Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Micro-CT-beeldvorming en morfometrische analyse van neonatale hersenen van muizen

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65180

⸱

19 mei 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Unidad Ejecutora de Estudios en Neurociencias y Sistemas Complejos (ENyS, CONICET-UNAJ-HEC), 2Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de La Plata, 3Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad Nacional de La Plata, 4Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie beschrijft de stappen voor het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie van neonatale muizenhersenen door micro-computertomografie (micro-CT) en een contrastmiddel te combineren in ex vivo monsters. We beschrijven basis morfometrische analyses om de grootte en vorm van de hersenen in deze beelden te kwantificeren.

Samenvatting

Neurobeelden zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van hersenmorfologie in experimenten met diermodellen. Magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) is de standaardmethode geworden voor zachte weefsels, hoewel de lage ruimtelijke resolutie enkele beperkingen met zich meebrengt voor kleine dieren. Hier beschrijven we een protocol voor het verkrijgen van driedimensionale (3D) informatie met hoge resolutie over de hersenen en schedels van pasgeborenen van muizen met behulp van micro-computertomografie (micro-CT). Het protocol omvat de stappen die nodig zijn om de monsters te ontleden, de hersenen te kleuren en te scannen, en morfometrische metingen van het hele orgaan en de interessegebieden (ROI's) te verkrijgen. Beeldanalyse omvat de segmentatie van structuren en de digitalisering van puntcoördinaten. Kortom, dit werk laat zien dat de combinatie van micro-CT en Lugol's oplossing als contrastmiddel een geschikt alternatief is voor het in beeld brengen van de perinatale hersenen van kleine dieren. Deze beeldvormingsworkflow heeft toepassingen in de ontwikkelingsbiologie, biogeneeskunde en andere wetenschappen die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van het effect van verschillende genetische en omgevingsfactoren op de ontwikkeling van de hersenen.

Inleiding

Micro-computertomografie (micro-CT) beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden. In de biologie is het vooral geschikt voor botonderzoek vanwege de absorptie van röntgenstraling in gemineraliseerde weefsels. Vanwege deze functie zijn diverse vragen over onder andere botontwikkeling1, metabolisme2 en evolutie 3,4 benaderd met behulp van micro-CT. In 2008 toonden de Crespigny et al.5 aan dat micro-CT-beelden van volwassen muizen- en konijnenhersenen konden worden verkregen met jodium als contrastmiddel. Dit werk opende een nieuwe toepassing voor deze beeldvormingstechniek, aangezien jodium het mogelijk maakte beelden te verkrijgen van zachte weefsels die anders ongevoelig zouden zijn voor röntgenstralen. Het algemene doel van het combineren van micro-CT en een contrastmiddel op basis van jodium is dus het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie, waarin zachte weefsels kunnen worden onderscheiden en geïdentificeerd op meso- of macro-anatomisch niveau.

Deze techniek heeft een opmerkelijk potentieel voor studies die gedetailleerde ex vivo fenotypische karakterisering vereisen van kleine exemplaren, zoals muizenembryo's, die veel worden gebruikt in experimentele ontwerpen6. Jodiumcontrast in combinatie met micro-CT-beeldvorming is gebruikt om volumetrische kwantificeringen van organen7 en historische driedimensionale (3D) structuren te verkrijgen 8,9. In de afgelopen jaren is micro-CT-scanning van gekleurde monsters toegepast om fenotypische kenmerken van knaagdieren in de hersenen te beschrijven10, en er zijn verschillende verbeteringen aan de techniek voorgesteld. Voor volwassen hersenen bleek een protocol van 48 uur onderdompeling in jodium, met een voorafgaande stap van perfusie met een hydrogel, beelden van hoge kwaliteit te produceren11. Gignac et al.12 verlegden de grenzen van deze techniek door aan te tonen dat rattenhersenen die met jodium waren gekleurd, konden worden verwerkt om routinematige histologische technieken uit te voeren. Evenzo laten deze procedures veelbelovende resultaten zien voor embryonale en pre-spenende knaagdierhersenen 8,13,14,15.

Hoewel de neurowetenschap grotendeels op microscoop gebaseerde technieken heeft toegepast om verschillende structurele en functionele aspecten van de ontwikkeling van de hersenen te beoordelen, zijn dergelijke studies geschikter voor het karakteriseren van specifieke celpopulaties of ruimtelijk beperkte structuren. Omgekeerd maakt micro-CT-beeldvorming het mogelijk om hele structuren te beschrijven en 3D-modellen te verwerven die relevante ruimtelijke informatie bewaren, wat complementair is aan microscopische technieken. Magnetic Resonance Imaging (MRI) is ook een standaardtechniek die wordt toegepast om de structurele kenmerken van kleine dieren te onderzoeken 16,17,18. Micro-CT, met het gebruik van een contrastmiddel, heeft echter twee belangrijke voordelen voor ex vivo vaste monsters: micro-CT-scanners zijn veel goedkoper en eenvoudig te bedienen, en maken een hogere ruimtelijke resolutie mogelijk dan MRI12.

Dit werk heeft tot doel de procedure te beschrijven om beelden met een hoge resolutie te verkrijgen van neonatale muizenhersenen met behulp van micro-CT-scanning na kleuring met de oplossing van Lugol, een contrastmiddel op basis van jodium. Er wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd, dat begint met voorbereidende fasen zoals monsterverzameling en fixatie van weefsels, en gaat door kleuring, micro-CT-beeldacquisitie en standaardverwerking. Beeldverwerking omvat de segmentatie van een 3D-volume van het volledige hoofd, evenals van de hersenen, en de selectie van specifieke anatomische vlakken om puntcoördinaten te digitaliseren die vervolgens kunnen worden gebruikt in morfometrische analyses. Hoewel de focus hier ligt op het neonatale muizenbrein, kunnen vergelijkbare strategieën worden toegepast op andere zachte weefsels. Het hier gepresenteerde protocol is dus flexibel genoeg om, met subtiele aanpassingen, te worden toegepast op andere soorten monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele procedures volgden de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care.

1. Monstername en -voorbereiding

  1. Bereid 500 ml 4% paraformaldehyde (PFA) voor.
    1. Voeg onder een extractieflux in een kast 20 g PFA-poeder toe aan 250 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een glazen bekerglas van 1 liter. Plaats het bekerglas met een magneet op een magnetisch roerplaatje.
    2. Roer tijdens het verwarmen. Controleer met een thermometer constant de temperatuur van de oplossing om deze onder de 60 °C te houden.
    3. Voeg met een plastic pasteurpipet druppels van 1 M NaOH toe aan de oplossing om de PFA op te lossen. Zodra het PFA-poeder volledig is opgelost, koelt u de oplossing af bij kamertemperatuur (RT).
    4. Stel het volume in op 500 ml met 1x PBS. Pas de pH aan naar 7,2-7,3 door druppels van 1 M HCl toe te voegen met een plastic pasteurpipet.
    5. Filtreer de oplossing met behulp van een papieren filter en een glazen trechter in een glazen fles van 1 liter.
    6. Sluit de glazen fles, haal deze uit de fluxkast en bewaar in de koelkast bij -4 °C.
  2. Verzamel hersenmonsters.
    1. Om monsters te verkrijgen, offermuizen pasgeborenen de ochtend na hun geboorte, op een leeftijd van 0,5 dag (P 0,5), met behulp van een chirurgische schaar om ze te onthoofden.
    2. Plaats de schaar in de nek van de pasgeborene terwijl u het lichaam vasthoudt en voer een enkele en zuivere snede uit.
  3. Fixeer de monsters in PFA.
    1. Vul een conische buis van 50 ml met 40 ml 4% PFA.
    2. Dompel elke kop onder in de buis die PFA als fixatiemiddel bevat. Gebruik hiervoor een Paton-spatel of een lepel.
    3. Bewaar de conische buisjes 48 uur in de koelkast bij -4 °C en verander ze daarna in 40 ml 1x PBS met 0,1% natriumazide als conserveermiddel. Gekoeld bewaren bij -4 °C.

2. Monster kleuring

  1. Bereid de oplossing van Lugol (3,75% m/v).
    1. Los onder een extractieflux in een kast, in een glazen bekerglas van 1 liter, 10 g Kl en 5 g I2 op 400 ml gedestilleerd water op, onder constante menging met behulp van een magnetische roerder.
  2. Dompel elke kop onder in een conische buis van 50 ml met 40 ml Lugol-oplossing.
    1. Voor pasgeborenen met een geschatte lichaamsgrootte van 1,3 g, laat de monsters 15-20 uur ondergedompeld en meng ze constant met behulp van een orbitale shaker.
    2. Plaats de monsters gedurende 30 minuten in een conische buis van 15 ml met 10 ml 1% agarose voordat u gaat scannen.

3. Micro-CT-scannen

OPMERKING: Micro-CT-scanning vereist specifieke apparatuur. Er zijn verschillende opties voor dit soort scanners en details over de aanschaf zijn afhankelijk van de kenmerken van de gebruikte apparatuur. Het laboratorium van Dr. Hallgrímsson rekent op enkele alternatieven voor micro-CT-scanners. Hier is het protocol gebaseerd op het gebruik van een eenvoudige desktopscanner, een van de meer toegankelijke beeldvormingsmachines voor kleine dieren die door laboratoria over de hele wereld worden gebruikt. Als het scandoel de schedel is, sla dan de stappen in sectie 2 van het protocol over en ga verder met sectie 3. Na het scannen van de schedel kon het kleuringsproces en het scannen van de hersenen worden uitgevoerd om beelden te verkrijgen van dezelfde monsters van zowel de hersenen als de schedel.

  1. Plaats het monster in de micro-CT-houder.
    1. Plaats het monster in een conische buis van 50 ml. Fixeer het monster om bewegingen tijdens de scannersessie te voorkomen. Voor dit doel kan wat polyurethaanmateriaal worden gebruikt om de lege delen van de buis te vullen.
    2. Open de apparatuur en plaats het buisje met het monster in de micro-CT-houder.
    3. Log in op het micro-CT controlepaneel en registreer het te scannen monster. Hierdoor wordt automatisch een voorbeeldnummer gegenereerd. Vul naast het nummer ook het veld "Naam" in. Zowel de naam als het nummer van de steekproef moeten elders worden vastgelegd (bijvoorbeeld in een spreadsheet) voor het geval de ruwe gegevens opnieuw moeten worden opgehaald.
    4. Start het scanprogramma. Voer de naam of het nummer van het monster in en selecteer een controlebestand , dat de scanparameters moet bevatten.
  2. Scan het monster.
    1. Stel in het scherm van de micro-CT-software de volgende parameters in: isotrope voxelgrootte van 0,012 mm, 45 kVp, 177 lA, 800.000 ms integratietijd en 500 projecties per 180°.
    2. Stel het scangebied in door Scout View te selecteren. Zodra de referentieafbeelding verschijnt, drukt u op Referentielijn om de regio in te stellen. Verplaats de ononderbroken groene lijn naar de rand van het monster en houd Shift ingedrukt terwijl u de cursor sleept om het scangebied uit te breiden naar de andere rand van het monster.
    3. Selecteer OK om de scan te starten.
  3. Evalueer en exporteer de scan.
    1. Open het evaluatieprogramma van de micro-CT-scanner en klik op Monster en meting selecteren. Typ in het veld Filter de naam van het monster, selecteer het monster en selecteer het meetbestand.
    2. Het bestand wordt geladen als segmenten, waarvan het aantal afhankelijk is van het eerste scanvenster. Klik op de knop Alles laden , waardoor elk plakje wordt geladen en later de verplaatsing tussen plakjes wordt vergemakkelijkt.
    3. Selecteer Taken > Evaluatie 3D om een bijsnijdvak rond de segmenten te initialiseren. Er verschijnt een 3D-evaluatieprompt met een aantal velden, waaronder Taak/Evaluatie, VOI (Volume of Interest), Start X, Y, Z en Dimensie X, Y, Z.
    4. Stel het veld Taak > evaluatie 3D in op het juiste script, aangezien verschillende evaluatietaken kunnen worden uitgevoerd, zoals reconstructie, segmentatie, morfometrie (bijv. botmineraaldichtheid) en bestandsconversies of -overdrachten. Het standaardevaluatiescript kan als richtlijn worden gebruikt.
    5. Nadat u het script hebt geselecteerd, past u het VOI-vak op de hoofdafbeelding aan. Begin met de eerste plak. Zorg ervoor dat de doos de te evalueren anatomie bevat. Verplaats de VOI door met de rechtermuisknop op een van de kleine witte vierkantjes in de richting van de rand van het vak te klikken en het formaat van de VOI te wijzigen met de middelste muisknop. U kunt ook de dimensievelden numeriek aanpassen.
    6. Ga door het monster met behulp van de schuifbalk onder de afbeelding om er zeker van te zijn dat alle anatomieën zijn vastgelegd in de VOI-box. Klik op XY, XZ of YZ in de linkerbovenhoek van de software om de oriëntatie te wijzigen.
    7. Selecteer Evaluatie starten. Afhankelijk van het script voor taakevaluatie wordt hiermee een 3D .aim-afbeeldingsbestand gegenereerd met een bijbehorend .txt-headerbestand. Bovendien kan in het script een pad worden opgegeven om de afbeelding naar een bepaalde locatie te verplaatsen met File Transfer Protocol (FTP).

4. Beeldverwerking

  1. Open de afbeeldingen in de beeldverwerkingssoftware.
    OPMERKING: Beeldverwerking kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende software. Dit protocol omvat de basisstappen in commerciële software, die algemeen wordt geaccepteerd in het gebied en veelzijdige tools heeft voor basis- en geavanceerde verwerking. Daarnaast zijn er verschillende acceptabele formaten voor gereconstrueerde micro-CT-beelden. Dit aspect hangt meestal af van de apparatuur die wordt gebruikt voor acquisitie en de software ervan. Hier wordt beeldverwerking uitgevoerd met .bmp beelden. Dezelfde procedure kan worden toegepast voor .tiff afbeeldingen en andere typen. Aangezien de acquisitie wordt uitgevoerd in een scanner met .aim als standaardformaat, wordt eerst een conversie van .aim naar .bmp gepresenteerd.
    1. Als u AIM-bestanden wilt openen, selecteert u Bestand > Open Data en kiest u het bestand. Daarna wordt een venster geopend met de titel Selectie bestandsindeling. Selecteer Ruwe gegevens.
    2. Er wordt een venster geopend met de titel Raw Data Parameters. Vul in dit venster de parameters in volgens de informatie in de koptekst .txt bestand dat voor elk .aim-bestand wordt gegenereerd. Kies bij Gegevenstype 16-bits voor koptekst, compleet met het nummer nadat Afbeeldingsgegevens beginnen bij byte-offset. Stel ook de afmetingen en voxelgrootte in met behulp van de informatie in de koptekst .txt bestand. Zodra de parameters zijn voltooid, drukt u op OK.
    3. Als conversie van .aim naar .bmp nodig is, klikt u in het hoofdpaneel > de projectweergave met de rechtermuisknop op het .aim-object en selecteert u de optie Converteren > Afbeeldingstype converteren. Selecteer bij Eigenschappen 8-bits als uitvoertype. Selecteer Toepassen.
    4. Klik met de rechtermuisknop op het nieuwe 8-bits object. Selecteer Opslaan als. Kies .bmp en sla op.
    5. Als u het .bmp bestand wilt openen, selecteert u Bestand > Gegevens openen en kiest u het bestand. Daarna wordt een venster met de parameters van de afbeelding geopend. Bevestig de parameters en accepteer indien correct.
    6. In het hoofdpaneel > de projectweergave wordt een nieuw object gemaakt met de naam van de .bmp bestanden. Klik met de rechtermuisknop op dit object en selecteer de optie Ortho Slice. Selecteer in Eigenschappen het segmentnummer en het oriëntatievlak dat u wilt zien.
  2. Verkrijg 3D-volumes van het volledige hoofd.
    1. Klik in het hoofdpaneel > de projectweergave met de rechtermuisknop op het afbeeldingsobject. Selecteer de optie Interactieve drempels > Maken. Wijzig in Eigenschappen de waarden voor Minimale RGB en Maximale RGB totdat het deel van de afbeelding dat overeenkomt met de kop van het dier is geselecteerd. Selecteer Toepassen.
    2. In het hoofdpaneel > de projectweergave wordt een object met drempelwaarde gemaakt. Klik met de rechtermuisknop op dit object en selecteer in Eigenschappen Isosurface. Kies in Eigenschappen een drempel om het oppervlak te visualiseren en klik op Toepassen. Deze drempel moet empirisch worden gekozen, waarna mogelijk verschillende waarden moeten worden onderzocht.
  3. Puntcoördinaten digitaliseren
    1. 3D-puntcoördinaten kunnen worden gedigitaliseerd, zowel op basis van plakjes als op geëxtraheerde oppervlakken. Voor de eerste optie klikt u met de rechtermuisknop in de afbeeldingsoptie en selecteert u Segment. Kies in Vertalen het gewenste segment in het axiale vlak. Als het vlak niet correct is geplaatst, klikt u op Opties > Roteren in Eigenschappen om de juiste afdrukstand vast te stellen.
    2. Als u oriëntatiepunten wilt digitaliseren, klikt u met de rechtermuisknop in het hoofdpaneel > de projectweergave en selecteert u Object > punten en lijnen > oriëntatiepunten maken. Klik met de rechtermuisknop op de nieuwe objectoriëntatiepunten en selecteer Oriëntatiepuntweergave. Wijzig in de oriëntatiepuntweergave de grootte van het punt in Grootte. Om oriëntatiepunten toe te voegen in Eigenschappen, gebruikt u de optie Toevoegen in de bewerkingsmodus.
      OPMERKING: Voor pasgeborenen werd eerder een reeks oriëntatiepunten en semi-oriëntatiepunten rond de axiale en sagittale krommen van de hersenen gepubliceerd14.
    3. Kies eerst het axiale vlak dat het meest rostrale punt van de bulbus olfactorius en het meest caudale punt van de cortex kruist.
    4. Selecteer de Objectoriëntatiepunten en selecteer in Eigenschappen Oriëntatiepunteditor. Klik met de pijl op de plaats waar het punt gedigitaliseerd moet worden.
    5. In de voorgestelde set oriëntatiepunten worden 24 punten gedigitaliseerd in het geselecteerde axiale vlak. Digitaliseer de eerste in het meest caudale punt van de hersenen bij de middellijn.
    6. Digitaliseer vijf punten gelijkmatig verdeeld over de curve (semi-oriëntatiepunten) tot het volgende oriëntatiepunt op het snijpunt tussen de middenhersenen en de cortex.
    7. Digitaliseer vervolgens acht punten (semi-oriëntatiepunten) rond de cortex.
    8. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de cortex en de bulbus olfactorius. Digitaliseer vervolgens vier punten (semi-oriëntatiepunten) rond de bulbus olfactorius.
    9. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op het meest rostrale punt van de reukbollen op de middellijn. Digitaliseer vervolgens twee punten (semi-oriëntatiepunten) tussen beide bulbus olfactorius.
    10. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op het meest caudale punt van de bulbus olfactorius op de middellijn.
    11. Voor sagittale punten maakt u een plak in de rechterkant van de hersenen op een parasagittaal vlak waar de hersenen het meest caudaal prominent aanwezig zijn.
    12. In de voorgestelde set oriëntatiepunten worden 33 punten gedigitaliseerd in het geselecteerde parasagittale vlak. Digitaliseer de eerste in de kruising tussen het diencephalon en de achterhersenen. Digitaliseer vervolgens negen punten (semi-oriëntatiepunten) in de ventrale limiet van de hersenen.
    13. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op het meest rostrale punt van de bulbus olfactorius. Digitaliseer vervolgens drie punten (semi-oriëntatiepunten) rond de bulbus olfactorius.
    14. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de bulbus olfactorius en de cortex. Digitaliseer vervolgens drie punten (semi-oriëntatiepunten) rond de bulbus olfactorius.
    15. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de bulbus olfactorius en de cortex. Digitaliseer vervolgens zeven punten (semi-oriëntatiepunten) rond de cortex.
    16. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de cortex en de middenhersenen. Digitaliseer vervolgens zeven punten (semi-oriëntatiepunten) rond de cortex.
    17. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de cortex en de middenhersenen. Digitaliseer vervolgens zes punten (semi-oriëntatiepunten) rond de middenhersenen.
    18. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen de middenhersenen en het cerebellum. Digitaliseer vervolgens twee punten (semi-oriëntatiepunten) rond het cerebellum.
    19. Digitaliseer een nieuw herkenningspunt op de kruising tussen het cerebellum en de achterhersenen.
    20. Sla de gedigitaliseerde punten op. Klik met de rechtermuisknop op de Objectoriëntatiepunten en kies de optie Gegevens opslaan.
  4. Analyseer de puntcoördinaten.
    OPMERKING: Zodra de puntcoördinaten zijn gedigitaliseerd voor een reeks preparaten, kunnen basisanalyses worden uitgevoerd met behulp van geometrische morfometrische hulpmiddelen om grootte- (zwaartepuntgrootte) en vormvariabelen (vorm of Procrustes-coördinaten) te verkrijgen. Analyses worden uitgevoerd in een gratis open software-omgeving, die vooral geschikt is voor statistische analyses.
    1. Bouw met behulp van een notitieblok een bestand op met de coördinaten van alle gedigitaliseerde exemplaren. Volg hiervoor het TPS-formaat, zoals beschreven in https://morphometrics.uk/MorphoJ_guide/frameset.htm?index.htm.
    2. Open de statistische software. Selecteer Bestand > Dir wijzigen om de map te kiezen waarin het tps-bestand is opgeslagen.
    3. Selecteer Pakketten > Pakketten installeren. Kies een Cran Mirror. Zoek naar geomorph en installeer deze.
    4. Laad pakketten door in de console te typen: bibliotheek (geomorf) en bibliotheek (Morpho).
    5. Laad de dataset door in de console te typen: dataset <- readland.tps(file="NAME_OF_FILE.tps", specID="ID").
    6. Voer een gegeneraliseerde Procrustes-analyse uit door in de console te typen: GPA<- gpagen(dataset).
    7. Verkrijg de zwaartepuntgrootte door in de console te typen: CS<-GPA$Csize.
    8. Verkrijg Procrustes-coördinaten door in de console te typen: ProcCoord<- GPA$coords.
    9. Plot de Procrustes-coördinaten en de gemiddelde vorm door in de console te typen: plotAllSpecimens(ProcCoord).
  5. Segmentatie van ROI's
    OPMERKING: Om de hersenen te segmenteren en een 3D-reconstructie te verkrijgen, identificeert u handmatig de hersenweefsels in elk plakje. Dezelfde procedure kan worden toegepast op specifieke ROI's, zoals de bulbus olfactorius, cortex, enz.
    1. Klik met de rechtermuisknop op het hoofdpaneel > de projectweergave en selecteer Object maken > labelveld.
    2. Selecteer het object Labelveld en druk op de optie Segmentatie-editor in Eigenschappen.
    3. Voeg in Materialen een nieuw materiaal toe en hernoem het, indien gewenst, naar Hersenen.
    4. Kies in Selectie de optie Huidig segment om het weefsel dat overeenkomt met de hersenen in elk plakje te segmenteren.
    5. Selecteer met behulp van de opties in Tools het hersenweefsel in elk plakje. Voor dit geval zijn de Toverstaf en de Borstel het meest geschikt.
    6. Zodra de selectie in elk segment is gemaakt, drukt u op Selectie toevoegen.
    7. Wanneer de selectie in alle segmenten is voltooid, keert u terug naar de projectweergave in het hoofddeelvenster en klikt u met de rechtermuisknop op Labelveld om Surface genereren te selecteren en klikt u vervolgens op Toepassen.
    8. Zodra het oppervlak is verkregen, exporteert u het door Extract Surface aan te brengen.
    9. Als u het volume van de gesegmenteerde structuren wilt verkrijgen, selecteert u in het hoofdpaneel > de projectweergave het object dat het label bevat, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u Meten en analyseren > volumefractie. Klik vervolgens op Toepassen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hier wordt een basisprotocol gepresenteerd om beelden met een hoge resolutie van neonatale muizenhersenen te verkrijgen. De hoofden werden gescand na onderdompeling in de oplossing van Lugol. Ondanks hun kleine formaat kunnen de belangrijkste anatomische structuren van de hersenen, zoals de bulbus olfactorius, de cortex, de middenhersenen, het cerebellum en de achterhersenen, worden onderscheiden (Figuur 1).

Aan de hand van deze beelden kunnen verschillende analys...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk wordt een beknopt protocol geïntroduceerd om neonatale hersenweefsels van muizen te scannen met behulp van micro-CT met een contrastmiddel. Bovendien bevat het eenvoudige procedures om kwantitatieve en kwalitatieve output te verkrijgen. Voortbouwend op deze methoden kunnen verdere alternatieve of aanvullende analyses worden uitgevoerd.

Zoals in het protocol te zien is, kunnen micro-CT-beelden op verschillende manieren worden geanalyseerd. In eerdere studies schatte onze groep de gr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken Wei Liu voor zijn technische assistentie. Dit werk wordt gefinancierd door ANPCyT PICT 2017-2497 en PICT 2018-4113.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 µCT 35Scanco Medical AGLet op dat Scanco de  µCT 35 niet meer aanbiedt. Hun kleinste scanner is nu de  µCT 45 
AvizoVisualization Sciences Group, VSG
C57BL/6 MuizenBioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata
Conische buizenDaiggerCH-CI4610-1856
FluxkastEscoAC2-458 
Glasbeker GlasscoGL-229.202.10
GlasflesSimaxCFB017
Glas trechterHDAVI1108
HClCarlo Erba403872Manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen)
I2Cicarelli804211Bij het bereiden van I2KI, manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen)
KICicarelliPA131542.1210Bij het bereiden van I2KI, manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen)
Magneet roerderArcano4925
NaOHCicarelli1580110Manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen)
Orbitale shakerBiomintBM021
Paraformaldehyde Biopack2000959400Manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen)
Paton spatelGlasscoGL-377.303.01
PBSBiopack2000988800
Plastiek Pasteur pipetDaigger9153
RR ProjectHet pakket geomorph voor R werd gebruikt in het protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html)
Schaar Belmed
NatriumazidBiopack2000163500
ThermometerDaigger7650

Referenties

  1. Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
  2. Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660(2021).
  3. Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
  4. Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
  5. de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  6. Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
  7. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  8. Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227(2016).
  9. Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
  10. Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
  11. Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974(2015).
  12. Gignac, P. M., O'Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
  13. Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321(2013).
  14. Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
  15. Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184(2022).
  16. Turnbull, D. H., Mori, S. MRI in mouse developmental biology. NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).
  17. Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615(2018).
  18. Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
  19. Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
  20. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
  21. Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
  22. Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol's solution. Scientific Reports. 11, 19781(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Neonatale muizenhersenenhersensegmentatieLugol oplossing3D hersenreconstructiecontrastmiddelbeeldvorminghersenmorfologiebeeldbewerkingontwikkelingsneuro imaging
Micro-CT-beeldvorming en morfometrische analyse van neonatale hersenen van muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.