Method Article

De MouseWalker gebruiken om locomotorische disfunctie te kwantificeren in een muismodel van dwarslaesie

DOI:

10.3791/65207

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa, 2iNOVA4Health, NOVA Medical School|Faculdade de Ciências Médicas, NMS|FCM, Universidade Nova de Lisboa, 3Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een experimentele pijplijn om het bewegingspatroon van vrij lopende muizen kwantitatief te beschrijven met behulp van de MouseWalker (MW) toolbox wordt geleverd, variërend van initiële video-opnames en tracking tot post-kwantificeringsanalyse. Een dwarslaesiemodel bij muizen wordt gebruikt om het nut van het MW-systeem aan te tonen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De uitvoering van complexe en sterk gecoördineerde motorische programma's, zoals lopen en hardlopen, is afhankelijk van de ritmische activering van spinale en supra-spinale circuits. Na een thoracale dwarslaesie is de communicatie met stroomopwaartse circuits verstoord. Dit leidt op zijn beurt tot een verlies van coördinatie, met een beperkt herstelpotentieel. Om de mate van herstel na toediening van geneesmiddelen of therapieën beter te evalueren, is er dus behoefte aan nieuwe, meer gedetailleerde en nauwkeurige hulpmiddelen om gang, ledemaatcoördinatie en andere fijne aspecten van locomotorisch gedrag in diermodellen van ruggenmergletsel te kwantificeren. In de loop der jaren zijn verschillende testen ontwikkeld om het vrijloopgedrag bij knaagdieren kwantitatief te beoordelen; Ze missen echter meestal directe metingen met betrekking tot staploopstrategieën, voetafdrukpatronen en coördinatie. Om deze tekortkomingen aan te pakken, wordt een bijgewerkte versie van de MouseWalker geleverd, die een gefrustreerde totale interne reflectie (fTIR) loopbrug combineert met tracking- en kwantificeringssoftware. Dit open-source systeem is aangepast om verschillende grafische outputs en kinematische parameters te extraheren, en een set post-kwantificeringstools kan zijn om de verstrekte outputgegevens te analyseren. Dit manuscript laat ook zien hoe deze methode, in combinatie met reeds gevestigde gedragstests, motorische tekorten na een dwarslaesie kwantitatief beschrijft.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De effectieve coördinatie van vier ledematen is niet uniek voor viervoetige dieren. De coördinatie van de voorpoot en de achterpoot bij de mens blijft belangrijk om verschillende taken uit te voeren, zoals zwemmen en veranderingen in snelheid tijdens het lopen1. Verschillende ledemaatkinematisch 2 en motorisch programma 1,3,4, evenals proprioceptieve feedbackcircuits5, worden bewaard tussen mensen en andere zoogdieren en moeten worden overwogen bij het analyseren van therapeutische opties voor motorische aandoeningen, zoals dwarslaesie (SCI)6,7,8.

Om te kunnen lopen, moeten verschillende spinale verbindingen van de voorpoten en achterpoten goed worden bedraad en ritmisch worden geactiveerd, wat input van de hersenen en feedback van het somatosensorische systeem vereist 2,9,10. Deze verbindingen culmineren in de centrale patroongeneratoren (CLB's), die zich op cervicaal en lumbaal niveau bevinden voor de voorpoten en achterpoten, respectievelijk 1,9,10. Vaak, na dwarslaesie, beperken de verstoring van neuronale connectiviteit en de vorming van een remmend gliaal litteken12 het herstel van de locomotorische functie, met uitkomsten variërend van totale verlamming tot beperkte functie van een groep ledematen, afhankelijk van de ernst van het letsel. Hulpmiddelen om de locomotorische functie na dwarslaesie nauwkeurig te kwantificeren zijn van cruciaal belang voor het monitoren van herstel en het evalueren van de effecten van behandelingen of andere klinische interventies6.

De standaard metrische test voor muiscontusiemodellen van SCI is de Basso-muisschaal (BMS)13,14, een niet-parametrische score die rekening houdt met rompstabiliteit, staartpositie, plantaire stepping en voorpoot-achterledemaatcoördinatie in een open veldarena. Hoewel het BMS in de meeste gevallen uiterst betrouwbaar is, vereist het ten minste twee ervaren beoordelaars om alle hoeken van dierbewegingen te observeren om rekening te houden met natuurlijke variabiliteit en vertekening te verminderen.

Andere testen zijn ook ontwikkeld om motorische prestaties na SCI kwantitatief te beoordelen. Deze omvatten de rotarod-test, die de tijd meet die wordt besteed aan een roterende cilinder15; de horizontale ladder, die het aantal gemiste leuningen en positieve laddergrijpers meet16,17; en de balklooptest, die de tijd meet die een dier nodig heeft en het aantal fouten dat het maakt bij het overschrijden van een smalle balk18. Ondanks een combinatie van motorische tekorten, produceert geen van deze tests directe locomotorische informatie over de coördinatie van de voorpoot-achterpoot.

Om loopgedrag specifiek en grondiger te analyseren, zijn andere testen ontwikkeld om stapcycli en loopstrategieën te reconstrueren. Een voorbeeld is de voetafdruktest, waarbij de geïnkte poten van een dier een patroon tekenen over een vel wit papier19. Hoewel eenvoudig in zijn uitvoering, is het extraheren van kinematische parameters zoals paslengte omslachtig en onnauwkeurig. Bovendien beperkt het ontbreken van dynamische parameters, zoals de duur van de stapcyclus of beengetimede coördinatie, de toepassingen ervan; Inderdaad, deze dynamische parameters kunnen alleen worden verkregen door frame-voor-frame video's van knaagdieren die door een transparant oppervlak lopen te analyseren. Voor SCI-studies hebben onderzoekers het loopgedrag geanalyseerd vanuit een zijaanzicht met behulp van een loopband, inclusief het reconstrueren van de stapcyclus en het meten van de hoekvariaties van elk beengewricht 4,20,21. Hoewel deze aanpak uiterst informatief kan zijn6, blijft het gericht op een specifieke set ledematen en mist het extra loopfuncties, zoals coördinatie.

Om deze hiaten op te vullen, ontwikkelden Hamers en collega's een kwantitatieve test op basis van een optische aanraaksensor met behulp van gefrustreerde totale interne reflectie (fTIR)22. Bij deze methode plant licht zich via interne reflectie door glas, wordt het verstrooid bij het drukken van de poten en wordt het uiteindelijk vastgelegd door een hogesnelheidscamera. Meer recent werd een open-source versie van deze methode, genaamd MouseWalker, beschikbaar gesteld, en deze aanpak combineert een fTIR-loopbrug met een tracking- en kwantificeringssoftwarepakket23. Met behulp van deze methode kan de gebruiker een grote reeks kwantitatieve parameters extraheren, waaronder stap-, ruimte- en looppatronen, voetafdrukpositionering en coördinatie van de voorpoot-achterpoot, evenals visuele outputs, zoals voetafdrukpatronen (die de geïnkte poottest6 nabootsen) of houdingsfasen ten opzichte van de lichaamsas. Belangrijk is dat vanwege het open-source karakter nieuwe parameters kunnen worden geëxtraheerd door het MATLAB-scriptpakket bij te werken.

Hier wordt de eerder gepubliceerde assemblage van het MouseWalker23-systeem bijgewerkt. Er wordt een beschrijving gegeven van hoe u het kunt instellen, met alle stappen die nodig zijn om de beste videokwaliteit, trackingcondities en parameteracquisitie te bereiken. Aanvullende post-kwantificeringstools worden ook gedeeld om de analyse van de MouseWalker (MW) outputdataset te verbeteren. Ten slotte wordt het nut van deze tool aangetoond door het verkrijgen van kwantificeerbare waarden voor algemene locomotorische prestaties, met name stapcycli en voorpoot-achterpootcoördinatie, in een context van dwarslaesie (SCI).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle behandelings-, chirurgische en postoperatieve zorgprocedures werden goedgekeurd door het Moleculair Intern Comité (ORBEA) van het Instituto de Medicina en het Portugese Comité voor Dierethiek (DGAV) in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Gemeenschap (Richtlijn 2010/63/EU) en de Portugese wet op de verzorging van dieren (DL 113/2013) onder de licentie 0421/000/000/2022. Vrouwelijke C57Bl/6J muizen van 9 weken oud werden gebruikt voor deze studie. Alles werd in het werk gesteld om het aantal dieren tot een minimum te beperken en het lijden van de in het onderzoek gebruikte dieren te verminderen. Het MATLAB-script en de zelfstandige versie van de MW-software zijn open-source en zijn beschikbaar op de GitHub
Repository (https://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker). Terwijl de MW-software is ontwikkeld in MATLAB R2012b, is deze aangepast om te worden uitgevoerd in MATLAB R2022b. Figuur 1 illustreert de analyseworkflow van de MW.

1. Het MouseWalker (MW)-apparaat instellen

  1. Monteer het MW-apparaat zoals eerder beschreven23, of pas het aan de specifieke behoeften van het experimentele ontwerp aan (zie Materiaaltabel en Aanvullende Figuur 1 voor meer informatie over de opstelling).
    OPMERKING: De looparena kan breder worden gemaakt om grotere dieren, zoals ratten, te huisvesten.
  2. Controleer of het plexiglas waar de dieren lopen schoon en krasvrij is. Gebruik een gladde reinigingsdoek en minimaliseer het gebruik van organische oplosmiddelen zoals ammoniak of ethanol in hoge concentraties, die het plexiglas kunnen beschadigen (3% waterstofperoxide, 7% ethanol of een compatibel en geschikt desinfectiemiddel voor plexiglas wordt aanbevolen). Vervang indien nodig het plexiglas.
  3. Stel de hogesnelheidscamera in met een snelle lens en een groot diafragma (d.w.z. kleinere F-stopwaarden) om een grote hoeveelheid licht vast te leggen, omdat dit helpt om de fTIR-signalen op te nemen (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: De lens mag geen optische vervormingen genereren, met name aan de randen van het beeld. Optische vervormingen kunnen worden getest door een bekend patroon op te nemen (bijvoorbeeld strepen of vierkanten) en vervolgens de grootte van de blokken op ImageJ / FIJI24 te meten (gebruik het lijngereedschap en klik vervolgens op Analyseren > meten). Een vierkant van 1 cm moet bijvoorbeeld dezelfde pixelafmetingen hebben, zowel in het midden van de afbeelding als aan de randen. Variaties moeten kleiner zijn dan 5%.
  4. Verlicht de veelkleurige LED-lichtstrip van de achtergrondlichtbak.
  5. Verlicht de witte LED-lichtstrip van de lichtbak van de loopbrug.
    OPMERKING: Een gekleurde LED kan ook25 worden gebruikt om het onderscheid van de voetafdruk / lichaam / achtergrond te vergemakkelijken.
  6. Controleer met de lichten van de kamer uit de lichtintensiteit van de achtergrondlichtbak en loopbrug. Pas de intensiteit aan, indien nodig, met behulp van een potentiometer of semi-ondoorzichtige kunststof. Deze moeten zo worden geoptimaliseerd dat de pixelintensiteit in de volgende volgorde toeneemt: het lichaam van het dier < achtergrond < voetafdrukken.
    1. Om de pixelintensiteit van het lichaam / de achtergrond / voetafdrukken van het dier te controleren, opent u de beeldreeks op ImageJ / FIJI24 en klikt u op Analyseren > meten. Het voetafdruksignaal mag niet oververzadigd zijn, omdat dit voorkomt dat de grenzen van de voetafdruk worden gedefinieerd (d.w.z. tenen en voetkussens) (aanvullende figuur 2).
  7. Pas het beeldcontrast van de loopbrug aan op de video-opnamesoftware. Het contrast kan op twee manieren worden aangepast: door de verlichting op de ledstrip te dimmen of te vergroten of door het diafragma van de cameralens aan te passen.
  8. Plaats de lens op de juiste plaats op dezelfde hoogte en in het midden van de 45° reflecterende spiegel en loodrecht (90°) op de loopbrug. Dit genereert een constant proportioneel beeld langs de links-rechts loopbrug.
    OPMERKING: Wijzig de camerapositie (afstand, hoogte en oriëntatie) niet tijdens de meerdere opnamesessies. Markeer indien nodig de vloer waar het statief moet worden geplaatst. Hierdoor blijven de afbeeldingsfuncties behouden.
  9. Richt de lens op het oppervlak van het plexiglas. Dit kan worden getest met behulp van een niet-beschadigend voorwerp dat het oppervlak van het plexiglas raakt.
    OPMERKING: Met lagere F-stop lenswaarden wordt de scherptediepte kleiner, waardoor scherpstellen moeilijker wordt.
  10. Zorg ervoor dat alle instellingen ongewijzigd blijven tijdens de test, omdat ze de pixelintensiteit van de opgenomen video's kunnen wijzigen.

2. Video-acquisitie

  1. Zorg ervoor dat de muizen bekend zijn met de kamer en het apparaat voordat ze worden getest. Bewaar minstens 1 dag voor gewenning (dag 0). Om overmatige training te voorkomen, voert u de MW-test uit op een andere dag dan de andere gedragstests (bij voorkeur de dag erna).
  2. Zorg er in de video-opnamesoftware voor dat ten minste 50 cm van de loopbrug zichtbaar is.
  3. Pas de opname-instellingen aan om het loopbruggebied af te kappen. Dit verkleint de videogrootte en optimaliseert de video-acquisitie.
  4. Maak voor elke sessie een foto of een korte video van een gewone liniaal. Het aantal pixels per centimeter wordt later gebruikt in het "instellingenvenster" om de video's te kalibreren.
  5. Start de video-acquisitie en plaats het dier op de rand van de loopbrug door de basis van de staart vast te pakken om verwondingen te voorkomen. Zorg ervoor dat de dieren naar voren bewegen naar de uiterste rand van het platform. Voer de video-opnamen uit met ten minste 100 frames /s om soepele loopovergangen te garanderen.
    1. Motiveer de dieren indien nodig om te bewegen door zachtjes op de muur van het looppad te tikken of door met de vingers te knakken / klappen. Vermijd echter fysieke nudging, omdat dit de resultaten kan beïnvloeden.
    2. Sla de video's rechtstreeks op als beeldreeksen in TIFF-indeling (met LZW-compressie), JPEG of PNG. Als de camera opneemt als een onbewerkt MOV-bestand, converteert u de video's naar beeldreeksen door het bestand te openen in ImageJ / FIJI24 en te klikken op Bestand > Opslaan als > afbeeldingsreeks (of door andere software te gebruiken, zoals LosslessCut25).
      OPMERKING: De meeste dieren beginnen direct te lopen nadat ze in de loopbrug zijn gezet; Daarom wordt aanbevolen om de video-acquisitie te starten voordat u het dier plaatst.

3. De video's voorbereiden voor de MW-trackingsoftware

  1. Film genoeg volledige runs van elke individuele muis. Het aantal te filmen dieren per conditie en het aantal volledige runs moeten worden bepaald volgens elk experimenteel ontwerp. Een volledige run is wanneer de muis de volledige 50 cm van de loopbrug loopt zonder langdurige stops (in dit experiment werden drie volledige runs geselecteerd).
    OPMERKING: Afhankelijk van de beeldacquisitiesoftware moeten video's mogelijk worden bijgesneden tot de kleinste ROI. Dit verhoogt de snelheid van tracking en het genereren van uitvoer.
  2. Selecteer in ImageJ/FIJI24 de frames waarin de muis zich op het scherm bevindt door op Image > Stack > Tools > Make a substack te klikken. De tracking op de MW vereist dat de kop en de staart zichtbaar zijn in alle frames. Het is echter mogelijk om meerdere substacks te maken van een enkele video-opname, die later elke run zal vertegenwoordigen.
  3. Sla elke substack afzonderlijk op in verschillende mappen door op Bestand te klikken > Opslaan als > afbeeldingsreeks. De MW-software maakt later automatisch een submap in elke map telkens wanneer men begint met het analyseren van een run.

4. Traceren

  1. Open MATLAB, voeg de map met het MW-script toe aan de werkmap en voer "MouseWalker.m" uit op de hoofdopdrachtregel.
    OPMERKING: Met behulp van de MW-software onder MATLAB kunnen trackingfoutmeldingen worden bekeken op de hoofdconsole van MATLAB en kunnen de gewenste uitvoergegevens worden geselecteerd (door het hoofdscriptbestand "MouseEvaluate.m" te openen en de uitgangen te wijzigen in 1 of 0: het Excel-bestand, voetstapplots, standsporen en looppatronen).
  2. Laad de videomap als de "Input directory". Men kan ook de uitvoermap kiezen; dit is echter geen vereiste, omdat de MW-software automatisch een nieuwe map met de naam "Resultaten" maakt in de "Invoermap".
  3. Controleer met behulp van de pijlen "<<", "<", ">>" en ">" of de videoframes allemaal correct zijn geladen in de MW-software.
  4. Ga naar het venster "Instellingen" waar alle kalibratie- en drempelparameters zich bevinden. Deze instellingen kunnen veranderen afhankelijk van de pixelintensiteit van de achtergrond en voetafdrukken, evenals de minimale grootte van het lichaam en voetafdrukken, naast andere factoren (zie voorbeeld in aanvullende figuur 2). Test het effect van het wijzigen van sommige parameters door op de knop Voorbeeld te klikken.
    1. Gebruik de verschillende plotstijlen, waaronder "lichaam + voeten + staart", "alleen lichaam", "alleen voeten" en "alleen staart", om lichaamsdelen te onderscheiden na het aanpassen van de drempelparameters.
    2. Maak gebruik van de gereedschappen op het rechterpaneel om metingen van de helderheid of grootte uit te voeren (met behulp van respectievelijk de knoppen "helderheid" en "liniaal"). Alle instellingen kunnen als "standaard" worden opgeslagen zolang de cameraafstand hetzelfde blijft.
  5. Nadat u de drempelparameters hebt aangepast, controleert u of de video klaar is voor geautomatiseerde tracking. Ga naar het eerste frame en klik op Auto om te beginnen met volgen. Deze stap kan in realtime worden gevolgd en duurt enkele minuten, afhankelijk van de grootte van de video en de prestaties van de computer.
    1. Als de autotracking de lichaamsfuncties onjuist labelt, annuleert u de automatische tracking, voert u nieuwe instellingen in en start u het proces opnieuw.
  6. Nadat het volgen is voltooid, controleert u of een handmatige correctie nodig is. Om te corrigeren, gebruikt u het middelste paneel om te selecteren of te deselecteren en geeft u de locatie aan van de voetafdrukken van de rechtervoorpoot (RF), rechterachterhand (RV), linkervoor (LF) en linkerachterhand (LH), hoofd, neus, lichaam (verdeeld in twee segmenten) en staartposities (verdeeld in vier segmenten). Sla de wijzigingen op door op de knop Opslaan te drukken.
    OPMERKING: Alle knoppen en de meeste opdrachten hebben een sneltoets (raadpleeg de bijbehorende handleiding voor details23). Om het scrollen van video's en het uitvoeren van sneltoetsen te vergemakkelijken, kan een hardwarecontroller met programmeerbare knoppen en een shuttlewiel zoals de Contour ShuttlePro V2 worden gebruikt.
  7. Klik op Evalueren om de uitvoerbestanden van de gevolgde video te genereren. Afhankelijk van de gewenste uitvoer die is geselecteerd (zie stap 4.1), kan deze stap enkele minuten duren.
  8. Controleer of alle grafische uitvoergegevensplots zijn opgeslagen in de map "Resultaten". Controleer de nauwkeurigheid van de tracking door enkele van de grafische uitgangen te onderzoeken, zoals de "Stance-sporen", waar men kan controleren of alle pootposities consistent zijn.
    1. Als er een fout wordt vastgesteld, corrigeert u de tracking handmatig (indien mogelijk; anders verwijdert u de map "Resultaten" en voert u de automatische tracking opnieuw uit met nieuwe instellingen) en klikt u nogmaals op de opdracht Evalueren .
  9. Controleer of alle kwantitatieve metingen die door de MW-software worden gegenereerd, worden opgeslagen in een Excel-spreadsheet en worden samengevat op "1. Info_Sheet". Zorg ervoor dat de Excel-opties voor de formulescheidingstekens overeenkomen met het script. Het decimale scheidingsteken moet "," zijn en de duizend scheidingstekens moeten ";" zijn.
  10. Gebruik het script "MouseMultiEvaluate.m" om de metingen van alle runs samen te voegen in een nieuw bestand voor analyse.
    1. Genereer om te beginnen een .txt bestand met de mappaden voor alle video's (bijvoorbeeld "Videobestanden.txt"). Zorg ervoor dat elke regel overeenkomt met één video.
    2. Schrijf vervolgens "MouseMultiEvaluate('Videofiles.txt')" in de opdrachtregel. Een Excel-bestand met de naam "ResultSummary.xls" wordt gegenereerd in de werkmap (zie een voorbeeld in de GitHub-opslagplaats).
      OPMERKING: Figuur 2 geeft de grafische uitgangen weer die door de MW-software zijn verkregen uit de video's van één opgenomen dier.

5. Kinematische data-analyse workflow

  1. Bewerk het Excel-blad dat is gegenereerd in stap 4.10, dat de gegevens bevat voor verwerking met behulp van de meegeleverde Python-scripts, volgens de volgende vereisten.
    1. Geef in de eerste kolomkop de experimentele voorwaarde op. Geef elke regel een naam na de naam van de groep/voorwaarde (personen uit dezelfde groepen moeten dezelfde naam hebben). De eerste groep moet het besturingselement of de basislijn zijn (dit is alleen verplicht voor heatmapplotten, stap 5.6).
    2. Geef in de tweede kolom de dier-ID op. Dit is verplicht, hoewel deze informatie niet zal worden gebruikt voor het genereren van percelen.
    3. Kies in de derde kolom de motorparameters die voor de analyse worden gebruikt. Zorg ervoor dat de eerste regel de naam van de parameter is (deze namen verschijnen later in de plots).
  2. Open Anaconda Navigator en voer Spyder uit om de meegeleverde Python-scripts te openen.
    OPMERKING: Alle scripts zijn ontwikkeld met Python 3.9.13, zijn uitgevoerd met Spyder 5.2.2 in Anaconda Navigator 2.1.4 en zijn beschikbaar in de materiaaltabel en de GitHub-opslagplaats (waar extra materialen zijn opgenomen, zoals een videovoorbeeld, een Excel-voorbeeldbestand en een document met veelgestelde vragen). Het is mogelijk om de scripts buiten de Anaconda Navigator uit te voeren; Deze grafische gebruikersinterface is echter gebruiksvriendelijker.
  3. Gebruik de "Rawdata_PlotGenerator.py" om de onbewerkte gegevensplots te genereren. Dit maakt de visualisatie van elke parameter mogelijk als een functie van de snelheid.
    1. Open "Rawdata_PlotGenerator.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
    2. Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
    3. De onbewerkte gegevensplots worden weergegeven in de plotconsole (deelvenster rechtsboven). Om de plots op te slaan, klikt u op de knop Afbeelding opslaan of Alle afbeeldingen opslaan in de plotconsole.
  4. Gebruik het script "Residuals_DataAnalysis" om de resten voor data-analyse te berekenen. Dit script genereert een CSV-bestand met de berekeningen van de resten voor alle motorparameters.
    OPMERKING: Veel van de gemeten loopparameters die door de MW worden geëxtraheerd, variëren met de snelheid (bijv. Zwenksnelheid, staplengte, standduur, rechtheid van de houding en loopindexen). Daarom wordt aanbevolen om een best passend regressiemodel uit te voeren van elke individuele parameter versus snelheid voor het basislijnexperiment en vervolgens de restwaarden voor elke experimentele groep te bepalen in relatie tot dit regressiemodel. De gegevens worden dan uitgedrukt als het verschil met de resterende genormaliseerde lijn26.
    1. Open "Residuals_DataAnalysis.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
    2. Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
    3. Sla het CSV-bestand op in dezelfde map als de gegevens. Het is verplicht dat het besturingselement (of de basislijn) de eerste groep in het Excel-bestand is.
  5. Gebruik het script "PCA_PlotGenerator.py" om een principal component analysis (PCA) uit te voeren.
    OPMERKING: Deze methode voor het verminderen van de dimensionaliteit zonder toezicht wordt gebruikt om een beknoptere weergave van27,28,29 van de gegevens te genereren (figuur 3A, B). Het PCA-script bevat de volgende stappen. De gegevens worden eerst voorbewerkt door centreren en schalen, waarna het PCA-algoritme de covariantiematrix berekent om de correlaties tussen de variabelen te bepalen en de eigenvectoren en eigenwaarden van de covariantiematrix te berekenen om de belangrijkste componenten te identificeren. De eerste twee of drie hoofdcomponenten worden gekozen voor de weergave van de gegevens in respectievelijk 2D- of 3D-plots. Elke stip in de plots komt overeen met een dier en vertegenwoordigt een andere abstracte variabele. Kleurgecodeerde stippen worden gebruikt om de specifieke groepen te onderscheiden. Als zodanig weerspiegelen clusters van stippen vergelijkbare looppatronen die worden gedeeld door de overeenkomstige individuen.
    1. Open "PCA_PlotGenerator.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
    2. Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
    3. Zorg ervoor dat de PCA 2D- en 3D-plots worden weergegeven in de plotconsole (deelvenster rechtsboven). Elke kleur vertegenwoordigt een andere groep en de legenda wordt naast de plot weergegeven. Om de plot op te slaan, klikt u op Afbeelding opslaan in de plotconsole.
  6. Gebruik "Heatmap_PlotGenerator.py" om een heatmap te genereren. Zorg ervoor dat de heatmapgenerator een tabel maakt met de statistische verschillen tussen de basislijngroep (of controlegroep) en de andere groepen voor elke motorparameter27 (figuur 4). Elke kolom geeft één groep weer en elke regel heeft betrekking op een specifieke motorparameter.
    OPMERKING: Statistische analyse werd uitgevoerd met een eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest (voor normale verdelingen) of een Kruskal-Wallis ANOVA gevolgd door Dunn's post-hoctest (voor niet-normale verdelingen). Uitschieters werden uitgesloten van de analyse. P-waarden worden weergegeven door een kleurcode, waarbij rode en blauwe tinten een toename of afname aangeven ten opzichte van respectievelijk het besturingselement (of de basislijn). De kleurschakering vertegenwoordigt de statistische significantie, waarbij donkere kleuren een hogere betekenis hebben en lichtere kleuren een lagere betekenis. komt overeen met P < 0,001; ** komt overeen met P < 0,01; en * komt overeen met P < 0,05. Wit geeft geen variatie aan.
    1. Open "Heatmap_PlotGenerator.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
    2. Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
    3. Selecteer het type gegevens in het tweede automatische venster: onbewerkte gegevens of restgegevens. Als een optie niet is geselecteerd, zijn restgegevens de standaardinstelling.
    4. De heatmap wordt weergegeven in de plotconsole (deelvenster rechtsboven). Om de plot op te slaan, klikt u op Afbeelding opslaan in de plotconsole.
      OPMERKING: Het is verplicht dat het besturingselement (of de basislijn) de eerste groep in het Excel-bestand is.
  7. Gebruik "Boxplots_PlotGenerator.py" om de boxplots te genereren. Met deze tool kunnen boxplots worden gegenereerd die de verdeling van waarden voor alle motorparameters voor elke groep weergeven (figuur 5, figuur 6 en figuur 7).
    OPMERKING: Elk vak bevat de mediaan als de middelste lijn en de onder- en bovenranden van de vakken vertegenwoordigen respectievelijk het kwartiel van 25% en 75%. De snorharen vertegenwoordigen het bereik van de volledige dataset, exclusief uitschieters. Uitschieters worden gedefinieerd als elke waarde die 1,5 keer het interkwartielbereik onder of boven het kwartiel van respectievelijk 25% en 75% ligt.
    1. Open "Boxplots_PlotGenerator.py" in Spyder en voer de code uit door op de knop Afspelen te klikken.
    2. Selecteer het Excel-bestand dat u wilt analyseren en de bladnaam in het automatische venster. Als de bladnaam niet is gewijzigd, schrijft u "Blad1".
    3. Selecteer het type gegevens in het tweede automatische venster: onbewerkte gegevens of restgegevens. Als een optie niet is geselecteerd, zijn restgegevens de standaardinstelling.
    4. De boxplots verschijnen in de plotconsole (deelvenster rechtsboven). Om de plots op te slaan, klikt u op de knop Afbeelding opslaan of Alle afbeeldingen opslaan in de plotconsole.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het standaard BMS-systeem beschrijft de bruto motorische tekorten na SCI14. Vanwege het subjectieve karakter worden over het algemeen naast het BMS andere kwantitatieve tests uitgevoerd om een meer gedetailleerde en fijne beoordeling van de voortbeweging te produceren. Deze tests tonen echter geen specifieke informatie over stapcycli, stappatronen en coördinatie van de voorpoten-achterpoten, wat uiterst belangrijk is om te begrijpen hoe het spinale circuit de functie behoudt en zich aanpast aan ee...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt het potentieel van de MouseWalker-methode aangetoond door het locomotorisch gedrag na dwarslaesie te analyseren. Het biedt nieuwe inzichten in specifieke veranderingen in stap-, voetafdruk- en looppatronen die anders zouden worden gemist door andere standaardtests. Naast het leveren van een bijgewerkte versie van het MW-pakket, worden ook data-analysetools beschreven met behulp van de meegeleverde Python-scripts (zie stap 5).

Omdat de MW een grote dataset en een verzameling kinemati...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Laura Tucker en Natasa Loncarevic voor hun commentaar op het manuscript en de steun van de knaagdierfaciliteit van het Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes. De auteurs willen de financiële steun van Prémios Santa Casa Neurociências - Prijs Melo e Castro voor onderzoek naar dwarslaesie (MC-36/2020) aan L.S. en C.S.M. erkennen. Dit werk werd ondersteund door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA-COM/0151/2020), iNOVA4Health (UIDB/04462/2020 en UIDP/04462/2020), en LS4FUTURE (LA/P/0087/2020) aan C.S.M. L.S. werd ondersteund door een CEEC Individual Principal Investigator contract (2021.02253.CEECIND). A.F.I. werd ondersteund door een doctoraatsbeurs van FCT (2020.08168.BD). A.M.M. werd ondersteund door een doctoraatsbeurs van FCT (PD/BD/128445/2017). I.M. werd ondersteund door een postdoctoraal fellowship van FCT (SFRH/BPD/118051/2016). D.N.S. werd ondersteund door een doctoraatsbeurs van FCT (SFRH/BD/138636/2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
45º Spiegel 
2 aluminium profiel (2 x 2 cm), 16 cm hoogte, 1 aan elke kantMisumi
2 aluminium profiel (2 x 2 cm), 23 cm, @ 45°, 1 aan elke kantMisumi
1 aluminium profiel (2 x 2 cm), 83 cm langMisumi
87 x 23 cm spiegelAlgemene glazen leverancier 
zwart kartonnen vulling Algemene kantoorartikelen leverancierWe gebruikten 2, één met 69 x 6 cm en een andere met 69 x 3cm om de reflectie op de spiegel te beperken
Achtergrond achtergrondverlichting
109 x 23 cm plexiglas (0.9525 cm dik)Algemene hardware leverancier
2 zijdelingse aluminium profiel (4 x 4 cm), 20 cm lang, 1 aan elke kantMisumi
meerkleurige LED-stripAlgemene hardware leverancier
wit ondoorzichtig papier om het plexiglas te bedekkenAlgemene kantoorartikelen leverancier
fTIR Ondersteunende basis en poten
2 aluminium profiel (4 x 4 cm), 100 cm hoogteMisumi
60 x 30 cm meetkundig breadboardEdmund Optics #54-641
M6 12 mm schroevenEdmund Optics 
M6 zeskantmoeren en ringenEdmund Optics 
fTIR Loopbaan 
109 x 8.5 cm plexiglas (1.2 cm dik)Algemene hardware leverancier109 x 8.5 cm plexiglas (1.2 cm dik)
109 cm lange Base-U-kanaal aluminium met 1.6 cm hoogte x 1.9 cm diepte dik vouwen (om het plexiglas vast te houden)Algemene hardware leverancier
2 zijdelingse aluminium profiel (4 x 4 cm) 20 cm lengte, 1 aan elke kantMisumi
zwart kartonnen vulling Algemene kantoorartikelen leverancierwe gebruikten 2 vullingen aan elke kant om de grenzen van het plexiglas te bedekken, heldere randen te vermijden
M6 12 mm schroevenEdmund Optics 
Hoge snelheidscamera (op een statief)
Blackfly S USB3FLIR#BFS-U3-32S4M-CDit is een aanbeveling. De vereiste is om minimaal 100 frames per seconde op te nemen
Infinite Horizon Impactor 
Infinite Horizon Impactor Precision Systems and Instrumentation, LLC.#0400
Lens
Nikon AF Zoom-Nikkor 24-85mmNikon#1929Deze lens wordt aanbevolen, maar andere lenzen kunnen worden gebruikt. Zorg ervoor dat deze een grote opening bevat (d.w.z. kleinere F-stop waarden), om fTIR-signalen te vangen
Software
MATLAB R2022bMathWorks
Python 3.9.13 Python Software Foundation
Anaconda Navigator 2.1.4Anaconda, Inc.
Spyder 5.1.5 Spyder Project Contributors
Loopbaan muur 
2 grote rechthoekige acryl met 100 x 15 cmElke doe-het-zelf-supermarkt
2 trapezische acryl lateralen met 6-10 lengte x 15 cm hoogteElke doe-het-zelf-supermarkt
GitHub-materialen
MapnaamURL
Boxplotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/BoxplotsScript om Boxplots te maken
Docshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/DocsAanvullende documenten
Heatmaphttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/HeatmapsScript om heatmap te maken
Matlat scripthttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Matlab%20ScriptMouseWalker matlab script
PCAhttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/PCA%20plotsScript om Principal Component Analysis uit te voeren
Raw data Plotshttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Rawdata%20PlotsScript om Raw data plots te maken
Residuenanalysehttps://github.com/NeurogeneLocomotion/MouseWalker/tree/main/Residual_AnalysisCode om residuen uit Rauwe gegevens te berekenen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frigon, A. The neural control of interlimb coordination during mammalian locomotion. Journal of Neurophysiology. 117 (6), 2224-2241 (2017).
  2. Grillner, S. Biological pattern generation: The cellular and computational logic of networks in motion. Neuron. 52 (5), 751-766 (2006).
  3. Dominici, N., et al. locomotor primitives in newborn babies and their development. Science. 334 (6058), 997-999 (2011).
  4. Courtine, G., et al. Kinematic and EMG determinants in quadrupedal locomotion of a non-human primate (Rhesus). Journal of Neurophysiology. 93 (6), 3127-3145 (2005).
  5. Clarac, F., Cattaert, D., le Ray, D. Central control components of a 'simple' stretch reflex. Trends Neuroscience. 23 (5), 199-208 (2000).
  6. Squair, J. W., Gautier, M., Sofroniew, M. V., Courtine, G., Anderson, M. A. Engineering spinal cord repair. Current Opinion in Biotechnology. 72, 48-53 (2021).
  7. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  8. Grillner, S. The spinal locomotor CPG: A target after spinal cord injury. Progress in Brain Research. 137, 97-108 (2002).
  9. Boulain, M., et al. Synergistic interaction between sensory inputs and propriospinal signalling underlying quadrupedal locomotion. Journal of Physiology. 599 (19), 4477-4496 (2021).
  10. Skarlatou, S., et al. Afadin signaling at the spinal neuroepithelium regulates central canal formation and gait selection. Cell Reports. 31 (10), 107741(2020).
  11. Viala, D., Vidal, C. Evidence for distinct spinal locomotion generators supplying respectively fore-and hindlimbs in the rabbit. Brain Research. 155 (1), 182-186 (1978).
  12. Silver, J., Miller, J. H. Regeneration beyond the glial scar. Nature Reviews Neuroscience. 5 (2), 146-156 (2004).
  13. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats. Journal of Neurotrauma. 12 (1), 1-21 (1995).
  14. Basso, D. M., et al. Basso mouse scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. Journal of Neurotrauma. 23 (5), 635-659 (2006).
  15. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an accelerating rotarod. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  16. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), e1204(2009).
  17. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore-and hindlimb stepping, placing, and coordination. Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  18. Wallace, J. E., Krauter, E. E., Campbell, B. A. Motor and reflexive behavior in the aging rat. Journal of Gerontology. 35 (3), 364-370 (1980).
  19. Carter, R. J., et al. Characterization of progressive motor deficits in mice transgenic for the human Huntington's disease mutation. The Journal of Neuroscience. 19 (8), 3248-3257 (1999).
  20. Leblond, H., L'espérance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Behavioral/systems/cognitive treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. The Journal of Neuroscience. 23 (36), 11411-11419 (2003).
  21. Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nature Medicine. 14 (1), 69-74 (2008).
  22. Hamers, F. P. T., Koopmans, G. C., Joosten, E. A. J. CatWalk-assisted gait analysis in the assessment of spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 23 (3-4), 537-548 (2006).
  23. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50(2015).
  24. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Stauch, K. L., et al. Applying the ratwalker system for gait analysis in a genetic rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments. (167), e62002(2021).
  26. Mendes, C. S., Rajendren, S. V., Bartos, I., Márka, S., Mann, R. S. Kinematic responses to changes in walking orientation and gravitational load in Drosophila melanogaster. PLoS One. 9 (10), e109204(2014).
  27. Cabrita, A., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  28. Bishop, C. M. Pattern Recognition and Machine Learning. , Springer. Delhi, India. (2006).
  29. vander Maaten, L., Postma, E., vanden Herik, J. Dimensionality reduction: A comparative review. , Tilburg University. The Netherlands.. http://www.uvt.nl/ticc (2009).
  30. Courtine, G., et al. Performance of locomotion and foot grasping following a unilateral thoracic corticospinal tract lesion in monkeys (Macaca mulatta). Brain. 128 (10), 2338-2358 (2005).
  31. Drew, T., Jiang, W., Kably, B., Lavoie, S. Role of the motor cortex in the control of visually triggered gait modifications. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 74 (4), 426-442 (1996).
  32. Cheng, H., et al. Gait analysis of adult paraplegic rats after spinal cord repair. Experimental Neurology. 148 (2), 544-557 (1997).
  33. Thibaudier, Y., et al. Interlimb coordination during tied-belt and transverse split-belt locomotion before and after an incomplete spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1751-1765 (2017).
  34. Bellardita, C., Kiehn, O. Phenotypic characterization of speed-associated gait changes in mice reveals modular organization of locomotor networks. Current Biology. 25 (11), 1426-1436 (2015).
  35. Machado, A. S., Marques, H. G., Duarte, D. F., Darmohray, D. M., Carey, M. R. Shared and specific signatures of locomotor ataxia in mutant mice. eLife. 9, 55356(2020).
  36. Takeoka, A., Vollenweider, I., Courtine, G., Arber, S. Muscle spindle feedback directs locomotor recovery and circuit reorganization after spinal cord injury. Cell. 159 (7), 1626-1639 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MouseWalker SystemSpinal Cord InjuryLocomotor DysfunctionGait QuantificationMouse ModelMotor CoordinationKinematic AnalysisBehavioral AssaysOpen Source ToolsFootprint Patterns

Related Articles