Methodenartikel

Analyse van fluorescerend gekleurde lipidedruppels met 3D-reconstructie voor hepatische steatosebeoordeling

7.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65206

⸱

2 juni 2023

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmacology & Experimental Therapeutics & Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR), Faculty of Medicine, University of Coimbra, 2Center for Innovative Biomedicine and Biotechnology (CIBB), University of Coimbra, 3Clinical Academic Center of Coimbra (CACC), 4Polytechnic Institute of Coimbra, Coimbra Health School

In dit artikel

Samenvatting

Hierin demonstreren we een geoptimaliseerd BODIPY 493/503 fluorescentie-gebaseerd protocol voor lipidedruppelkarakterisering in leverweefsel. Door het gebruik van orthogonale projecties en 3D-reconstructies maakt de fluorofoor een succesvolle discriminatie tussen microvesiculaire en macrovesiculaire steatose mogelijk en kan het een complementaire benadering zijn van de klassieke histologische protocollen voor de beoordeling van leversteatose.

Samenvatting

Lipidedruppeltjes (LDs) zijn gespecialiseerde organellen die lipidenopslag bemiddelen en een zeer belangrijke rol spelen bij het onderdrukken van lipotoxiciteit en het voorkomen van disfunctie veroorzaakt door vrije vetzuren (VA's). De lever, gezien zijn cruciale rol in het vetmetabolisme van het lichaam, wordt aanhoudend bedreigd door de intracellulaire accumulatie van LDs in de vorm van zowel microvesiculaire als macrovesiculaire hepatische steatose. De histologische karakterisering van LDs is meestal gebaseerd op lipide-oplosbare diazokleurstoffen, zoals Oil Red O (ORO) kleuring, maar een aantal nadelen belemmeren consequent het gebruik van deze analyse met levermonsters. Meer recent zijn lipofiele fluoroforen 493/503 populair geworden voor het visualiseren en lokaliseren van LDs vanwege hun snelle opname en accumulatie in de neutrale lipidedruppelkern. Hoewel de meeste toepassingen goed beschreven zijn in celculturen, is er minder bewijs dat het betrouwbare gebruik van lipofiele fluorofore sondes als LD-beeldvormingsinstrument in weefselmonsters aantoont. Hierin stellen we een geoptimaliseerd boordipyrrometheen (BODIPY) 493/503-gebaseerd protocol voor de evaluatie van LDs in levermonsters voor uit een diermodel van vetrijk dieet (HFD) -geïnduceerde hepatische steatose. Dit protocol heeft betrekking op levermonstervoorbereiding, weefselsectie, BODIPY 493/503-kleuring, beeldacquisitie en gegevensanalyse. We tonen een verhoogd aantal, intensiteit, oppervlakteverhouding en diameter van lever-LDs bij HFD-voeding. Met behulp van orthogonale projecties en 3D-reconstructies was het mogelijk om de volledige inhoud van neutrale lipiden in de LD-kern te observeren, die als bijna bolvormige druppels verschenen. Bovendien konden we met de fluorofoor BODIPY 493/503 microvesicles (1 μm < d ≤ 3 μm), tussenblaasjes (3 μm < d ≤ 9 μm) en macrovesicles (d > 9 μm) onderscheiden, waardoor de succesvolle discriminatie van microvesiculaire en macrovesiculaire steatose mogelijk werd. Over het algemeen is dit op fluorescentie gebaseerde protocol van BODIPY 493/503 een betrouwbaar en eenvoudig hulpmiddel voor LD-karakterisering in de lever en kan het een complementaire benadering zijn van de klassieke histologische protocollen.

Inleiding

Lipidedruppels (LDs), klassiek gezien als energiedepots, zijn gespecialiseerde cellulaire organellen die lipidenopslag bemiddelen, en ze omvatten een hydrofobe neutrale lipidekern, die voornamelijk cholesterolesters en triglyceriden (TG's) bevat, ingekapseld door een fosfolipide monolaag 1,2,3.

LD-biogenese vindt plaats in het endoplasmatisch reticulum (ER), te beginnen met de synthese van triacylglycerol (TAG) en sterolesters. Neutrale lipiden worden in lage concentraties verspreid tussen de blaadjes van de ER-dubbellaag, maar smelten samen tot olielenzen die groeien en toppen tot bijna bolvormige druppels van het ER-membraan wanneer hun intracellulaire concentratie toeneemt4. Vervolgens transloceren eiwitten uit de ER-dubbellaag en cytosol, met name de perilipine (PLIN) eiwitfamilie, naar de oppervlakken van de LDs omontluiking 5,6,7,8,9 te vergemakkelijken.

Door nieuwe vetzuursynthese en LD-fusie of coalescentie groeien LD's in verschillende groottes. Dienovereenkomstig verschillen de grootte en het aantal LD's aanzienlijk tussen verschillende celtypen. Kleine druppeltjes (300-800 nm diameter), die bekend staan als initiële LDs (iLDs), kunnen door bijna alle cellen worden gevormd4. Later in LD-vorming zijn de meeste cellen in staat om sommige iLDs om te zetten in grotere LDs (eLDs >1 μm in diameter). Toch hebben alleen specifieke celtypen, zoals adipocyten en hepatocyten, de capaciteit om gigantische of supersized LDs te vormen (tot tientallen microns in diameter)4,10.

LDs spelen een zeer belangrijke rol bij de regulatie van cellulair lipidenmetabolisme, het onderdrukken van lipotoxiciteit en het voorkomen van ER-stress, mitochondriale disfunctie en, uiteindelijk, celdood veroorzaakt door vrije vetzuren (FAs)11,12,13,14. Bovendien zijn LDs ook betrokken bij de regulatie van genexpressie, virale replicatie-eiwitsekwestratie en membraanhandel en signalering15,16,17. Daarom is de misregulatie van LD-biogenese een kenmerk van chronische ziekten geassocieerd met metabool syndroom, obesitas, type 2 diabetes mellitus (T2DM) en / of aderverkalking, om er maar een paar te noemen18,19,20.

De lever, als een metabole hub, is meestal verantwoordelijk voor het lipidenmetabolisme door lipiden op te slaan en te verwerken, en daarom wordt het voortdurend bedreigd door lipotoxiciteit21. Hepatische steatose (HS) is een gemeenschappelijk kenmerk van een reeks progressieve leverziekten en wordt gekenmerkt door overmatige intracellulaire lipideaccumulatie in de vorm van cytosolische LDs die uiteindelijk kunnen leiden tot leverstofwisselingsstoornissen, ontsteking en geavanceerde vormen van niet-alcoholische leververvetting22,23,24,25. HS treedt op wanneer de snelheid van vetzuuroxidatie en export als triglyceriden in lipoproteïnen met zeer lage dichtheid (VLDL's) lager is dan de snelheid van opname van levervetzuren uit het plasma en de novo vetzuursynthese26. De hepatische accumulatie van lipiden komt vaak voor in twee vormen - microvesiculaire en macrovesiculaire steatose - en deze vertonen verschillende cytoarchitectonische kenmerken27. Typisch wordt microvesiculaire steatose gekenmerkt door de aanwezigheid van kleine LDs verspreid over de hepatocyt met de kern centraal geplaatst, terwijl macrovesiculaire steatose wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van een enkele grote LD die het grootste deel van de hepatocyt bezet, waardoor de kern naar de periferie wordt geduwd28,29. Met name deze twee soorten steatose worden vaak samen gevonden, en het blijft onduidelijk hoe deze twee LD-patronen de pathogenese van de ziekte beïnvloeden, omdat het bewijs nog steeds inconsistent is31,32,33,34. Toch wordt een dergelijk type analyse vaak gebruikt als een "referentiestandaard" in preklinische en klinische studies om het dynamische gedrag van LDs te begrijpen en hepatische steatose te karakteriseren 29,34,35,36.

Leverbiopten, de gouden standaard voor het diagnosticeren en beoordelen van HS, worden routinematig beoordeeld door histologische hematoxyline en eosine (H &E) analyse, waarbij lipidedruppels worden geëvalueerd als niet-gekleurde vacuolen in H & E-gekleurde leversecties37. Hoewel acceptabel voor macrovesiculaire steatose-evaluatie, beperkt dit type kleuring over het algemeen de beoordeling van microvesiculaire steatose38. Lipide-oplosbare diazokleurstoffen, zoals Oil Red O (ORO), worden klassiek gecombineerd met brightfieldmicroscopie om intracellulaire lipidenvoorraden te analyseren, maar deze hebben nog steeds een aantal nadelen: (i) het gebruik van ethanol of isopropanol in het kleuringsproces, wat vaak de verstoring van de inheemse LDs en occasionele fusie veroorzaakt, ondanks dat de cellen worden gefixeerd39; ii) het tijdrovende karakter, aangezien de ORO-oplossing vanwege de beperkte houdbaarheid moet worden opgelost en gefiltreerd door vers poeder, wat bijdraagt tot minder consistente resultaten; (iii) en het feit dat ORO meer kleurt dan alleen lipidedruppeltjes en vaak hepatische steatose overschat38.

Bijgevolg zijn celdoorlatende lipofiele fluoroforen, zoals Nile Red, gebruikt in levende of vaste monsters om enkele van de bovengenoemde beperkingen te overwinnen. De niet-specifieke aard van cellulaire lipideorganeletikettering vernauwt echter herhaaldelijk LD-beoordelingen40. Bovendien variëren de spectrale eigenschappen van Nijlrood afhankelijk van de polariteit van de omgeving, wat vaak kan leiden tot spectrale verschuivingen41.

De lipofiele fluorescerende sonde 1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4adiaza-s-indaceen (excitatiegolflengte: 480 nm; emissiemaximum: 515 nm; BODIPY 493/503) vertoont hydrofobiciteitskenmerken die een snelle opname door intracellulaire LDs mogelijk maken, zich ophopen in de lipidedruppelkern en vervolgens heldergroene fluorescentie uitzenden12. In tegenstelling tot Nile Red is BODIPY 493/503 ongevoelig voor de omgevingspolariteit en is aangetoond dat het selectiever is, omdat het een hoge helderheid weergeeft voor LD-beeldvorming. Om neutrale LDs te kleuren, kan deze kleurstof worden gebruikt in levende of vaste cellen en met succes worden gekoppeld aan andere kleurings- en / of etiketteringsmethoden42. Een ander voordeel van de kleurstof is dat het weinig moeite kost om in een oplossing te plaatsen en stabiel is, waardoor het niet nodig is om het voor elk experiment vers te bereiden42. Hoewel de BODIPY 493/503-sonde met succes is gebruikt om de lokalisatie en dynamiek van LDs in celculturen te visualiseren, hebben sommige rapporten ook het betrouwbare gebruik van deze kleurstof aangetoond als een LD-beeldvormingstool in weefsels, waaronder de menselijke vastus lateralis-spier43, de rat soleus-spier 42 en de muizendarm44.

Hierin stellen we een geoptimaliseerd BODIPY 493/503-gebaseerd protocol voor als een alternatieve analytische benadering voor de evaluatie van het LD-aantal, het gebied en de diameter in levermonsters van een diermodel van leversteatose. Deze procedure omvat de voorbereiding van levermonsters, weefselsecties, kleuringscondities, beeldacquisitie en gegevensanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door het Coimbra Institute for Clinical and Biomedical Research (iCBR) Animal Welfare Body (ORBEA, # 9/2018) en voldeden aan de nationale en Europese richtlijnen voor dierenverzorging en aan de ARRIVE-richtlijnen.

1. Experimenteel ontwerp

  1. Paarhuis 13 weken oude mannelijke Wistar-ratten in geventileerde kooien onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden van temperatuur (22 °C ± 1 °C), vochtigheid (50% -60%) en licht (12 uur licht-donkercyclus) en met ad libitum toegang tot leidingwater en standaard knaagdier chow.
  2. Na een periode van 2 weken acclimatisatie, willekeurig toewijzen van de ratten in twee groepen.
  3. Voed de controlegroepen (CTRL, n = 6) en vetrijke dieetgroepen (HFD, n = 6) met respectievelijk standaard chow en een vetrijk dieet (45% kcal / vet), gedurende 24 weken.
  4. Controleer het lichaamsgewicht (BW) wekelijks. Noteer de voedsel- en drankconsumptie dagelijks per kooi.

2. Voorbereiding van het levermonster

  1. Leverdissectie
    1. Bereid de peristaltische pomp voor: Laat 70% ethanol door de slang lopen, sluit een naald van 27 G aan op het uitlaatuiteinde van de slang en bereid de slang voor met ijskoude (4 ° C) 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH ~ 7,4 ) (bijv. 200 tpm op een peristaltische pomp met 1,6 mm I.D. siliciumbuis, IV mini-druppelset). Pas het lichaamsgewicht aan (gebruik bijvoorbeeld voor een rat van 100-150 g een stroomsnelheid van ongeveer 10-12 ml / min).
    2. Verdoof de rat door een intraperitoneale injectie met behulp van een anesthesieprotocol (de uiteindelijke concentratie ketamine = 75 mg / kg en de uiteindelijke concentratie van medetomidine = 1 mg / kg).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de rat volledig verdoofd is met behulp van de teenknijpreactiemethode.
    3. Plaats de rat op de snijbak.
    4. Ontsmet de vacht grondig met 70% ethanol en droog het af met een papieren handdoek.
    5. Maak met een schaar een "U"-vormige incisie door de huid en knip open onder het middenrif. Snijd vervolgens de ribbenkast rostral aan de randen om het hart bloot te leggen.
    6. Terwijl de 1x PBS loopt, passeert u de naald door de linker ventrikel in de opgaande aorta en klemt u. Vervolgens wordt het rechter atrium gesneden om drainage mogelijk te maken zodra de perfusie is begonnen.
      OPMERKING: De lever moet beginnen te blancheren als bloed wordt vervangen door PBS.
    7. Verwijder met een schaar en Dumont-tang de lever voorzichtig en spoel af met 1x PBS.
    8. Breng de lever over op een petrischaaltje en weeg het.
    9. Verzamel met behulp van een scalpel leverweefselmonsters van 5 mm dikte vanaf de laterale zijde (1 cm van de rand) van de linkerkwab van de lever voor het inbeddingsproces.
      OPMERKING: Het resterende weefsel kan worden bewaard bij −80 °C voor langdurige opslag.
  2. Inbedding van leverweefsel
    1. Bereid een droogijscontainer voor en label cryomolds op de juiste manier met de monster-ID en oriëntatie.
    2. Plaats een paar druppels cryo-inbeddingsmatrix op het midden van de cryomold om de optimale snijtemperatuur (OCT) te maken.
    3. Zorg ervoor dat het weefselmonster goed is georiënteerd voor een dwarsdoorsnede.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de kant die de onderkant van de cryomold raakt, de kant is die als eerste wordt gesneden.
    4. Laat voorzichtig meer OCT op de cryomold vallen totdat deze volledig bedekt is. Probeer de vorming van luchtbellen te voorkomen. Verwijder indien nodig met een gewone tang eventuele bubbels in de LGO.
    5. Plaats de cryomold met het met OCT bedekte monster snel in een droogijscontainer.
      OPMERKING: De weefsels kunnen gedurende 3 jaar bij −80 °C worden bewaard.

3. Bevroren weefselsectie

  1. Pas de cryostaattemperatuur aan (kamer: −21 °C; monster: −18 °C) en plaats een nieuw steriel mesje.
  2. Plaats de monsters gedurende 30 minuten in de cryostaat voordat u de temperatuur in evenwicht laat.
  3. Maak een enkele laag OCT op de monsterschijf om de hechting van het monster mogelijk te maken. Laat het OCT bevriezen en monteer het weefselmonster in de gewenste richting.
    OPMERKING: Het snijoppervlak moet evenwijdig zijn aan het mes. Om een goede hechting te behouden, plaatst u de warmteafzuiger op de bovenkant van het monster. De voorgaande stappen kunnen ook worden uitgevoerd in een droogijscontainer met droogijs.
  4. Plaats het monster in de kop van het monster en snijd het oppervlak van het weefsel bij (enkele weefselmonstersecties van 30 μm).
  5. Zodra het gebied van belang toegankelijk is voor secties, snijdt u 12 μm dikke secties en plaatst u ze op gelabelde microscoopglaasjes die op kamertemperatuur (RT) worden bewaard.
    OPMERKING: Als u de sectie wilt verzamelen, verplaatst u de dia langzaam naar de weefselsectie. Elke dia kan twee leversecties verzamelen.
  6. Laat de dia's 10 minuten drogen bij RT.
    OPMERKING: De platen kunnen worden bewaard bij −20 °C gedurende 6-12 maanden of bij −80 °C gedurende maximaal 3 jaar.

4. BODIPY kleuring

  1. Ontdooi de dia's in een schuifkleuringssysteem bij RT gedurende 30 minuten.
  2. Wassen met 1x PBS (3x gedurende 5 min elk).
  3. Omcirkel het gedeelte met een hydrofobe laag met behulp van een barrièrepen.
  4. Bereid 500 μg/ml BODIPY 493/503 stockoplossing: Los 1 mg BODIPY 493/503in 2 ml oplosmiddel op (90% DMSO; 10% 1x PBS). Bescherm tegen licht. Soniceer in een ultrasoon bad gedurende 1 uur (9,5-10 W) bij 37 ° C.
    OPMERKING: De oplossing kan gedurende ten minste 30 dagen bij −20 °C worden bewaard.
  5. Bereid de BODIPY-kleuringsoplossing (1 μg/ml) door 2 μl BODIPY 493/503-stamoplossing en 0,1 μl DAPI-stamoplossing (5 mg/ml) toe te voegen aan 997,9 μl 1x PBS.
  6. Incubeer de dia's (75 μL/slide) met BODIPY 493/503 (1 μg/ml) en DAPI (0,1 μg/ml) bij RT gedurende 40 min.
    OPMERKING: Houd de dia's vanaf deze stap in het donker.
  7. Was de dia's met 1x PBS (3x gedurende 5 min elk).
  8. Monteer de dia's met coverslips met behulp van een fluorescentiebevestigingsmedium, laat ze 30 minuten drogen en sluit ze af met nagellak.
    OPMERKING: De dia's kunnen worden bewaard bij 4 °C tot beeldvorming.

5. Kwantificering van lipiden

  1. Meet het totale cholesterol- en TG-gehalte in het serum met behulp van een automatische, gevalideerde methode en apparatuur.
  2. Meet de lever-TG-niveaus met behulp van een colorimetrische testkit voor triglyceriden (materiaaltabel) volgens het protocol van de fabrikant.

6. Beeldacquisitie

  1. Plaats de dia op de laserscanning confocale microscoopplaathouder.
  2. Gebruik voor beeldvisualisatie en -acquisitie een confocale microscoop met een 20x objectieflens (plan-apochromaat: 20x/0,8).
  3. Om cross-talk tussen de BODIPY 493/503 en DAPI te voorkomen, gebruikt u de sequentiële (beste signaal) scanmodus op de confocale software.
  4. Prikkel de BODIPY 593/503 met behulp van de 488 nm argonlaserlijn en de DAPI met behulp van de 405 nm laserlijn. Stel de emissiebereiken in op 493-589 nm voor BODIPY 493/503 en op 410-464 nm voor DAPI.
  5. Gebruik de volgende instellingen: pinhole: 1 AU, resolutie: 1.024 pixels x 1.024 pixels, bitdiepte: 12, pixelgrootte: 0,415 μm, bidirectionele modus, scansnelheid: 7 (~1,58 μs/pixel voor een 20x-objectief), lijngemiddelde: 2x en digitale zoom: 1.
    OPMERKING: De bovengenoemde scanparameters moeten worden geoptimaliseerd voor elke confocale microscoop en elk objectief dat wordt gebruikt.
  6. Stel de versterking en digitale versterking op de juiste manier in, zodat er geen verzadigde pixels worden gedetecteerd op de bereikindicator.
    OPMERKING: Corrigeer het achtergrondsignaal door de offset aan te passen.
  7. Zodra de LDs correct zijn geïdentificeerd, verkrijgt u de afbeelding met de BODIPY- en DAPI-kanalen.
    OPMERKING: Alle foto's moeten worden gemaakt in dezelfde omstandigheden (belichting en algemene instellingen) voor elk kleurkanaal.
  8. Als u wide-area images wilt maken (Afbeelding 2), wijzigt u het objectief in een a10x objectieflens (plan-neofluar: 10x/0.3).
  9. Selecteer Tegelscanmodus en maak mozaïeken van 5 per 5 afbeeldingen.
    OPMERKING: In dit werk had elke tegel een overlap van 10% om de tegels op de juiste manier samen te voegen voor analyse.
  10. Om 3D- en orthogonale weergaven te maken (figuur 3A), plaatst u een druppel onderdompelingsolie op de bovenkant van het afdekglas en wijzigt u het objectief in een 40x objectieflens (plan-neofluar: 40x/1,30 olie).
  11. Selecteer de Z-Stack-modus en door het Z-vlak aan te passen, definieert u de eerste en laatste posities voor acquisitie met een optische plak met een optimale dikte (~ 0,5 μm) om ervoor te zorgen dat alle druppels worden opgevangen.
    OPMERKING: Om de beeldacquisitie te versnellen en bleken te voorkomen, kan het optische segment worden aangepast aan een suboptimale grootte, waardoor ten minste 30% oversampling wordt gegarandeerd voor een goede 3D-reconstructie.
  12. Selecteer de module Ortho en maak orthogonale weergaven.
  13. Verkrijg 3D-beelden door de 3D-module te selecteren volgens de transparantieweergavemodus met de confocale microscoopsoftware.

7. Analyse van beelden

  1. Verwerk en analyseer de single-plane beelden (20x vergroting) met CellProfiler (versie 4.2.5).
    OPMERKING: De pijplijn die in dit werk werd gebruikt, is aangepast van Adomshick et al.45.
  2. Klik op de module Afbeeldingen in de linkerbovenhoek van het CellProfiler-venster en upload de afbeeldingen als .tiff bestanden.
  3. Gebruik de module NamesAndTypes om te sorteren tussen BODIPY- (druppel) en DAPI- (kernen) gekleurde afbeeldingen op basis van de bestandsnamen. Voer de LD-analyse alleen uit met BODIPY-gekleurde afbeeldingen.
  4. Om de pijplijnconstructie te starten, klikt u op Modules aanpassen en selecteert u de module ColorToGray om de afbeeldingen om te zetten in grijswaardenafbeeldingen.
    OPMERKING: Om objecten te identificeren, zijn grijswaardenafbeeldingen vereist.
  5. Identificeer druppels door de module IdentifyPrimaryObjects te gebruiken met behulp van de grijswaardenafbeelding.
    OPMERKING: De parameters in deze module moeten worden aangepast om een goede LD-identificatie te bereiken. In dit werk leidde het definiëren van LD's met een grootte tussen 6 pixels en 300 pixels en een drempelcorrectiefactor van 1,0 tot de meest nauwkeurige identificatie.
  6. Als u de pixelintensiteit van de geïdentificeerde lipidedruppels wilt meten, voegt u een module MeasureObjectIntensity toe.
  7. Voeg een extra FilterObjects-module toe om ervoor te zorgen dat alleen de sterkste signalen worden gekwantificeerd, terwijl minder intense signalen worden uitgesloten van de uiteindelijke lipidedruppelanalyse (minimale intensiteit: 0,15; maximale intensiteit: 1 willekeurige eenheid).
  8. Als u de LD's met betrekking tot de uitvoergegevens wilt meten, voegt u de module MeasureObjectSizeShape toe.
  9. Voeg op dit punt een OverlayOutlines-module toe om de geïdentificeerde druppel op de oorspronkelijke afbeelding te bedekken en er zo voor te zorgen dat de segmentatie er ook op de onbewerkte afbeelding nauwkeurig uitziet.
    OPMERKING: Dit is een optionele stap (kwaliteitscontrole).
  10. Voeg aan het einde een ExportToSpreadsheet-module toe en klik op de knop Afbeeldingen analyseren in de linkerbenedenhoek.

8. Statistische analyse

  1. Druk de resultaten uit als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (S.E.M.) met behulp van een softwaretoepassing voor statistische analyse.
    OPMERKING: In deze studie werd GraphPad-software gebruikt voor statistische analyse.
  2. Analyseer de verdeling van waarden met behulp van de Kolmogorov-Smirnov-test om significante afwijkingen van de normaliteit te beoordelen. Analyseer de parametrische gegevens met behulp van de ongepaarde t-test van de student.
    OPMERKING: Waarden van p < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De succesvolle uitvoering van deze techniek zou moeten resulteren in duidelijke lipidedruppelkleuring voor de gelijktijdige karakterisering van de LD-morfologie (vorm en lipidekerndichtheid op basis van de 3D-reconstructie) samen met hun ruimtelijke verdeling, aantal per totale oppervlakte en gemiddelde grootte (beoordeeld met de hierboven beschreven pijplijn, figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit op fluorescentie gebaseerde protocol van BODIPY 493/503 voor LD-beoordeling had tot doel een nieuwe beeldvormingsbenadering te ontwikkelen voor de evaluatie van leversteatose. Gezien de sterke correlatie tussen obesitas en leververvetting, werd het vetrijke dieet in westerse stijl gebruikt om een diermodel van leversteatose vast te stellen26. Een robuuste toename van het lever-TG-gehalte werd bevestigd door een kwantitatieve triglyceriden colorimetrische testkit, die een verhoogd leverlipidose...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door nationale en Europese fondsen via de Portugese Stichting voor Wetenschap en Technologie (FCT), het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (FEDER) en Programa Operacional Factores de Competitividade (COMPETE): 2020.09481.BD, UIDP/04539/2020 (CIBB) en POCI-01-0145-FEDER-007440. De auteurs willen graag de steun van iLAB - Microscopy and Bioimaging Lab, een faciliteit van de Faculteit der Geneeskunde van de Universiteit van Coimbra en een lid van de nationale infrastructuur PPBI-Portugese Platform van BioImaging (POCI-01-0145-FEDER-022122), evenals de steun van FSE CENTRO-04-3559-FSE-000142 bedanken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.6 mm I.D. siliconen slang, I.V mini druppelsetFisher Scientific
4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY 493/503)Sigma-Aldrich, Lyon, FrankrijkD3922
4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)Molecular Probes Inc, Invitrogen, Eugene, ORD1306
70% ethanolHoneywell10191455
Adobe Illustrator CCAdobe Inc.Gebruikt om de figuren te ontwerpen
Automatische analyzer Hitachi 717Roche Diagnostics Inc., Mannheim, Duitsland8177-30-0010
Barrier pen (Liquid blocker super pap pen)Daido Sangyo Co., Ltd, Japan_
MesLeica221052145Gebruikt in de cryostaat
Cell Profiler versie 4.2.5https://cellprofiler.org/releases/Gebruikt om de verworven beelden te analyseren
DekglasjesMenzel-Glaser, Duitsland_
CryomoldsTissue-Tek_
Cryostat (inclusief specimen schijf en warmte extractor) CM3050 SLeica Biosystems_
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich, Lyon, FrankrijkD-8418Gebruikt om Bodipy op te lossen voor de 5 mg/mL stamoplossing. VOORZICHTIG: Toxisch
en ontvlambaar. Dampen kunnen
irritatie veroorzaken. Behandelen in een afzuigkap
houder. Vermijd direct contact met de huid.
Draag rubberen handschoenen, beschermende oog
bril.
Dry ice container (styrofoam koeler)NovolabA26742
Dumont pincetFine Science Tools, Duitsland11295-10
Glas petrischaal (H 25 mm, ø
150 mm)		Thermo Scientific150318Gebruikt om de lever na dissectie te wegen
GlycergelDAKO OmnisS303023
GraphPad Prism software, versie 9.3.1GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
Hoog vetdieetEnvigo, Barcelona, SpanjeMD.08811
Ketamine (Nimatek  100 mg/mL)Dechra791/01/14DFVPTGebruikt op een uiteindelijke concentratie van 75 mg/kg
Laser scanning confocale microscoop  (QUASAR detectie-eenheid; )Carl Zeiss, DuitslandLSM 710 Axio Observer Z1 microscoop
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)Dechra1838 ESP / 020/01/07RFVPTGebruikt op een uiteindelijke concentratie van 1 mg/kg
NaaldBD microlance300635
Nr 15 steriele koolstofstaal scalpel
Mes		Swann-Morton205
Objectieven 10x (Plan-Neofluar 10x/0.3), 20x (Plan-Apochromat 20x/0.8) en 40x (Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil) Carl Zeiss, Duitsland
VerfpenselenVan Bleiswijck Amazon B07W7KJQ2X Gebruikt om cryosecties te hanteren
Peristaltiekpomp (Minipuls 3)Gilson1004170
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, pH ~ 7.4)Sigma-Aldrich, Lyon, FrankrijkP3813
Scalpel handvat, 125 mm (5"), Nr. 3Swann-Morton0208
Glijmiddel voor dia's StainTraySimport ScientificM920
Standaard dieet Mucedola4RF21
Superfrost Plus microscoopglaasjesMenzel-Glaser, DuitslandJ1800AMNZ
Tissue-Tek OCT montagemediumVWR CHEMICALS361603E
Triglyceriden colorimetrische assay kitCayman Chemical10010303
Ultrasoon badBandelin Sonorex TK 52
Vannas veerschaar - 3 mm
snijrand		Fine Science Tools, Duitsland15000-00
ZEN Black softwareZeiss

Referenties

  1. Klemm, R. W., Ikonen, E. The cell biology of lipid droplets: More than just a phase. Seminars in Cell & Developmental Biology. 108, 1-3 (2020).
  2. Martin, S., Parton, R. G. Lipid droplets: A unified view of a dynamic organelle. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 373-378 (2006).
  3. Thiele, C., Penno, A. Lipid droplets. Encyclopedia of Cell Biology. Bradshaw, R. A., Stahl, P. D. , Academic Press. Cambridge, MA. 273-278 (2016).
  4. Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: From basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
  5. Bickel, P. E., Tansey, J. T., Welte, M. A. PAT proteins, an ancient family of lipid droplet proteins that regulate cellular lipid stores. Biochimica et Biophysica Acta. 1791 (6), 419-440 (2009).
  6. Olzmann, J. A., Carvalho, P. Dynamics and functions of lipid droplets. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).
  7. Wang, L., Liu, J., Miao, Z., Pan, Q., Cao, W. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937(2021).
  8. Carr, R. M., Ahima, R. S. Pathophysiology of lipid droplet proteins in liver diseases. Experimental Cell Research. 340 (2), 187-192 (2016).
  9. Jackson, C. L. Lipid droplet biogenesis. Current Opinion in Cell Biology. 59, 88-96 (2019).
  10. Onal, G., Kutlu, O., Gozuacik, D., Dokmeci Emre, S. Lipid droplets in health and disease. Lipids in Health and Disease. 16 (1), 128(2017).
  11. Wang, H., Quiroga, A. D., Lehner, R. Lipid Droplets. Methods in Cell Biology. Yang, H., Li, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 107-127 (2013).
  12. Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 24, Unit 24.2 (2007).
  13. Welte, M. A., Gould, A. P. Lipid droplet functions beyond energy storage. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1260-1272 (2017).
  14. Roberts, M. A., Olzmann, J. A. Protein quality control and lipid droplet metabolism). Annual Review of Cell and Developmental Biology. 36, 115-139 (2020).
  15. Filali-Mouncef, Y., et al. The ménage à trois of autophagy, lipid droplets and liver disease. Autophagy. 18 (1), 50-72 (2022).
  16. Bandyopadhyay, D., et al. Lipid droplets promote phase separation of Ago2 to accelerate Dicer1 loss and decelerate miRNA activity in lipid exposed hepatic cells. bioRxiv. , (2020).
  17. Farías, M. A., Diethelm-Varela, B., Navarro, A. J., Kalergis, A. M., González, P. A. Interplay between lipid metabolism, lipid droplets, and DNA virus infections. Cells. 11 (14), 2224(2022).
  18. Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: Lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
  19. Greenberg, A. S., et al. The role of lipid droplets in metabolic disease in rodents and humans. The Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2102-2110 (2011).
  20. Xu, S., Zhang, X., Liu, P. Lipid droplet proteins and metabolic diseases. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (5), 1968-1983 (2018).
  21. Herms, A., et al. Cell-to-cell heterogeneity in lipid droplets suggests a mechanism to reduce lipotoxicity. Current Biology. 23 (15), 1489-1496 (2013).
  22. Hooper, A. J., Adams, L. A., Burnett, J. R. Genetic determinants of hepatic steatosis in man. Journal of Lipid Research. 52 (4), 593-617 (2011).
  23. Parafati, M., Kirby, R. J., Khorasanizadeh, S., Rastinejad, F., Malany, S. A nonalcoholic fatty liver disease model in human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes, created by endoplasmic reticulum stress-induced steatosis. Disease Models & Mechanisms. 11 (9), (2018).
  24. Nassir, F., Rector, R. S., Hammoud, G. M., Ibdah, J. A. Pathogenesis and prevention of hepatic steatosis. Gastroenterology & Hepatology. 11 (3), 167-175 (2015).
  25. Starekova, J., Reeder, S. B. Liver fat quantification: Where do we stand. Abdominal Radiology. 45 (11), 3386-3399 (2020).
  26. Fabbrini, E., Sullivan, S., Klein, S. Obesity and nonalcoholic fatty liver disease: Biochemical, metabolic, and clinical implications. Hepatology. 51 (2), 679-689 (2010).
  27. Kristiansen, M. N. B., Veidal, S. S., Christoffersen, C., Jelsing, J., Rigbolt, K. T. G. Molecular characterization of microvesicular and macrovesicular steatosis shows widespread differences in metabolic pathways. Lipids. 54 (1), 109-115 (2019).
  28. Tsutsumi, V., Nakamura, T., Ueno, T., Torimura, T., Aguirre-García, J. Chapter 2: Structure and ultrastructure of the normal and diseased liver. Liver Pathophysiology. Muriel, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 23-44 (2017).
  29. Tandra, S., et al. Presence and significance of microvesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease. Journal of Hepatology. 55 (3), 654-659 (2011).
  30. Nascimbeni, F., et al. Clinical relevance of liver histopathology and different histological classifications of NASH in adults. Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 12 (4), 351-367 (2018).
  31. Yerian, L. Histopathological evaluation of fatty and alcoholic liver diseases. Journal of Digestive Diseases. 12 (1), 17-24 (2011).
  32. Stöppeler, S., et al. Gender and strain-specific differences in the development of steatosis in rats. Laboratory Animals. 47 (1), 43-52 (2013).
  33. Hübscher, S. G. Alcohol-induced liver disease. Practical Hepatic Pathology: A Diagnostic Approach (Second Edition). Saxena, R. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 371-390 (2018).
  34. Sethunath, D., et al. Automated assessment of steatosis in murine fatty liver. PLoS One. 13 (5), e0197242(2018).
  35. Sinton, M. C., et al. Macrovesicular steatosis in nonalcoholic fatty liver disease is a consequence of purine nucleotide cycle driven fumarate accumulation. bioRxiv. , (2020).
  36. de Conti, A., et al. Characterization of the variability in the extent of nonalcoholic fatty liver induced by a high-fat diet in the genetically diverse collaborative cross mouse model. The FASEB Journal. 34 (6), 7773-7785 (2020).
  37. Virarkar, M., Szklaruk, J., Jensen, C. T., Taggart, M. W., Bhosale, P. What's new in hepatic steatosis. Seminars in Ultrasound, CT and MRI. 42 (4), 405-415 (2021).
  38. Le, T. T., Ziemba, A., Urasaki, Y., Brotman, S., Pizzorno, G. Label-free evaluation of hepatic microvesicular steatosis with multimodal coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. PLoS One. 7 (11), e51092(2012).
  39. Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768(2018).
  40. Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8 (1), 42(2015).
  41. Daemen, S., van Zandvoort, M. A. M. J., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2015).
  42. Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 598358(2011).
  43. Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), e77774(2013).
  44. Nakano, T., et al. Ezetimibe impairs transcellular lipid trafficking and induces large lipid droplet formation in intestinal absorptive epithelial cells. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1865 (12), 158808(2020).
  45. Adomshick, V., Pu, Y., Veiga-Lopez, A. Automated lipid droplet quantification system for phenotypic analysis of adipocytes using CellProfiler. Toxicology Mechanisms and Methods. 30 (5), 378-387 (2020).
  46. Moon, J., et al. Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease. Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).
  47. Martinez-Lopez, N., Singh, R. Autophagy and lipid droplets in the liver. Annual Review of Nutrition. 35, 215-237 (2015).
  48. Collot, M., et al. Ultrabright and fluorogenic probes for multicolor imaging and tracking of lipid droplets in cells and tissues. Journal of the American Chemical Society. 140 (16), 5401-5411 (2018).
  49. Selvais, C. M., De Cock, L. L., Brichard, S. M., Davis-Lopez de Carrizosa, M. A. Fiber type and subcellular-specific analysis of lipid droplet content in skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: Jove. (184), e63718(2022).
  50. Zhuang, H., et al. Long-term high-fat diet consumption by mice throughout adulthood induces neurobehavioral alterations and hippocampal neuronal remodeling accompanied by augmented microglial lipid accumulation. Brain, Behavior, and Immunity. 100, 155-171 (2022).
  51. Chen, J., Yue, F., Kuang, S. Labeling and analyzing lipid droplets in mouse muscle stem cells. STAR Protocols. 3 (4), 101849(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lipid droplet analyseBODIPY kleuring3D reconstructieconfocale microscopievetrijk dieetleverweefselfluorescentie imagingmacrovesiculaire steatoseCell Profiler

Gerelateerde artikelen