De huidige studie biedt een aangepast protocol om synoviale macrofagen en fibroblasten te isoleren uit murine inflammatoire artritisweefsel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en kweek van primaire synoviale macrofagen en fibroblasten uit muizenartritisweefsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Reumatoïde artritis is een auto-immuunziekte die leidt tot chronische ontsteking van gewrichten. Synoviale macrofagen en synoviale fibroblasten spelen een centrale rol in de pathogenese van reumatoïde artritis. Het is belangrijk om de functies van beide celpopulaties te begrijpen om de mechanismen te onthullen die ten grondslag liggen aan pathologische progressie en remissie bij inflammatoire artritis. Over het algemeen moeten in vitro experimentele omstandigheden de in vivo omgeving zoveel mogelijk nabootsen. Primaire weefsel-afgeleide cellen zijn gebruikt in experimenten die synoviale fibroblasten bij artritis karakteriseren. Daarentegen zijn in experimenten die de biologische functies van macrofagen bij inflammatoire artritis onderzoeken, cellijnen, van beenmerg afgeleide macrofagen en van bloedmonocyten afgeleide macrofagen gebruikt. Het is echter onduidelijk of dergelijke macrofagen daadwerkelijk de functies van weefselresidente macrofagen weerspiegelen. Om residente macrofagen te verkrijgen, werden eerdere protocollen aangepast om zowel primaire macrofagen als fibroblasten uit synoviaal weefsel te isoleren en uit te breiden in een inflammatoir artritismuismodel. Deze primaire synoviale cellen kunnen nuttig zijn voor in vitro analyse van inflammatoire artritis.
Inleiding
Reumatoïde artritis (RA) is een auto-immuunziekte die wordt gekenmerkt door hyperplasie van het synovium, wat leidt tot gewrichtsvernietiging 1,2. Weefsel-residente macrofagen en fibroblasten zijn aanwezig in gezond synovium om de gezamenlijke homeostase te behouden. Bij RA-patiënten prolifereren synoviale fibroblasten (SF's) en infiltreren immuuncellen, waaronder monocyten, in het synovium en gewrichtsvloeistof, processen geassocieerd met ontsteking 1,3,4. Synoviale macrofagen (SM's), waaronder residente macrofagen en van perifere bloedmonocyten afgeleide macrofagen, en SF's worden afwijkend geactiveerd en hebben een belangrijke rol in de pathogenese van RA. Recente studies hebben gesuggereerd dat cel-cel interacties tussen SM's en SF's bijdragen aan zowel de exacerbatie als de remissie van RA 5,6.
Om RA-pathogenese te begrijpen, zijn verschillende knaagdiermodellen van inflammatoire artritis gebruikt, waaronder K / BxN-serumtransferartritis, collageen-geïnduceerde artritis en collageenantilichaam-geïnduceerde artritis. Celgebaseerde assays zijn over het algemeen nodig om moleculaire functies bij artritis te verduidelijken. Daarom zijn primaire cellen uit diermodellen van artritis geïsoleerd. De methode om SF's te isoleren uit muizenartritisweefsel is goed ingeburgerd en deze cellen hebben bijgedragen aan de opheldering van moleculaire mechanismen in artritispathogenese 7,8. Aan de andere kant zijn van beenmerg afgeleide macrofagen, van bloedmonocyten afgeleide macrofagen en macrofaagcellijnen vaak gebruikt als macrofaagbronnen voor artritisstudies 9,10. Omdat macrofagen functies kunnen verwerven die verband houden met hun micro-omgeving, kunnen algemene bronnen van macrofagen reacties missen die specifiek zijn voor artritisweefsel. Bovendien is het moeilijk om voldoende synoviale cellen te verkrijgen door te sorteren, omdat muizensynovium een zeer klein weefsel is, zelfs in artritismodellen. Het gebrek aan gebruik van synoviale macrofagen voor in vitro studies is een beperking geweest in artritisstudies. De vaststelling van een protocol om synoviale macrofagen te isoleren en uit te breiden zou een voordeel zijn voor de opheldering van pathologische mechanismen bij RA.
Bij de vorige methode om SF's te isoleren, werden SM's weggegooid7. Daarnaast werd een methode gemeld om residente macrofagen uit sommige organen te isoleren en uit te breiden11. Daarom werden bestaande protocollen in combinatie aangepast. De modificatie is gericht op het bereiken van de primaire cultuur van zowel SM's als SF's met een hoge zuiverheid. Het algemene doel van deze methode is om zowel SM's als SF's uit muizenartritisweefsel te isoleren en uit te breiden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Experimenten met dieren werden goedgekeurd door het Animal Experiment Committee van Ehime University en werden uitgevoerd in overeenstemming met de Ehime University Guidelines for Animal Experiments (37A1-1 * 16).
1. Bereiding van instrumenten, reagentia en kweekmedium
- Bereid het kweekmedium als volgt voor: vul Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotische antimycotische oplossing (anti-anti).
- Bereid het verteringsmedium als volgt voor: vul het kweekmedium aan met 1 mg/ml collagenase type IV. Pas de collagenaseconcentratie vlak voor gebruik aan.
- Verdun type I-C collageen tot een concentratie van 0,15 mg/ml met 1 mM HCl oplossing. Overspoel cultuurschalen (diameter van 40 of 60 mm) met de verdunde collageenoplossing. Verwijder na 6-12 uur bij kamertemperatuur de collageenoplossing uit de gerechten en droog op kamertemperatuur. De met collageen omhulde gerechten kunnen minstens 1 week op kamertemperatuur worden bewaard. Was de voorgecoate vaat voor gebruik met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of medium.
- Bereid steriele chirurgische instrumenten voor, zoals een schaar, een pincet met gekartelde uiteinden en een pincet met fijne punt. Week voor gebruik in 70% ethanol.
2. Bereiding van synovitisweefsel bij muizen ( figuur 1A)
- Bereid een muis voor met inflammatoire artritis in de achterpoten.
OPMERKING: Vrouwelijke C57BL/6-muizen (18-20 g), 7-8 weken postnataal, met collageenantilichaam-geïnduceerde artritis (CAIA) of K/BxN serumtransferartritis (STA) werden gebruikt voor dit protocol8. Het isoleren van SM's uit niet-gezwollen (d.w.z. gezond) weefsel kan moeilijk zijn, omdat het aantal cellen onvoldoende is. - Verdoof de muizen door een intraperitoneale injectie van 80 mg/kg ketamine en 16 mg/kg xylazine. Reinig de muizen met 70% ethanol.
- Knip het borstgebied open met een schaar om het hart bloot te leggen. Knip de rechter oorschelp van het hart met een schaar en steek vervolgens een vlindernaald van 23 G in de linkerkamer via de top van het hart, gevolgd door een reflux van 15-20 ml steriele PBS met behulp van een spuit om handmatig perifeer bloed te verwijderen (ongeveer 1 ml / 2 s).
- Versier de achterpoten door de huid te knippen met een schaar en aan de huid te trekken met een pincet met gekartelde uiteinden.
OPMERKING: Na deze stap wordt het gebruik van een pincet aanbevolen voor het hanteren van monsters. Raak geen versierd weefsel aan met de vingers, om de aanhechting van murine haar te voorkomen. - Dislocatie de metatarsofalangeale gewrichten door te trekken, gevolgd door het snijden van de ligamenten van de gewrichten met een schaar om de tenen te verwijderen.
- Knip de pezen van de onderbeenspieren bij de enkel door met een schaar. Pak de pees vast met een pincet en pel de spieren proximaal in het onderbeen om het scheenbeen bloot te leggen. Verwijder het kuitbeen.
- Ontwricht het kniegewricht door te trekken, gevolgd door het doorsnijden van de ligamenten van de gewrichten met een schaar om het scheenbeen los te maken met de gezwollen achterpoot. Bewaar de monsters in ijskoud kweekmedium (0,3 ml/cm2) tot de verwerking tot stap 3.1.
3. Vertering van synovitisweefsel ( figuur 1B)
- Zuig het kweekmedium op, vermijd het monster en voeg vervolgens vers kweekmedium toe (0,3 ml/cm2). Herhaal het wasproces drie of vier keer.
OPMERKING: Vanaf deze stap moet de behandeling van monsters aseptisch worden uitgevoerd in een schone bank of veiligheidskast. - Ontwricht alle gewrichten van de monsters door met een fijnpuntpincet in het kweekmedium onder een stereomicroscoop (bij 10x-20x vergroting) te trekken. Een fijnpuntpincet is handig in deze stap. Verwijder het scheenbeen en zoveel mogelijk vaten, pezen en ligamenten. Pas op dat u de botten niet breekt bij het ontwrichten.
- Bereid twee buisjes van 15 ml per monster voor. Breng de ontwrichte botten met zachte weefsels over naar de eerste buis van 15 ml met een pincet. Voeg 4 ml verteringsmedium per monster, verkregen uit beide achterpoten, toe aan de buis.
- Om resterende cellen en weefselfragmenten te verzamelen, brengt u het medium waarin het monster zich bevond over naar de tweede buis van 15 ml. Centrifugeer het medium op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Na het verwijderen van het supernatant, resuspensie de pellet met 1 ml verteringsmedium en breng de cel- en weefselfragmentoplossing over naar de eerste buis van 15 ml met bijna al het weefsel (in totaal 5 ml verteringsmedium / achterpoten).
- Verwerk het monster gedurende 60-120 minuten bij 37 °C met schudden in een hybridisatieoven.
OPMERKING: De optimale tijd om de monsters te verteren moet worden bepaald. De tijd is afhankelijk van de mate van zwelling in de enkels en collagenasen. In de meeste gevallen is 60-120 min voldoende. Verzamel na 60 minuten incubatie een deel van het verteerde monster door pipetteren en observeer onder een microscoop. Als de spijsvertering onvoldoende is, moet de incubatie doorgaan en moet de spijsvertering elke 30 minuten worden gecontroleerd. - Pipetteer de oplossing goed. Filter de celoplossing door een celzeef (poriegrootte van 40 μm) tot een buis van 50 ml.
- Voeg 10 ml kweekmedium toe aan de buis van 50 ml door de celzeef. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Na het verwijderen van het supernatant, resuspendeerde met 10 ml kweekmedium. Herhaal de centrifugatie. Na het verwijderen van het supernatant, resuspendeerde met 2 ml kweekmedium.
Figuur 1: Procedure voor bemonstering van muizenartritisweefsel en collagenasevertering . (A) (i) Muriene achterpoot met inflammatoire artritis. ii) Verwijdering van de huid op de achterpoot. iii) Dislocatie van de metatarsofalangeale gewrichten en verwijdering van de tenen. iv) Doorsnijden van de pezen in de enkel. (v) Verwijdering van de spieren in de onderbenen. (vi) Dislocatie van het kniegewricht. b) links; Uitgesneden benen in kweekmedium. Rechts; ontwrichte tarsus en metatarsus in kweekmedium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Isolatie van synoviale fibroblasten ( figuur 2A)
- Zaai alle celsuspensies verkregen uit beide enkels op de met collageen bedekte schaal.
OPMERKING: Als u enkels met zwakke of matige zwelling gebruikt om de cellen te verkrijgen, wordt een schaal met een diameter van 40 mm aangebracht. De met collageen gecoate schotelgrootte kan worden gewijzigd in een schaal met een diameter van 60 mm als beide enkels ernstige zwelling hebben. - Voeg kweekmedium toe (ongeveer 222 μL/cm2). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
- Verzamel niet-hechtende cellen met behulp van een pipet (gebruik in stap 5.1). Was de met collageen bedekte schaal met kweekmedium en verzamel het medium. Kweek de aanhangende cellen in vers medium (figuur 2B,i). De meeste cellen die zich snel hechten aan de met collageen bedekte schaal vertonen een fibroblastoïde (spindelvormige) morfologie.
- Passage sub-confluente cellen door behandeling met 0,05% trypsine in Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS). Bij deze methode is de besmetting van andere cellen beperkt, zelfs als het in de eerste expansie is. Als meer gezuiverde fibroblastachtige cellen nodig zijn, voer dan herhaalde passaging uit om de zuiverheid te verbeteren; de uitbreiding van het cytoplasma van de cellen in adhesie wordt echter ook waargenomen (figuur 2B,ii). Omdat overmatige passages het verlies van naïeve kenmerken in de cellen beïnvloeden, gebruikt u cellen met minder dan 5 passages.
5. Isolatie van synoviale macrofagen ( figuur 2A)
- Zaai alle niet-hechtende cellen uit stap 4.4 uit op schalen (diameter van 40 of 60 mm) die niet met collageen zijn bedekt.
OPMERKING: Niet-adherente cellen omvatten macrofagen, andere lymfocyten en resterende fibroblasten uit synovitisweefsel. - Kweek de bulkcellen gedurende 1 dag bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2.
- Om niet-aanhangende lymfocyten te verwijderen, zuigt u het gekweekte medium op en voegt u vervolgens vers kweekmedium toe. Herhaal dit proces twee of drie keer (figuur 2B,iii).
- Kweek de aanhangende bulkcellen gedurende 1-2 weken in kweekmedium, met mediumwisselingen om de 2 dagen met behoud van confluentie (figuur 2B, iv).
OPMERKING: Het aantal SM's neemt langzaam toe onder co-cultuur omstandigheden met SF's. Daarom moet de co-cultuurperiode indien nodig worden aangepast. - Twee keer wassen met PBS of HBSS. Behandel met 0,05% trypsine in HBSS (ongeveer 55 μL/cm 2) gedurende 3 minuten bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2. Fibroblasten maken zich gemakkelijk los van de kweekschaal door trypsinebehandeling en macrofagen vertonen resistentie tegen trypsinebehandeling. Gebruik deze eigenschap voor de selectie van synoviale macrofagen.
- Voeg kweekmedium (ongeveer 222 μL/cm2) voorzichtig toe aan 0,05% trypsine in HBSS. Giet het medium na deze stap niet rechtstreeks op de cellen.
- Om losgemaakte cellen te verwijderen, zuigt u het gekweekte medium op en voegt u vervolgens voorzichtig vers kweekmedium toe. Herhaal dit proces twee of drie keer. Bewaar de resterende cellen op de schaal in vers kweekmedium tot gebruik (figuur 2B,v).
OPMERKING: Na behandeling met trypsine vertonen aanhangende cellen macrofaagachtige morfologische kenmerken.
Figuur 2: Scheiding van macrofaagrijke en fibroblastrijke fracties van inflammatoir artritisweefsel. (A) Schema van de procedure om macrofaagrijke en fibroblastrijke cellen te scheiden van artritisweefsel. (B) Representatieve fasecontrastbeelden van fasen van de procedure, (i) tot en met (v) in figuur 2A. De schaalbalk vertegenwoordigt 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vrouwelijke C57BL / 6-muizen op de leeftijd van 7-8 weken ondergingen collageenantilichaam-geïnduceerde artritis. Macrofaagachtige cellen en fibroblastachtige cellen werden onafhankelijk geïsoleerd uit inflammatoir artritisweefsel volgens de hierboven beschreven procedure (figuur 2A, B). Macrofaagachtige cellen werden onmiddellijk gebruikt na stap 5.7. Fibroblastachtige cellen werden aanvankelijk gekweekt om sub-confluent te zijn na stap 4.4, en vervolgens overgegaan naar ee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze hier ontwikkelde methode verbetert eerdere technieken voor het isoleren van zowel SF's van muizenartritis als residente macrofagen van een aantal organen 7,11. De gemodificeerde methode kan zowel macrofagen als fibroblasten isoleren van inflammatoir synovium met een hoge zuiverheid, en het is eenvoudig en reproduceerbaar. Omdat de methode geen complexe instrumenten zoals een celsorteerder vereist, kan iedereen het uitvoeren. Bovendien vermijdt de huidige tec...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken het personeel van de afdeling Medical Research Support, het Advanced Research Support Center (ADRES) en de leden van de afdeling Integratieve Pathofysiologie, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, voor hun technische assistentie en nuttige ondersteuning. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-subsidies JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (aan NS) en JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (aan YI); subsidies van de Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (aan NS); en een Takeda Science Foundation Medical Research-beurs, UCB Japan (UCBJ) projectsubsidie en de JSBMR Frontier Scientist-beurs 2019 (aan YI).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA-oplossing | nacalai tesque | 35556-44 | Verdund met HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterflynaald | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Celzeef | Falcon | 352340 | 40 µm poriën, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collageen |
| Centrifugebuis 15 | TPP | 91014 | 15 mL buis |
| Centrifugebuis 50 | TPP | 91050 | 50 mL buis |
| Collagenase uit C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Foetaal bovien serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Hitte-inactivatie werd uitgevoerd |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Schaar | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Weefselkweekschaal 40 | TPP | 93040 | Voor celkweek |
| Weefselkweekschaal 60 | TPP | 92006 | Voor celkweek |
| Pincet | KFI | 1-9749-31 | Fijnpunt |
| Pincet | Bio Research Center | PRI28-1522 | Gekartelde punt |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscoop |
Referenties
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188(2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083(2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34(2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618(2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
