Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7427-7432 (2014).
  9. Schreiber, F., et al. Phenotypic heterogeneity driven by nutrient limitation promotes growth in fluctuating environments. Nature Microbiology. 1, 16055(2016).
  10. Zimmermann, M., et al. Substrate and electron donor limitation induce phenotypic heterogeneity in different metabolic activities in a green sulphur bacterium. Environmental Microbiology Reports. 10 (2), 179-183 (2018).
  11. Masuda, T., et al. Heterogeneous N2 fixation rates confer energetic advantage and expanded ecological niche of unicellular diazotroph populations. Communications Biology. 3, 172(2020).
  12. Mohr, W., Vagner, T., Kuypers, M. M., Ackermann, M., Laroche, J. Resolution of conflicting signals at the single-cell level in the regulation of cyanobacterial photosynthesis and nitrogen fixation. PLoS One. 8 (6), 66060(2013).
  13. Polerecky, L., et al. Temporal patterns and intra- and inter-cellular variability in carbon and nitrogen assimilation by the unicellular cyanobacterium Cyanothece sp. ATCC 51142. Frontiers in Microbiology. 12, 620915(2021).
  14. Berthelot, H., et al. NanoSIMS single cell analyses reveal the contrasting nitrogen sources for small phytoplankton. ISME Journal. 13, 651-662 (2019).
  15. Foster, R. A., Sztejrenszus, S., Kuypers, M. M. Measuring carbon and N2 fixation in field populations of colonial and free-living unicellular cyanobacteria using nanometer-scale secondary ion mass spectrometry. Journal of Phycology. 49 (3), 502-516 (2013).
  16. Lin, S., Henze, S., Lundgren, P., Bergman, B., Carpenter, E. J. Whole-cell immunolocalization of nitrogenase in marine diazotrophic cyanobacteria, Trichodesmium spp. Applied and Environmental Microbiology. 64, 3052-3058 (1998).
  17. Berman-Frank, I., et al. Segregation of nitrogen fixation and oxygenic photosynthesis in the marine cyanobacterium Trichodesmium. Science. 294, 1534-1537 (2001).
  18. El-Shehawy, R., Lugomela, C., Ernst, A., Bergman, B. Diurnal expression of hetR and diazocyte development in the filamentous non-heterocystous cyanobacterium Trichodesmium erythraeum. Microbiology. 149, 1139-1146 (2003).
  19. Webb, E. A., Ehrenreich, I. M., Brown, S. L., Valois, F. W., Waterbury, J. B. Phenotypic and genotypic characterization of multiple strains of the diazotrophic cyanobacterium, Crocosphaera watsonii, isolated from the open ocean. Environmental Microbiology. 11 (2), 338-348 (2009).
  20. Taniuchi, Y., Murakami, A., Ohki, K. Whole-cell immunocytochemical detection of nitrogenase in cyanobacteria: improved protocol for highly fluorescent cells. Aquatic Microbial Ecology. 51, 237-247 (2008).
  21. Ohki, K., Taniuchi, Y. Detection of nitrogenase in individual cells of a natural population of Trichodesmium using immunocytochemical methods for fluorescent cells. Journal of Oceanography. 65, 427-432 (2009).
  22. Orcutt, K. M., Ren, S., Gundersen, K. Detecting proteins in highly autofluorescent cells using quantum dot antibody conjugates. Sensors. 9 (9), 7540-7549 (2009).
  23. Bobrow, M. N., Harris, T. D., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification: Application to immunoassays. Journal of Immunological Methods. 125, 279-285 (1989).
  24. Bobrow, M. N., Shaughnessy, K. J., Litt, G. J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. II. Application to membrane immunoassays. Journal of Immunological Methods. 137, 103-112 (1991).
  25. Bobrow, M. N., Litt, G. J., Shaughnessy, K. J., Mayer, P. C., Conlon, J. The use of catalyzed reporter deposition as a means of signal amplification in a variety of formats. Journal of Immunological Methods. 150, 145-149 (1992).
  26. Piccini, C., Fabre, A., Lacerot, G., Bonilla, S. Combining immunolabeling and catalyzed reporter deposition to detect intracellular saxitoxin in a cyanobacterium. Journal of Microbiol Methods. 117, 18-21 (2015).
  27. Chen, Y. B., Zehr, J. P., Mellon, M. Growth and nitrogen fixation of the diazotrophic filamentous nonheterocystous cyanobacterium Trichodesmium sp. IMS 101 in defined media: evidence for a circadian rhythm. Journal of Phycology. 32, 916-923 (1996).
  28. Ohki, K. Intercellular localization of nitrogenase in a non-heterocystous cyanobacterium (Cyanophyte), Trichodesmium sp. NIBB1067. Journal of Oceanography. 64, 211-216 (2008).
  29. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. McKnight, P. E., Najab, J. Mann-Whitney U Test. The Corsini Encyclopedia of Psychology. , John Wiley & Sons, Ltd. 1(2010).
  31. Steel, R. G. D. Some rank sum multiple comparison tests. Biometrics. 17, 539-552 (1961).
  32. M, S. H. K. Standard Deviation. International Encyclopedia of Statistical Science. Lovric, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).
  33. Gross, A. J., Sizer, I. W. The oxidation of tyramine, tyrosine, and related compounds by peroxidase. Journal of Biological Chemistry. 234 (6), 1611-1614 (1959).
  34. Eling, T. E., Thompson, D. C., Foureman, G. L., Curtis, J. F., Hughes, M. F. Prostaglandin H synthase and xenobiotic oxidation. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 30, 1-45 (1990).
  35. Clutter, M. R., Heffner, G. C., Krutzik, P. O., Sachen, K. L., Nolan, G. P. Tyramide signal amplification for analysis of kinase activity by intracellular flow cytometry. Cytometry Part A. 77 (11), 1020-1031 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cyanobacteri le eiwitteneiwitkwantificeringCrocosphaera watsoniifycoerythrine autofluorescentiefycourobiline autofluorescentieconfocale microscopiefluorescentiemicroscopieanalyse van individuele cellenFiji software
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen