Een antimicrobiële stof met behulp van nano-kruiden inkapseling van essentiële oliën

Samenvatting

Antimicrobiële laboratoriumjassen voorkomen kruisbesmetting van accumulatie van ziekteverwekkers en accidentele bio-spills. Hier beschrijven we het protocol voor het ontwikkelen van een huidvriendelijke antimicrobiële stof met behulp van nano-kruideninkapseling en aangepaste standaardtests om de werkzaamheid en geschiktheid voor typisch gebruik van de laboratoriumjas nauwkeurig te evalueren.

Samenvatting

Laboratoriumjassen worden veel gebruikt in biohazard-laboratoria en zorginstellingen als beschermende kleding om directe blootstelling aan ziekteverwekkers, morsen en brandwonden te voorkomen. Deze op katoen gebaseerde beschermende jassen bieden ideale omstandigheden voor microbiële groei en aanhechtingsplaatsen vanwege hun poreuze aard, vochtvasthoudend vermogen en het vasthouden van warmte uit het lichaam van de gebruiker. Verschillende studies hebben de overleving van pathogene bacteriën op ziekenhuiskleding en laboratoriumjassen aangetoond, die fungeren als vectoren van microbiële transmissie.

Een gemeenschappelijke aanpak om deze problemen op te lossen is de toepassing van antimicrobiële stoffen in textielafwerking, maar er zijn zorgen geuit vanwege de toxiciteit en milieueffecten van veel synthetische chemicaliën. De aanhoudende pandemie heeft ook een venster geopend voor het onderzoek naar effectieve antimicrobiële stoffen en milieuvriendelijke en toxiciteitsvrije formuleringen. Deze studie maakt gebruik van twee natuurlijke bioactieve verbindingen, carvacrol en thymol, ingekapseld in chitosan nanodeeltjes, die een effectieve bescherming garanderen tegen vier menselijke pathogenen met een reductie tot 4 log (99,99%). Deze pathogenen worden vaak gedetecteerd in laboratoriumjassen die worden gebruikt in biohazard-laboratoria.

De behandelde stoffen waren ook bestand tegen maximaal 10 wascycli met 90% microbiële reductie, wat voldoende is voor het beoogde gebruik. We hebben wijzigingen aangebracht in de bestaande standaard stoftests om de typische scenario's van laboratoriumjasgebruik beter weer te geven. Deze verfijningen maken een nauwkeurigere evaluatie van de effectiviteit van antimicrobiële laboratoriumjassen mogelijk en voor de simulatie van het lot van eventuele accidentele microbiële lozingen die binnen korte tijd moeten worden geneutraliseerd. Verdere studies worden aanbevolen om de accumulatie van pathogenen in de loop van de tijd op antimicrobiële laboratoriumjassen te onderzoeken in vergelijking met reguliere beschermende jassen.

Inleiding

De beschermende witte jas is een verplicht item voor persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) in microbiologische laboratoria en zorginstellingen en beschermt tegen directe blootstelling aan ziekteverwekkers, morsen en brandwonden. Deze katoenen jassen bevorderen microbiële groei als gevolg van vele factoren - de geweven stof biedt bevestigingsplaatsen en beluchting, katoen en zetmeel gebruikt in het productieproces samen met geëxfolieerde epitheelcellen van de gebruiker leveren voedingsstoffen, en de nabijheid van de gebruiker geeft warmte en vocht. De ophoping van microben op textiel kan ook gezondheidsproblemen veroorzaken, zoals allergieën en nosocomiale infecties, onaangename geuren en verslechtering van de stof¹.

In tegenstelling tot gewone kleding worden beschermende jassen niet vaak gewassen of gedesinfecteerd, zoals in veel onderzoeken ^2,3. Veel studies tonen bewijs van laboratoriumjassen die fungeren als een vector van microbiële transmissie en het risico op nosocomiale infecties in de gezondheidszorg^2,4, met name resistente stammen³ zoals methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA); ze roepen dus gezondheidsproblemen op van PBM, die bedoeld zijn om te beschermen tegen microbiële besmetting. Er zijn niet genoeg cross-sectionele studies over laboratoriumjas-geassocieerde infecties in de context van Biosafety Level 2 (BSL-2) faciliteiten of microbiologische onderwijslaboratoria, maar veel regelgevende instanties beperken het gebruik van laboratoriumjassen binnen het containmentniveau. Veel academische instellingen in Noord-Amerika hebben echter moeite om aan de vereisten te voldoen vanwege praktische beperkingen, zoals het wassen en opslaan in de faciliteit, de incidenten van het dragen van laboratoriumjassen in openbare ruimtes zoals cafetaria's en bibliotheken komen vaak voor. Een praktische oplossing voor deze problemen is de toepassing van antimicrobiële stoffen in textielafwerking.

Antimicrobiële stoffen winnen steeds populairder in sportkleding, activewear en sokken, voornamelijk bedoeld om lichaamsgeur te verminderen. Het gebruik van deze stoffen is echter niet gebruikelijk bij de ontwikkeling van PBM's, met uitzondering van sommige met zilver gecoate katoenen maskers en kleding voor de gezondheidszorg⁵. We rapporteren de ontwikkeling van een antimicrobieel weefsel voor laboratoriumjassen, dat veel voorkomende pathogenen in BSL-2-laboratoria remt en effectieve bescherming biedt tegen de kruisbesmetting van veel voorkomende pathogenen.

Momenteel zijn er verschillende antimicrobiële stoffen en afwerkingen op de markt, maar de meeste hiervan gebruiken colloïdale deeltjes van zware metalen (bijv. Zilver, koper, zink), organometaal of synthetische chemicaliën zoals triclosan en quaternaire ammoniumverbindingen, die niet milieuvriendelijk zijn¹ en kunnen leiden tot gezondheidsproblemen zoals huidirritatie en allergieën⁶. Sommige synthetische formuleringen vormen zorgwekkend vanwege niet-doelmicroben, zoals normale flora of het induceren van antimicrobiële resistentie (AMR). De Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) reguleert commerciële antimicrobiële stoffen, die niet-toxisch moeten zijn voor de gebruiker en vrij van ecotoxiciteit. Daarom hebben antimicrobiële stoffen op basis van natuurlijke biociden die een breed spectrum van microben remmen de voorkeur. Essentiële oliën (EO's) worden veel gebruikt als antimicrobiële en therapeutische middelen, maar hun gebruik in antimicrobiële afwerking is beperkt vanwege hun duurzaamheid ^6,7,8. Op basis van onze kennis en marktonderzoek naar nano-kruidenafwerking⁸, is er geen op kruiden gebaseerde antimicrobiële stof in de handel verkrijgbaar. Dit komt omdat synthetische coatings gemakkelijk te produceren zijn en een lange levensduur hebben. Een paar nano-kruiden gecoate textiel alleen gerapporteerd voor onderzoeksdoeleinden omvatten neem⁷, moringa 9 en curry bladeren⁹.

De huidige studie maakt gebruik van twee bioactieve componenten geëxtraheerd uit oregano EO's, carvacrol en thymol, die effectief zijn tegen een breed scala aan bacteriële pathogenen en virussen, maar over het algemeen worden erkend als veilig voor mensen¹⁰. Deze bioactieve componenten zijn echter vluchtig en daarom is hun antimicrobiële potentieel van korte duur als ze rechtstreeks op de stof worden aangebracht. Nano-kruiden inkapseling is een proces waarbij bioactieve componenten of geneesmiddelen worden geladen in een polymere schaal die de kern beschermt tegen aantasting van het milieu en zo de houdbaarheid verbetert. Bovendien verbetert de kleine omvang van de polymere deeltjes, die over het algemeen variëren van 10 nm tot 100 nm, de werkzaamheid van de toepassing en vertraagt het de afgifte van de bioactieve stoffen op het weefsel. Deze bioactieve stoffen worden gebruikt voor verschillende doeleinden, zoals voedselconservering¹⁰, maar niet voor textielcoating.

Onder veel polymere inkapselaars is chitosan een aantrekkelijke kandidaat vanwege veel van zijn kenmerken, zoals niet-toxiciteit, biologische afbreekbaarheid, mucoadhesiviteit en biocompatibiliteit¹¹. Het is een natuurlijke polysaccharide, verkregen door het deacetyleringsproces van chitine, dat wordt aangetroffen in schelpen en schimmelcelwanden. Het wordt gebruikt in biochemische en voedselconserveringstoepassingen zoals medicijn- of eiwitafgifte 11,12,13^, gecontroleerde afgifte 14 en antimicrobiële films ¹⁰. Chitosan is niet gemakkelijk oplosbaar in water, maar vormt een colloïdale suspensie in zure media. Bioactieve moleculen worden geladen in chitosan nanodeeltjes (NP's) door een eenvoudige tweestaps ionische gelatiemethode^14,15,16. In dit proces vormen hydrofobe bioactieve stoffen zoals carvacrol en thymol een olie-in-water-emulsie, die wordt geholpen door een oppervlakteactieve stof, Tween 80. Vervolgens wordt een polyanionische verbinding, pentanatriumtripolyfosfaat (TPP), gebruikt om de dwarsverbindingen te vormen tussen de aminogroepen langs de polycationische polymeermoleculen en fosfaatgroepen van TPP-moleculen om het complex te stabiliseren. Dit complexatieproces stolt de bioactieve stoffen in de matrix van chitosan, die vervolgens wordt gezuiverd en gecoat op katoenen stalen om antimicrobieel weefsel te produceren.

De nanoformuleringen moeten eerst worden getest op antimicrobiële effectiviteit in emulsievorm voordat ze op de stof worden aangebracht. Dit kan gemakkelijk worden geëvalueerd met een kwalitatieve methode, zoals Kirby-Bauer schijfdiffusie, putdiffusie en de cilinderplaattest. De cilinderplaattest¹⁷ biedt echter de flexibiliteit om verschillende volumes van de formulering te laden en de vrije zone te vergelijken. Bij deze methode worden de antimicrobiële formuleringen geladen in roestvrijstalen cilinders en op een zachte agarlaag geplaatst, die wordt ingeënt met het testmicro-organisme of pathogeen. De diameter van de klaringszone die tegen het testorganisme wordt geproduceerd, is evenredig met het remmende potentieel van de antimicrobiële formulering en kan daarom worden gebruikt als alternatief voor bouillonverdunningsmethoden. De grootte van de vrije zones is echter slechts een vergelijkende of kwalitatieve maat binnen een specifieke plaat, tenzij specifieke normen worden gehandhaafd. Antimicrobiële stoffen werken tegen de ziekteverwekkers door hun groei te remmen (biostatisch) of door de cellen te doden (biocide), wat kan worden gekwantificeerd door respectievelijk minimale remmende concentratie (MIC) en minimale bacteriedodende concentratie (MBC). De werkzaamheid en het gedrag van de bioactieve chemicaliën zijn echter verschillend in hun formuleringen (vloeibare toestand) en wanneer ze zijn gecoat op een substraat zoals een stof¹⁸. Dit komt omdat meerdere factoren een rol spelen in de werkzaamheid, zoals de stabiliteit van de hechting van de antimicrobiële middelen aan de stof, vochtgehalte, substraattype en hechting van de microben. Als het beoogde doel alleen bacteriostatische activiteit is, kan een kwalitatieve test zoals de "Parallel Streak Method"¹⁹ een relatief snelle en eenvoudige evaluatie van diffuseerbare antimicrobiële formulering opleveren. Als echter de bacteriedodende effecten moeten worden bepaald, kan "Beoordeling van antibacteriële afwerkingen op textielmaterialen"²⁰ worden gebruikt, wat de logreductie van de spiked pathogeen oplevert.

Protocol

1. Bereiding van nanodeeltjes

1. Nano-kruiden inkapseling
   1. Bereid 50 ml 1% (v/v) azijnzuur.
      LET OP: IJsazijn is een irriterend middel, dat ernstige brandwonden en oogbeschadiging kan veroorzaken. Draag een laboratoriumjas over de volledige lengte, nitrilhandschoenen en een bril en werk onder een zuurkast.
   2. Bereid chitosan-oplossing (1,2% m/v) door 0,6 g chitosanvlokken (middelmatig molecuulgewicht) op te lossen in 50 ml 1% azijnzuur (hierboven bereid). Roer een nacht (O/N) bij kamertemperatuur (R/T) om een homogene emulsie te krijgen.
   3. Voeg 0,5 g Tween 80 toe en roer (1.000 tpm) bij 60 °C gedurende 2 uur om een homogene oplossing te krijgen. Breng de oplossing naar R/T voordat u bioactieve stoffen (carvacrol of thymol) toevoegt.
   4. Voeg 0,75 g carvacrol (of thymol) druppelsgewijs of geleidelijk onder roeren (1.000 tpm) het mengsel toe gedurende 20 minuten bij R/T. De gewichtsverhouding van chitosan tot bioactieve stof is 1:1,25.
   5. Voeg 50 ml (0,5% m/v) TPP druppelsgewijs toe aan het mengsel terwijl u roert bij R/T. Blijf 30 minuten roeren om een homogene emulsie te krijgen.
   6. Bereid een negatieve controle voor door dezelfde procedure te volgen, maar zonder toevoeging van bioactieve stoffen.
2. Zuivering
   1. Centrifugeer de emulsie gedurende 30 minuten bij 4 °C bij 10.000 × g en verzamel de gevormde NP's (pellets) na het decanteren van het supernatant. Reserveer het supernatant om de inkapselingseffectiviteit te testen.
   2. Was de deeltjes (vanaf stap 1.2.1) met waterige Tween 80 (1% v/v) met het dubbele volume van de gevormde pellets om de ongebonden of vrije bioactieve stoffen te verwijderen. Zorg ervoor dat u de pellet verstoort door te vortexen totdat in elke wasstap een homogene oplossing wordt gevormd.
   3. Was de deeltjes (uit stap 1.2.2) tweemaal met gedeïoniseerd water om onzuiverheden te verwijderen.
   4. Reconstitueer de NP's door de pellet (uit stap 1.2.3) opnieuw te suspenderen in 30 ml gedeïoniseerd water. Bewaar de NP's bij 4 °C gedurende maximaal 6 maanden.
      OPMERKING: Het experiment kan in dit stadium worden onderbroken.
3. Kenschets
   1. Verdun de NP's in gedeïoniseerd water totdat de ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) metingen tussen 250 en 400 nm binnen het bereik vallen (absorptie >1).
   2. Registreer de UV-Vis-absorptiespectra van de NP's over de golflengten variërend van 250 tot 400 nm met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer.
   3. Bewaar een aliquot (1 ml) NP's bij R/T gedurende een reeks van duur (bijv. 1 tot 6 maanden) en test het antimicrobiële effect met behulp van de cilinderplaatmethode samen met een vers monster.
4. Coating op stof
   1. Breng NP's aan op een geweven katoenen stof met behulp van een pad-dry-cure methode ^7,21.
      1. Dompel de stofstalen gedurende 3 minuten onder in de oplossing met NP's gemengd met een textielbindmiddel totdat ze geweekt zijn. Laat de stalen vervolgens door een laboratoriumpadder met twee rollen gaan om overtollige vloeistof te verwijderen.
      2. Droog de stalen gedurende 30 minuten in de oven bij 100 °C en laat ze 10 minuten uitharden bij 130 °C.
      3. Was ten slotte de stalen gedurende 15 minuten in een ultrasoon bad om ongebonden NP's te verwijderen.
         OPMERKING: U kunt ook de vereenvoudigde methode volgen die hieronder wordt beschreven.
   2. Knip de katoenen stof (of labjasstalen) in vierkanten van 10 cm x 10 cm.
   3. Dompel de gesneden stukken onder in 2 ml van het gesynthetiseerde NP (10%) in een plastic container (12 cm x 12 cm) gedurende 2 minuten bij R / T. Verwijder overtollige vloeistof door aan de lucht te drogen.
   4. Verwarm gedurende 3 minuten op 100 °C om de NP's te binden.
   5. Verwijder ongebonden NP's door af te spoelen in waterige Tween 80 (2% m/v) en droog in de oven op 100 °C gedurende 30 min.
      OPMERKING: Deze antimicrobiële stof kan 2 jaar worden bewaard bij R / T.
5. Duurzaamheid wassen
   1. Snijd de stof in vierkante stalen van 50 mm x 50 mm.
   2. Plaats de stalen in 50 ml warm kraanwater (40 °C) in een glazen/plastic container en voeg twee druppels gewoon wasmiddel (niet-antimicrobieel) toe.
   3. Spoel op een schommelplateauschudder of magneetroerder gedurende 30 minuten.
   4. Droog of incubeer aan de lucht bij 60 °C gedurende 2 uur en test op antimicrobiële werkzaamheid.

2. Cilinderplaattest voor het screenen van nanodeeltjes

1. Bereid trypticase soja-agar (TSA), trypticase sojabouillon (TSB), antibiotische basisagar (ABA) en antibiotische zaadagar (ASA), volgens de instructies van de fabrikant, en steriliseer de media door autoclaveren bij 121 ° C bij 15 psi gedurende 15 minuten.
2. Subcultuur de microben (uit voorraad) van belang, waartegen de werkzaamheidstests worden uitgevoerd, op vers bereide TSA-platen (of geschikte media) volgens de driewegstreepplaatmethode en incuberen om zuiverheidsplaten te produceren. (Aanbevolen soorten: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa en C. albicans.)
3. Ent de culturen van verse zuiverheidsplaten in TSB (buizen van 10 ml) bij 35 °C O/N met matig schudden (100-200 tpm).
4. Aliquot 5,0 ml van de gesmolten ASA in elk van de reageerbuizen. Het aantal buisjes komt overeen met het aantal geteste micro-organismen.
5. Giet 20 ml voorgesteriliseerd gesmolten ABA aseptisch in elke petriplaat (100 mm x 20 mm) om de basislaag te vormen. Het aantal agarplaten komt overeen met het aantal te testen micro-organismen. Wacht tot de media gestold zijn.
6. Na stolling van de basislaag ent u elke gesmolten ASA met een nachtcultuur uit stap 2,3 (1,0 ml, voorverwarmd tot 35 °C) en brengt u de inhoud (mengsel van ASA en cultuur) onmiddellijk over op het oppervlak van een ABA-plaat. Draai de plaat om de gesmolten agarlaag gelijkmatig te verdelen. Zorg ervoor dat de zaadlaag er glad uitziet en vrij is van stoten of bubbels.
7. Plaats maximaal zes roestvrijstalen cilinders (6 mm x 6 mm x 10 mm; voorgeautomatiseerd), gelijkmatig verdeeld over een zeshoekig patroon, per agarplaat met behulp van een steriel pincet (figuur 1).
8. Laad de cilinders met de gesynthetiseerde NP's van verschillende volumes (30 μL, 50 μL, 75 μL en 100 μL) om te worden gescreend op antimicrobiële effecten. De negatieve controle is die zonder bioactieve stoffen.
9. Incubeer veel voorkomende bacteriële pathogenen (bijv. E. coli, S. aureus, P. aeruginosa) bij 35 °C gedurende 24 uur en schimmelsoorten (bijv. C. albicans) bij R/T gedurende 3 dagen.
10. Meet de diameter van de heldere zone en vergelijk de effectiviteit van de gesynthetiseerde NP's.
    OPMERKING: Deze test kan worden gebruikt om de beste NP's vooraf te screenen die op de stof moeten worden gecoat.

3. Parallelle streepmethode (gewijzigd van AATCC 147)

1. Materiaalvoorbereiding
   1. Snijd de NP-behandelde stof in stalen van 50 mm x 25 mm.
   2. Bereid Mueller-Hinton agar (MHA), TSA en TSB, volgens de instructies van de fabrikant, en steriliseer de media door autoclaveren bij 121 °C bij 15 psi gedurende 15 minuten.
   3. Subcultuur de microben (uit voorraad) van belang, waartegen de werkzaamheidstests worden uitgevoerd, op vers bereide TSA-platen (of geschikte media) volgens de driewegstreepplaatmethode en incubeer bij 35 °C gedurende 2 dagen voor bacteriële vlekken en bij R/T gedurende 5 dagen voor schimmelstammen om zuiverheidsplaten te produceren. (Aanbevolen soorten: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa en C. albicans.)
2. Spiking van microbiële culturen
   1. Ent de culturen van verse zuiverheidsplaten in TSB (buizen van 10 ml) bij 35 °C O/N met matig schudden (100-200 tpm).
   2. Verdun de O/N-culturen tot 1,5 × 10⁸ kolonievormende eenheden (CFU)/ml of overeenkomend met de troebelheid van 0,5 McFarland-standaard (meestal een verdunning van 1/10 tot 1/20 voor de meeste gezonde culturen).
   3. Ent de verdunde cultuur hierboven als volgt met een steriele lus van 4 mm. Laad een lus vol bouilloncultuur en breng deze over naar het oppervlak van de MHA-agarplaat door vijf parallelle strepen te maken, elk 6 cm lang en 1 cm uit elkaar, volgens figuur 2. Vul de lus niet opnieuw.
   4. Druk het stofstaal voorzichtig met een steriele spatel over de vijf strepen, zodat de stof zich in het midden bevindt en alle vijf de streeplijnen raakt. Incubeer bij 35 °C gedurende 24 uur.
3. Kwalitatieve evaluatie van antimicrobiële werkzaamheid
   1. Onderzoek de geïncubeerde plaat op de onderbreking van de groei langs de strepen voorbij de randen van de stof (duidelijke zone duidt op remming van de groei).
   2. Bereken de gemiddelde breedte van een remmingszone langs de streeplijn (W) aan weerszijden van het stofstaal met behulp van vergelijking (1).
      W = (T - D)/2 (1)
      W = breedte van de vrije zone; T = totale lengte van de vrije zone, inclusief de staalbreedte; D = breedte van het stofstaal (25 mm).

4. Kwantitatieve logreductiemethode (gewijzigd van AATCC 100)

1. Experimentele voorbereiding
   1. Snijd de stof in vierkante stalen van 50 mm x 50 mm.
   2. Bereid TSA, TSB, Letheen-bouillon en fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) volgens de instructies van de fabrikant en steriliseer de media door autoclaveren.
   3. Bereid O/N-culturen van microben van belang, waartegen de werkzaamheidstests worden uitgevoerd, door geïsoleerde kolonies uit zuiverheidsplaten in steriele TSB te enten en gedurende 18-24 uur bij 35 °C te broeden (Aanbevolen soorten: S. aureus, E. coli, P. aeruginosa en C. albicans.)
2. Spiking van microbiële culturen
   1. Verdun de O/N-culturen tot 1,5 × 10⁸ CFU/ml of overeenkomend met de troebelheid van 0,5 McFarland-standaard (meestal een verdunning van 1/10 tot 1/20 voor de meeste gezonde culturen).
   2. Bepaal het juiste volume van culturen voor spiking door de vloeistofhoudcapaciteit van het weefsel als volgt te meten.
      1. Voeg een reeks volumes van de verdunde bouilloncultuur (bijv. 100-500 μL) toe aan de stofstalen (in afzonderlijke petriplaten) en kies het volume zodanig dat het stofstaal het water volledig absorbeert en geen rest/vrije vloeistof achterlaat. Het vloeistofhoudend vermogen verschilt van het type en de dikte van de stof. Voor gewone katoenen laboratoriumjassen is het ongeveer 200 μL.
      2. Piek het volume (vloeistofhoudend vermogen zoals hierboven bepaald [bijv. 200 μL]) van elke cultuur op de stalen die in steriele petriplaten zijn geplaatst. Het aantal stalen komt overeen met het aantal tests (bijv. stof dat onmiddellijk en na het wassen wordt getest [en de geteste wascycli]) en de antimicrobiële effecten die zijn getest gedurende de contacttijd (na een ingestelde tijd / dag [bijv. 30 min, 2 uur, dag 1-3]).
         OPMERKING: Gebruik een micropipet met aerosolfiltertips (om besmetting van de pipet bij later gebruik te voorkomen) om de culturen op de stalen met een gelijkmatige verdeling te enten.
      3. Gebruik voor de negatieve controle hetzelfde type onbehandelde stofstalen. Voer de negatieve controle uit voor elke overeenkomstige testmicrobiële soort, contactperiode, verschillende stoffen en wascycli.
3. Terugwinning van microben door levensvatbare plaattellingen
   1. Laat de geënte stalen (zowel behandeld als onbehandeld) aan de lucht drogen in de petriplaten (deksels op een kier) bij R/T voor de vereiste contactperiode(s) die moeten worden getest (bijv. 0 min, 30 min, 60 min, enz., of zelfs dagen voor langetermijneffecten). Neem altijd een "0 min" op om een onmiddellijk effect en neutraliserende werkzaamheid weer te geven.
   2. Breng de stalen aseptisch over in afzonderlijke steriele centrifugebuizen (50 ml) en schroef de doppen stevig vast.
   3. Voeg Letheenbouillon (eventuele relevante neutraliserende buffers) toe om een verdunning van 1/100 te maken (bijv. 19,8 ml voor een entmateriaal van 200 μL).
   4. Sluit de centrifugebuizen met schroefdoppen goed en vortex gedurende 1 minuut op gemiddelde snelheid.
   5. Verdun de suspensie serieel met de steriele PBS in daaropvolgende 1/10 verdunningen, zodat het aantal kolonies van de "onbehandelde" groep te laag wordt om te tellen (TLTC).
   6. Plaats de verdunningen (0,1 ml) op geschikte mediaplaten, die de groei van het micro-organisme ondersteunen (bijv. TSA voor bacteriën of Sabouraud dextrose agar [SDA] voor schimmels) of media die de groei optimaliseren en een goed contrast bieden om de kolonietelling nauwkeurig te maken.
   7. Incubeer de bacterieplaten bij 35 °C gedurende 2 dagen en de schimmelplaten bij R/T gedurende 5 dagen.
   8. Tel de levensvatbare CFU's rechtstreeks met behulp van een kolonieteller of met behulp van beeldvormingssoftware (bijv. CFU AI).
   9. Bereken de microbiële logreductie (R) als gevolg van antimicrobieel weefsel met behulp van vergelijking (2):
      R = × 100 (2)
      A = logwaarde van het aantal CFU's dat uit onbehandeld weefsel is teruggewonnen; B = logwaarde van het aantal CFU's dat uit behandeld weefsel is teruggewonnen.

Resultaten

Eerste screening van de gesynthetiseerde NP's
Na de tweestaps olie-in-water emulsietechniek¹⁶ werden de bioactieve stoffen (carvacrol en thymol) met succes ingekapseld in chitosan. Dit werd bevestigd door UV-Vis-spectrofotometrie voor de piekabsorptie van de respectieve bioactieve verbindingen in vergelijking met controles, die de chitosan-NP's waren zonder bioactieve verbindingen. De gevormde NP's waren homogeen en stabiel gedurende 12 maanden bij 4 °C. De eerste screening va...

Discussie

De antimicrobiële werkzaamheid van biociden wordt conventioneel getest door middel van kwantitatieve assays, zoals minimale remmende concentratie (MIC) en minimale bacteriedodende concentratie (MBC), waarbij de bacteriën gedurende 24 uur worden ondergedompeld in een antimicrobiële vloeistof. Deze testen zijn echter niet geschikt voor gecoate weefsels, waarbij de vloeibare interface ontbreekt en de biociden langzaam langs de weefselvezels worden verspreid. Daarom zijn er veel standaard stoftests vastgesteld, zoals AATCC 1...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Azijnzuur	Millipore Sigma	64-19-7
Antibioticum basis-agar	BD Difco	DF0270-17-4	Ook bekend als Antibioticum Medium 2
Antibioticum zaai-agar	BD Difco	DF0263-17-3	Ook bekend als Antibioticum Medium 1
Bloed Agar (voedingsagar met 5% schapenbloed)	Gedoneerd door CFIA
Bromcresol Paars Lactose Agar	Gedoneerd door CFIA
Candida albicans	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 10231
Carvacrol	Millipore Sigma	282197 (CAS# 499-75-2)
Centrifuge  Allergra X-22R Centrifuge	Beckman Coulter	Model # X-22R	Gekoeld. Wacht minstens 20 min of tot de temperatuur de ingestelde lage waarde bereikt (bijv. 4 °C) omdat het koelen tijd kost.
Chitosan Medium Moleculair Gewicht (CS)	Millipore Sigma	448877 (CAS # 9012-76-4)
Clamshell Heat Press	Intiva	IM1200
Escherichia coli (E. coli)	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 23725
Incubator	Thermo Scientific	1205M34
Letheen Broth	BD Difco	DF0681-17-7	Wordt gebruikt om antimicrobiële effecten te neutraliseren. Product van verschillende fabrikanten kan vereisen om Polysorbaat 80 toe te voegen, dat al is toegevoegd in het Difco product.
Milli Q water	Millipore Sigma	ZR0Q16WW	De-geïoniseerd water
Mueller-Hinton Agar	BD Difco	DF0252-17-6
Penta-natriumtripolyfosfaat (TPP)	Millipore Sigma	238503 (CAS# 7758-29-4)
Phosphaat Buffered Saline (PBS)	Thermo Scientific	AM9624
Pseudomonas aeruginosa	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 9027
Sabouraud Dextrose Agar	BD Difco	DF0109-17-1
Schudende incubator/ Thermo shaker	VWR	Model # SHKA2000
Staphylococcus aureus	ATCC The Global Bioresource Center	ATTC 6538
Thymol	Millipore Sigma	T0501 (CAS# 89-83-8)
Trypticase Soy Agar	BD Difco	236950
Trypticase Soy Broth	BD Difco	215235
Tween 80	Millipore Sigma	STS0204 (CAS # 9005-65-6)
UV-Vis Spectrofotometer	Thermo Scientific	GENESYS 30 (840-277000)