Deze studie beschrijft de stappen voor het verkrijgen van beelden met een hoge resolutie van neonatale muizenhersenen door micro-computertomografie (micro-CT) en een contrastmiddel te combineren in ex vivo monsters. We beschrijven basis morfometrische analyses om de grootte en vorm van de hersenen in deze beelden te kwantificeren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Micro-CT-beeldvorming en morfometrische analyse van neonatale hersenen van muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neurobeelden zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van hersenmorfologie in experimenten met diermodellen. Magnetische resonantiebeeldvorming (MRI) is de standaardmethode geworden voor zachte weefsels, hoewel de lage ruimtelijke resolutie enkele beperkingen met zich meebrengt voor kleine dieren. Hier beschrijven we een protocol voor het verkrijgen van driedimensionale (3D) informatie met hoge resolutie over de hersenen en schedels van pasgeborenen van muizen met behulp van micro-computertomografie (micro-CT). Het protocol omvat de stappen die nodig zijn om de monsters te ontleden, de hersenen te kleuren en te scannen, en morfometrische metingen van het hele orgaan en de interessegebieden (ROI's) te verkrijgen. Beeldanalyse omvat de segmentatie van structuren en de digitalisering van puntcoördinaten. Kortom, dit werk laat zien dat de combinatie van micro-CT en Lugol's oplossing als contrastmiddel een geschikt alternatief is voor het in beeld brengen van de perinatale hersenen van kleine dieren. Deze beeldvormingsworkflow heeft toepassingen in de ontwikkelingsbiologie, biogeneeskunde en andere wetenschappen die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van het effect van verschillende genetische en omgevingsfactoren op de ontwikkeling van de hersenen.
Inleiding
Micro-computertomografie (micro-CT) beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor verschillende onderzoeksgebieden. In de biologie is het vooral geschikt voor botonderzoek vanwege de absorptie van röntgenstraling in gemineraliseerde weefsels. Vanwege deze functie zijn diverse vragen over onder andere botontwikkeling1, metabolisme2 en evolutie 3,4 benaderd met behulp van micro-CT. In 2008 toonden de Crespigny et al.5 aan dat micro-CT-beelden van volwassen muizen- en konijnenhersenen konden worden verkregen met jodium a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimentele procedures volgden de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care.
1. Monstername en -voorbereiding
- Bereid 500 ml 4% paraformaldehyde (PFA) voor.
- Voeg onder een extractieflux in een kast 20 g PFA-poeder toe aan 250 ml 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een glazen bekerglas van 1 liter. Plaats het bekerglas met een magneet op een magnetisch roerplaatje.
- Roer tijdens het verwarmen. Controleer met een thermometer constant de temperatuur van de oplossing om deze onder de 60 °C te houden.
- Voeg met een plastic pasteurpipet druppels van 1 M NaOH toe aan de o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier wordt een basisprotocol gepresenteerd om beelden met een hoge resolutie van neonatale muizenhersenen te verkrijgen. De hoofden werden gescand na onderdompeling in de oplossing van Lugol. Ondanks hun kleine formaat kunnen de belangrijkste anatomische structuren van de hersenen, zoals de bulbus olfactorius, de cortex, de middenhersenen, het cerebellum en de achterhersenen, worden onderscheiden (Figuur 1).
Aan de hand van deze beelden kunnen verschillende analys.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In dit werk wordt een beknopt protocol geïntroduceerd om neonatale hersenweefsels van muizen te scannen met behulp van micro-CT met een contrastmiddel. Bovendien bevat het eenvoudige procedures om kwantitatieve en kwalitatieve output te verkrijgen. Voortbouwend op deze methoden kunnen verdere alternatieve of aanvullende analyses worden uitgevoerd.
Zoals in het protocol te zien is, kunnen micro-CT-beelden op verschillende manieren worden geanalyseerd. In eerdere studies schatte onze groep de gr.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.
Dankbetuigingen
Wij danken Wei Liu voor zijn technische assistentie. Dit werk wordt gefinancierd door ANPCyT PICT 2017-2497 en PICT 2018-4113.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Let op dat Scanco de µCT 35 niet meer aanbiedt. Hun kleinste scanner is nu de µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Muizen | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conische buizen | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Fluxkast | Esco | AC2-458 | |
| Glasbeker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glasfles | Simax | CFB017 | |
| Glas trechter | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | Bij het bereiden van I2KI, manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | Bij het bereiden van I2KI, manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen) |
| Magneet roerder | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen) |
| Orbitale shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipuleren onder een fluxkast en gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (masker, bril en handschoenen) |
| Paton spatel | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastiek Pasteur pipet | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | Het pakket geomorph voor R werd gebruikt in het protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Schaar | Belmed | ||
| Natriumazid | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
Referenties
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
