Gedecellulariseerde van appel afgeleide steigers voor botweefselengineering in vitro en in vivo

Summary

In deze studie beschrijven we methoden voor decellularisatie, fysieke karakterisering, beeldvorming en in vivo implantatie van plantaardige biomaterialen, evenals methoden voor celzaaiing en differentiatie in de steigers. De beschreven methoden maken het mogelijk om plantaardige biomaterialen te evalueren voor toepassingen op het gebied van botweefseltechnologie.

Abstract

Biomaterialen van plantaardige cellulose zijn gebruikt in verschillende toepassingen voor weefselmanipulatie. In vivo studies hebben de opmerkelijke biocompatibiliteit aangetoond van steigers gemaakt van cellulose afkomstig van natuurlijke bronnen. Bovendien bezitten deze steigers structurele kenmerken die relevant zijn voor meerdere weefsels, en bevorderen ze de invasie en proliferatie van zoogdiercellen. Recent onderzoek met behulp van gedecellulariseerd appelhypanthiumweefsel heeft de gelijkenis van de poriegrootte met die van trabeculair bot aangetoond, evenals het vermogen om osteogene differentiatie effectief te ondersteunen. De huidige studie onderzocht verder het potentieel van van appel afgeleide cellulosesteigers voor botweefselmanipulatie (AHO) toepassingen en evalueerde hun in vitro en in vivo mechanische eigenschappen. MC3T3-E1 preosteoblasten werden gezaaid in van appels afgeleide cellulosesteigers die vervolgens werden beoordeeld op hun osteogene potentieel en mechanische eigenschappen. Alkalische fosfatase en alizarinerode S-kleuring bevestigden osteogene differentiatie in steigers gekweekt in differentiatiemedium. Histologisch onderzoek toonde wijdverspreide celinvasie en mineralisatie over de steigers aan. Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) onthulde minerale aggregaten op het oppervlak van de steigers en energiedispersieve spectroscopie (EDS) bevestigde de aanwezigheid van fosfaat- en calciumelementen. Ondanks een significante toename van de Young-modulus na celdifferentiatie, bleef deze echter lager dan die van gezond botweefsel. In vivo studies toonden celinfiltratie en afzetting van extracellulaire matrix in de gedecellulariseerde van appel afgeleide steigers na 8 weken implantatie in calvaria van ratten. Bovendien was de kracht die nodig was om de steigers van het botdefect te verwijderen vergelijkbaar met de eerder gerapporteerde fractuurbelasting van inheems calvariaal bot. Over het algemeen bevestigt deze studie dat van appel afgeleide cellulose een veelbelovende kandidaat is voor AHO-toepassingen. Het verschil tussen de mechanische eigenschappen en die van gezond botweefsel kan de toepassing ervan echter beperken tot scenario's met een lage belasting. Aanvullende structurele re-engineering en optimalisatie kunnen nodig zijn om de mechanische eigenschappen van van appel afgeleide cellulosesteigers voor dragende toepassingen te verbeteren.

Introduction

Grote botdefecten veroorzaakt door een verwonding of ziekte vereisen vaak biomateriaaltransplantaten voor volledige regeneratie¹. De huidige technieken die zijn ontworpen om de regeneratie van botweefsel te verbeteren, maken regelmatig gebruik van autologe, allogene, xenogene of synthetische transplantaten². Voor autologe bottransplantatie, beschouwd als de "gouden standaard" -transplantatiepraktijk om grote botdefecten te herstellen, wordt bot uit de patiënt gehaald. Deze entprocedure heeft echter verschillende nadelen, waaronder beperkingen van grootte en vorm, beschikbaarheid van weefsel en^{morbiditeit op} de bemonsteringsplaats3. Bovendien zijn autologe transplantatieprocedures vatbaar voor postoperatieve wondinfecties, daaropvolgende fracturen, hematoomvorming op de bemonsterings- of gereconstrueerde plaats en postoperatieve pijn⁴. Bone tissue engineering (AHO) biedt een potentieel alternatief voor conventionele bottransplantatiemethoden⁵. Het combineert structurele biomaterialen en cellen om nieuw functioneel botweefsel op te bouwen. Bij het ontwerpen van biomaterialen voor BTE is het van cruciaal belang om een macroporeuze structuur, oppervlaktechemie die celhechting bevordert en mechanische eigenschappen te combineren die sterk lijken op die van natuurlijk bot⁶. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de ideale poriegrootte en elasticiteitsmodulus voor biomaterialen die in AHO worden gebruikt, respectievelijk ongeveer 100-200 μm⁷ en 0,1-20 GPa zijn, afhankelijk van de entplaats⁸. Bovendien zijn de porositeit en poriëninterconnectiviteit van de steigers kritische factoren die van invloed zijn op celmigratie, diffusie van voedingsstoffen en angiogenese⁸.

BTE heeft veelbelovende resultaten laten zien met verschillende biomaterialen die zijn ontwikkeld en geëvalueerd als alternatieve opties voor bottransplantaten. Sommige van deze biomaterialen zijn osteoinductieve materialen, hybride materialen en geavanceerde hydrogels⁸. Osteoinductieve materialen stimuleren de ontwikkeling van nieuw gevormde botstructuren. Hybride materialen zijn samengesteld uit synthetische en/of natuurlijke polymeren⁸. Geavanceerde hydrogels bootsen de extracellulaire matrix (ECM) na en zijn in staat om de nodige bioactieve factoren af te geven om de integratie van botweefsel te bevorderen⁸. Hydroxyapatiet is een traditioneel materiaal en een veel voorkomende keuze voor AHO vanwege de samenstelling en biocompatibiliteit⁹. Bioactief glas is een ander type biomateriaal voor AHO, waarvan is aangetoond dat het specifieke celreacties stimuleert om genen te activeren die nodig zijn voor osteogenese^10,11. Biologisch afbreekbare polymeren, waaronder poly(glycolzuur) en poly(melkzuur), zijn ook op grote schaal gebruikt in AHO-toepassingen¹². Ten slotte hebben natuurlijke of natuurlijk afgeleide polymeren zoals chitosan, chitine en bacteriële cellulose ook bemoedigende resultaten voor BTE¹³ aangetoond. Hoewel zowel synthetische als natuurlijke polymeren potentieel hebben voor AHO, vereist de ontwikkeling van een functionele steiger met de gewenste macrostructuur doorgaans uitgebreide protocollen.

Omgekeerd kunnen inheemse macroscopische cellulosestructuren gemakkelijk worden afgeleid uit diverse planten en onze onderzoeksgroep heeft eerder de toepasbaarheid aangetoond van op cellulose gebaseerde steigers afgeleid van planten op verschillende weefselreconstructies. Na een eenvoudige behandeling met oppervlakteactieve stoffen hebben we de inherente structuur van het plantmateriaal benut en het potentieel ervan als veelzijdig biomateriaal benadrukt¹⁴. Bovendien kunnen deze op cellulose gebaseerde steigers worden gebruikt voor in vitro celkweektoepassingen van zoogdieren¹⁴, zijn ze biocompatibel en ondersteunen ze spontane subcutane vascularisatie 14,15,16,17. Zowel onze onderzoeksgroep als anderen hebben aangetoond dat deze steigers kunnen worden verkregen uit specifieke planten op basis van de beoogde toepassing 14,15,16,17,18,19,20. De vasculaire structuur die wordt waargenomen in plantenstengels en -bladeren vertoont bijvoorbeeld een opvallende gelijkenis met de structuur die wordt aangetroffen in dierlijke weefsels¹⁹. Bovendien kunnen cellulosesteigers afkomstig van planten gemakkelijk worden gevormd en onderworpen aan biochemische modificaties aan het oppervlak om de gewenste eigenschappen te bereiken¹⁶. In een recente studie hebben we een zoutbuffer opgenomen tijdens het decellularisatieproces, wat leidt tot een verbeterde celhechting die zowel in vitro als in vivo wordt waargenomen¹⁶. In dezelfde studie toonden we de toepasbaarheid van plantaardige cellulosesteigers in composiet biomaterialen aan door hydrogels op het oppervlak van de steigers te gieten. In recente studies is aangetoond dat de functionalisering van plantaardige steigers hun effectiviteit^verbetert18. Een studie uitgevoerd door Fontana et al. (2017) onthulde bijvoorbeeld dat de hechting van menselijke dermale fibroblasten werd ondersteund door RGD-gecoate gedecellulariseerde stengels, terwijl niet-gecoate stengels niet hetzelfde vermogen vertoonden¹⁸. Bovendien toonden de auteurs ook aan dat gemodificeerde gesimuleerde lichaamsvloeistof kan worden gebruikt om gedecellulariseerde plantenstengels kunstmatig te mineraliseren. In recentere studies onderzochten we het concept van mechanosensitieve osteogenese in plantaardige cellulosesteigers en beoordeelden we hun potentieel voor BTE^17,20. Bovendien gebruikten Lee et al. (2019) plantaardige steigers om botachtige weefsels te cultiveren in een in vitro-setting ²¹. Door middel van uitgebreide evaluaties van verschillende plantaardige bronnen, identificeerden de auteurs van appels afgeleide steigers als de meest optimale voor de kweek en differentiatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). Bovendien stelden de auteurs voor dat de structurele en mechanische kenmerken van de van appels afgeleide steigers een cruciale rol spelen bij hun geschiktheid voor het beoogde doel. Omdat het de eerste van planten afgeleide steigers zijn die worden geïmplementeerd in weefselmanipulatietoepassingen, is uitgebreid aangetoond dat van appel afgeleide steigers een opvallend vergelijkbare architectuur hebben als die van menselijk bot, met name in termen van hun onderling verbonden poriën variërend van 100 tot 200 μm in diameter^14,21.

In de huidige studie onderzochten we verder het potentieel van van appels afgeleide cellulosesteigers voor AHO en voerden we een analyse uit van hun mechanische eigenschappen, zowel in vitro als in vivo. Hoewel er studies zijn gedaan naar het potentieel van van appels afgeleide steigers voor BTE 17,20,21, zijn hun mechanische eigenschappen onvoldoende onderzocht. De resultaten toonden wildverspreide invasie en osteogene differentiatie van MC3T3-E1 preosteoblasten gezaaid in steigers die gedurende 4 weken in differentiatiemedium werden gekweekt. De Young-modulus van deze steigers was 192,0 ± 16,6 kPa, wat aanzienlijk hoger was dan die van de blanco steigers (steigers zonder gezaaide cellen) (31,6 ± 4,8 kPa) en de met cellen bezaaide steigers gekweekt in niet-differentiatiemedium (24,1 ± 8,8 kPa). Er moet echter worden opgemerkt dat de Young-modulus van gezond menselijk botweefsel doorgaans binnen het bereik van 0.1-2 GPa valt voor trabeculair bot en ongeveer 15-20 GPa voor corticaal bot⁸. Desalniettemin, na een implantatie van 8 weken in een knaagdier calvariaal defect, leken de met cellen gezaaide steigers goed geïntegreerd te zijn in het omringende bot, zoals blijkt uit een gemiddelde piekkracht van 113,6 N ± 18,2 N in push-outtests, wat vergelijkbaar is met de eerder gerapporteerde fractuurbelasting van native calvariaal bot²². Over het algemeen zijn de resultaten van deze studie veelbelovend, met name voor niet-dragende toepassingen. Van appel afgeleide cellulosesteigers bezitten momenteel echter niet de nodige mechanische eigenschappen om precies overeen te komen met het omringende botweefsel op een implantaatplaats. Daarom is verdere ontwikkeling nodig om het volledige potentieel van deze steigers te ontsluiten.

Protocol

De experimentele protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Ottawa.

1. Voorbereiding van de steiger

1. Snijd McIntosh-appels (Canada Fancy) met een mandolinesnijder in plakken van 8 mm dik. Snijd het hypanthiumweefsel van de appelschijfjes in vierkanten van 5 mm x 5 mm.
2. Plaats de vierkante monsters gedurende 2 dagen in 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS).
3. Was de gedecellulariseerde monsters met gedeïoniseerd water en incubeer ze een nacht bij kamertemperatuur (RT) in 100 mM CaCl₂ om de resterende oppervlakteactieve stof te verwijderen.
4. Steriliseer de monsters (d.w.z. steigers) gedurende 30 minuten in 70% ethanol, was ze met gedeïoniseerd water en plaats ze in een kweekplaat met 24 putjes voordat ze worden gezaaid.

2. Celkweek en steigerzaaien

1. Onderhoud MC3T3-E1 Subclone 4-cellen in met celkweek behandelde schalen met een diameter van 10 cm in celkweekomstandigheden (37°C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO₂).
2. Bereid celkweekmedium gemaakt van Eagle's minimale essentiële medium - alfamodificatie (α-MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.
3. Maak de cellen los van de kweekschalen door trypsinisatie (0,05% trypsine-EDTA) zodra ze 80% confluentie hebben bereikt.
4. Centrifugeer de celsuspensie bij c.a. 200 x g gedurende 3 min. Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in α-MEM bij 2,5 x 10⁷ cellen per ml.
5. Pipetteer een aliquot van 40 μl van de celsuspensie op het oppervlak van de steigers en laat de cellen gedurende 1 uur hechten in celkweekomstandigheden. Voeg vervolgens 2 ml kweekmedium toe aan elk kweekputje van de kweekplaat.
6. Vul het kweekmedium elke 2-3 dagen gedurende 14 dagen aan.
7. Bereid een differentiatiemedium voor door 50 μg/ml ascorbinezuur en 4 mM natriumfosfaat toe te voegen aan het eerder beschreven celkweekmedium.
8. Induceer differentiatie van MC3T3-E1-cellen door de scaffolds gedurende 4 weken in differentiatiemedium te incuberen. Vul het medium elke 3-4 dagen aan. Tegelijkertijd incuberen scaffolds in niet-differentiatiecultuurmedium (d.w.z. medium zonder de supplementen om differentiatie te induceren) voor dezelfde duur, met hetzelfde mediumveranderingsschema om als negatieve controle te dienen.

3. Metingen van de poriegrootte met behulp van confocale laserscanmicroscopie

1. Was de gedecellulariseerde van appel afgeleide steigers met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
2. Incubeer de steigers in 1 ml 10% (v/v) calcofluor witte beits gedurende 25 minuten in het donker bij RT.
3. Was de steigers (n = 3) met PBS en breng drie willekeurig geselecteerde gebieden per steiger in beeld met een hogesnelheidsresonantie confocale laserscanmicroscoop (CLSM) met een vergroting van 10x, met behulp van een DAPI-kanaal, als volgt:
   1. Configuratie laser-emissiefilter: 405 nm (laser); 425-475 Nm (emissie)
   2. Pas het laservermogen en de detector handmatig aan om een optimale beeldacquisitie te garanderen. Verkrijg een z-stack van 20 afbeeldingen met een stapgrootte van 5 μm.
4. Gebruik de ImageJ-software om de confocale beelden als volgt te verwerken en te analyseren:
   1. Gebruik de functie Z-Project tot maximale intensiteit om een afbeelding te maken en pas de functie Randen zoeken toe om de rand van de poriën te markeren.
   2. Traceer de poriën handmatig met behulp van het gereedschap Selectie uit de vrije hand .
   3. Pas elke porie als een ellips, meet de lengte van de hoofdas, verzamel alle metingen (in totaal 54 in de huidige studie - 6 in 3 willekeurig geselecteerde gebieden voor elke steiger) en bereken de gemiddelde lengte.

4. Analyse van de celdistributie met behulp van confocale laserscanmicroscopie

1. Was de met cellen bezaaide steigers die in het niet-differentiatie- of differentiatiemedium zijn gekweekt, driemaal met PBS. Bevestig de steigers met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.
2. Was elke steiger grondig met gedeïoniseerd water, permeabiliseer de cellen gedurende 5 minuten met een Triton-X 100-oplossing en was opnieuw met PBS.
3. Incubeer de steigers in 1 ml 1% periodiek zuur gedurende 40 minuten en spoel ze af met gedeïoniseerd water^14,16.
4. Incubeer de steigers in 1 ml van een oplossing die 100 mM natriummetabisulfiet en 0,15 M zoutzuur bevat, aangevuld met 100 μg/ml propidiumjodide. Dompel de steigers volledig onder in de oplossing.
5. Was de steigers met PBS en kleur de celkernen door de steigers gedurende 10 minuten in het donker te incuberen in een 5 mg/ml DAPI-oplossing. Was opnieuw grondig en bewaar de steigers in PBS voordat u de beeldvorming uitvoert.
6. Beeld drie willekeurig geselecteerde oppervlakken van drie verschillende celgezaaide steigers met een snelle resonantie CLSM bij een vergroting van 10x, met behulp van DAPI- en TRITC-kanalen, als volgt:
   1. Configuratie laser-emissiefilter:
      DAPI: Laser: 405 nm; Emissie: 425-475 nm
      TRITC: Laser: 561 nm; Emissie: 570-620 nm
   2. Pas het laservermogen en de detector handmatig aan om een optimale beeldacquisitie te garanderen. Verkrijg een z-stack van 20 afbeeldingen met een stapgrootte van 5 μm.
7. Gebruik ImageJ-software om de confocale beelden te verwerken en een maximale projectie in de z-as te creëren voor beeldanalyse met behulp van de functie Z-Project tot maximale intensiteit .

5. Alkalische fosfatase-analyse

1. Was de met cellen bezaaide steigers die in het niet-differentiatie- of differentiatiemedium zijn gekweekt, driemaal met PBS. Bevestig de steigers met 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 30 minuten. Repareer lege steigers (steigers zonder zaadcellen) om als negatieve controle te dienen.
2. Bereid een kleuringsoplossing van 5-broom-4-chloor-3'-indolyfosfaat en nitroblauwtetrazolium (BCIP/NBT) door één BCIP/NBT-tablet op te lossen in 10 ml gedeïoniseerd water.
3. Was de vaste steigers met een 0.05% Tween-oplossing en kleur ze gedurende 20 minuten met de BCIP/NBT-oplossing bij RT. Was de bevlekte steigers met een 0.05% Tween-oplossing en bewaar ze in PBS voorafgaand aan de beeldvorming.
4. Stel je de bevlekte steigers voor met een 12-megapixel digitale camera.

6. Analyse van calciumdepositie

1. Was de met cellen bezaaide steigers die in het niet-differentiatie- of differentiatiemedium zijn gekweekt, driemaal met PBS. Bevestig de steigers met 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 30 minuten. Repareer lege steigers (steigers zonder zaadcellen) om als negatieve controle te dienen.
2. Bereid een 2% (w/v) alizarinerode S (ARS) kleuringsoplossing.
3. Was de vaste steigers met gedeïoniseerd water en kleur ze met de ARS-oplossing gedurende 1 uur bij RT. Was de bevlekte steigers met gedeïoniseerd water en bewaar ze in PBS voordat ze worden geïoniseerd.
4. Stel je de bevlekte steigers voor met een 12-megapixel digitale camera.

7. Mineralisatie analyse

1. Was de met cellen bezaaide steigers die in het niet-differentiatie- of differentiatiemedium zijn gekweekt, driemaal met PBS. Bevestig de steigers met 4% paraformaldehyde gedurende 48 uur. Repareer lege steigers (steigers zonder zaadcellen) om als negatieve controle te dienen.
2. Dehydrateer de monsters in oplossingen met ethanolconcentraties die oplopen van 50% tot 100%, zoals eerder beschreven²³.
3. Voer scanning-elektronenmicroscopie (SEM) en energiedispersieve spectroscopie (EDS) uit om minerale aggregaten als volgt te analyseren:
   1. Droog de monsters met behulp van een kritische puntdroger, volgens het protocol van de fabrikant²⁴.
   2. Breng een 5-nm goudlaag aan op de steigers met behulp van een gouden sputtercoater, volgens het protocol van de fabrikant²⁵.
   3. Breng het oppervlak van de steigers in beeld met een scanning-elektronenmicroscoop ingesteld op 3 kV, bij een vergroting van 85x.
   4. Voer EDS uit door de scanning-elektronenmicroscoop in te stellen op 15 kV. Verkrijg op drie willekeurig geselecteerde gebieden per steiger EDS-spectra voor analyse van de samenstelling van minerale aggregaten.

8. Young's modulusmetingen

1. Verwijder de met cellen bezaaide steigers uit hun respectievelijke incubatiemedium en test de monsters onmiddellijk.
2. Met behulp van een op maat gemaakt uniaxiaal compressieapparaat uitgerust met een 1,5 N load cell, drukt u de steigers (n = 3 per toestand) samen met een constante snelheid van 3 mm·^min-1 tot een maximale drukrek van 10% van de steigerhoogte.
3. Bepaal de Young's modulus uit de helling van het lineaire gedeelte van de spanning-rek curven. In de huidige studie werd de modulus bepaald tussen 9% en 10% rek.

9. Celinfiltratie en mineralisatieanalyse door histologie: In vitro steigers

1. Was de met cellen bezaaide steigers die zijn gekweekt in niet-differentiatie- of differentiatiemedium driemaal met PBS.
2. Fixeer de met cellen bezaaide steigers gedurende 48 uur met 4% paraformaldehyde voordat ze opnieuw worden gesuspt in 70% ethanol voor opslag.
3. Histologie:
   OPMERKING: In de huidige studie werd de volledige histologische voorbereiding (inbedding, doorsnede en kleuring) beschreven in de volgende stappen uitgevoerd door de Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa).
   1. Na uitdroging en inbedding in paraffine, snijdt u de monsters in seriële secties van 5 μm dik, beginnend 1 mm in de steigers, en monteert u de secties op microscoopglaasjes.
   2. Kleur de secties met hematoxyline en eosine (H&E) of von Kossa (VK) vlekken.
   3. Breng de secties in beeld met een diascannermicroscoop bij een vergroting van 40x (n = 1 steiger in niet-differentiatiemedium en n = 2 steigers in differentiatiemedium in de huidige studie).
   4. Evalueer met behulp van ImageJ-software de infiltratie van cellen (H&E-kleuring) en mineralisatie (VK-kleuring) visueel.

10. Model met calvariaal defect bij ratten

1. Laat experimentele protocollen beoordelen en goedkeuren door de plaatselijke dierenverzorgingscommissie.
2. Bereid ronde (5 mm diameter en 1 mm dikte) gedecellulariseerde steigers voor volgens sectie 1 hierboven beschreven en met behulp van een biopsiepons van 5 mm.
3. Voer bilaterale craniotomie uit volgens een vastgesteld protocol²⁶, als volgt:
   1. Verdoof mannelijke Sprague-Dawley-ratten met isofluraan, eerst met 3% totdat ze bewusteloos zijn, en vervolgens met 2-3% tijdens de procedure.
   2. Leg het periosteum en de schedel bloot door met een scalpelmesje in de bovenliggende huid te snijden. Verwijder het periosteum.
   3. Creëer bilaterale defecten in beide pariëtale botten aan weerszijden van de sagittale hechting met behulp van een tandartsboor uitgerust met een trephine met een diameter van 5 mm onder constante irrigatie van 0,9% NaCl.
   4. Reinig het omringende bot met 0,9% NaCl om eventuele botfragmenten te verwijderen.
   5. Plaats de cirkelvormige, gedecellulariseerde steigers in de defecten.
   6. Sluit de bovenliggende huid met 4-0 hechtingen.
4. Geef de ratten onbeperkt toegang tot voedsel en water en houd ze dagelijks in de gaten.
5. Na 8 weken na implantatie de ratten euthanaseren door CO₂ -inhalatie en thoracale perforatie als secundaire euthanasiemaatregel.
6. Om de schedel bloot te leggen en de implantaten op te halen, verwijdert u de huid die de schedel bedekt met een scalpelmesje.
7. Snijd de schedel bij de frontale en occipitale botten en aan de zijkant van beide pariëtale botten met behulp van een tandartsboor om het bovenste deel van de schedel volledig te verwijderen.

11. Push-out test

1. Sluit een uniaxiaal compressieapparaat (met een 445 N load cell) aan op de USB-data-acquisitiemodule.
2. Sluit de data-acquisitiemodule aan op een computer die is uitgerust met een softwaretoepassing voor data-acquisitie.
3. Plaats onmiddellijk na craniale extractie elk monster (n = 7 implantaten van 4 dieren in het huidige onderzoek) op de monsterhouder van het uniaxiale compressieapparaat, zodat de dorsale zijde van het bot naar boven wijst.
4. Laat de zuiger met 0.5 mm/min zakken totdat u het geëxtraheerde implantaat lichtjes raakt.
5. Start de test door de zuiger door het implantaat te laten zakken totdat deze volledig is weggedrukt terwijl u compressie toepast met een constante snelheid van 0,5 mm/min met behulp van de data-acquisitiesoftware.
6. Registreer de piekkracht op de kracht-verplaatsingscurve met behulp van de data-acquisitiesoftware.

12. Celinfiltratie en mineralisatieanalyse door histologie: In vivo steigers

1. Fixeer de geëxtraheerde calvaria en implantaten gedurende 72 uur in 10% neutraal gebufferde formaline voordat ze opnieuw worden gesuspt in 70% ethanol voor opslag.
2. Histologie:
   OPMERKING: In de huidige studie werd alle histologische voorbereiding (inbedding, doorsnede en kleuring) beschreven in de volgende stappen uitgevoerd door Accel Labs (Montreal, QC, Canada).
   1. Snijd de monsters (ingebed in methylmethacrylaat) in secties van 6 μm dik op drie verschillende niveaus (boven, onder en naar het midden) en monteer ze op microscoopglaasjes.
   2. Beits de secties met H&E of Masson-Goldner's trichrome (MGT).
3. Breng de secties in beeld met een diascannermicroscoop met een vergroting van 40x (4 explantaten van 2 dieren in de huidige studie).
4. Evalueer met behulp van ImageJ-software visueel celinfiltratie (H&E-kleuring) en collageenafzetting (MGT-kleuring).

Results

Meting van de poriegrootte, celverdeling en in vitro mineralisatie (Figuur 1 en Figuur 2)
Volledige verwijdering van native cellulaire componenten van de appelweefselsteigers werd bereikt na behandeling van de steigers met SDS en CaCl₂ (Figuur 1A). De steigers vertoonden een zeer poreuze structuur, die werd bevestigd met behulp van confocale microscopie. De kwantificering van de beelden toonde een gemiddelde poriegrootte van 154 μm ± 40 μm. De verdeling van de poriegrootte varieerde tussen 73 μm en 288 μm. De meerderheid van de poriën varieerde echter tussen 100 μm en 200 μm (figuur 1C).

Na een kweekperiode van 4 weken in differentiatiemedium vertoonden de met cellen bezaaide steigers wijdverspreide witte minerale afzettingen (Figuur 1A). De steigers met cellen vertoonden een ondoorzichtige witte kleur, wat mineralisatie suggereert, wat niet werd waargenomen in de lege steigers (steigers zonder gezaaide cellen). Bovendien bleek uit analyse met behulp van confocale laserscanmicroscopie dat de cellen homogeen verdeeld waren in de steigers (Figuur 1B).

Steigers die al dan niet met cellen waren bezaaid, werden gekleurd met BCIP/NBT en ARS om respectievelijk ALP-activiteit en mineralisatie te analyseren (Figuur 1D). De BCIP/NBT-kleuring onthulde een substantiële toename van ALP-activiteit (weergegeven door een sterke paarse kleur) in de celgezaaide steigers gekweekt in differentiatiemedium, in tegenstelling tot de blanco steigers of de celgezaaide steigers gekweekt in niet-differentiatiemedium. Evenzo vertoonden de in cellen gezaaide steigers die in differentiatiemedium waren gekweekt een intensere rode kleur bij kleuring met ARS, wat wijst op een grotere mineralisatie in vergelijking met de blanco steigers of de celgezaaide steigers die in niet-differentiatiemedium waren gekweekt. Achtergrondkleuring werd waargenomen in de lege steigers, mogelijk als gevolg van de aanwezigheid van CaCl₂ in het decellularisatieprotocol.

Kleuring (H&E en VK) werd uitgevoerd op de steigers om celinfiltratie en mineralisatie te analyseren, en SEM en EDS werden gebruikt om de mineralisatie verder te evalueren (Figuur 2). H&E-kleuring (Figuur 2A) toonde een goede celinfiltratie in de met cellen bezaaide steigers die waren gekweekt in niet-differentiatie- of differentiatiemedium. Meerdere kernen waren zichtbaar in de periferie en in de steigers. De aanwezigheid van collageen werd ook waargenomen in de steigers in lichtroze. Bovendien bleek uit VK-kleuring op de steigers na 4 weken kweken in differentiatiemedium dat de poriewanden gekleurd waren, terwijl calciumafzettingen alleen langs de buitenranden van de poriewanden werden gedetecteerd in de steigers die waren gekweekt in niet-differentiatiemedium en mogelijk het gevolg waren van calciumabsorptie tijdens de decellularisatiebehandeling. Gelokaliseerde mineralisatie op het oppervlak van de met cellen bezaaide steigers die gedurende 4 weken in differentiatiemedium waren gekweekt, werd waargenomen door SEM-analyse (Figuur 2B). Meer specifiek werden minerale afzettingen waargenomen die lijken op sferoïde aggregaten aan de rand van de poriën. Daarentegen werden er geen minerale aggregaten waargenomen op de blanco steigers of de celgezaaide steigers die gedurende 4 weken in niet-differentiatiemedium werden gekweekt. Duidelijke karakteristieke pieken die overeenkomen met fosfor (P) en calcium (Ca) werden waargenomen in de EDS-spectra van de geselecteerde interessegebieden, met name op de minerale afzettingen die werden waargenomen op de met cellen bezaaide steigers die gedurende 4 weken in differentiatiemedium werden gekweekt (Figuur 2B).

In-vitrobiomechanische analyse (figuur 3)
De Young's modulus van de met cellen gezaaide steigers werd gemeten na 4 weken kweek in niet-differentiatie- of differentiatiemedium (n = 3 voor elke experimentele conditie). Het werd vergeleken met Young's modulus van de blanco steigers (steigers zonder zaadcellen) (Figuur 3). Er werd geen significant verschil waargenomen in de modulus tussen de blanco steigers (31,6 kPa ± 4,8 kPa) en de celgezaaide steigers gekweekt in niet-differentiatiemedium (24,1 kPa ± 8,8 kPa; p = 0,88). Daarentegen werd een significant verschil opgemerkt tussen de modulus van de blanco steigers (31,6 kPa ± 4,8 kPa) en die van de in cellen gezaaide steigers gekweekt in differentiatiemedium (192,0 kPa ± 16,6 kPa; p < 0,001). Bovendien werd een significant verschil (p < 0,001) waargenomen tussen de Young's moduli van de met cellen gezaaide steigers die waren gekweekt in niet-differentiatie- en differentiatiemedia. Aanvullende figuur 1 toont een typische spannings-rekcurve voor de berekening van de Young-modulus.

In vivo biomechanische prestaties en botregeneratie (Figuur 4 en Figuur 5)
Chirurgische craniotomieën werden uitgevoerd op in totaal 6 Sprague-Dawley-ratten. Bilaterale defecten met een diameter van 5 mm werden gecreëerd in beide pariëtale botten van de schedel met behulp van een trephineboor, en van appel afgeleide cellulosesteigers zonder zaadcellen werden geïmplanteerd in de calvariale defecten (Figuur 4A). Na 8 weken implantatie werden de dieren geëuthanaseerd en werd het bovenste deel van hun schedel verzameld en verwerkt voor mechanische tests of histologische analyse.

Op basis van visuele beoordeling leken de steigers goed geïntegreerd in de schedel die weefsels omringt. Mechanische push-out tests werden uitgevoerd om de integratie van de steigers (n = 7) in de gastheercalvaria kwantitatief te beoordelen. De metingen werden uitgevoerd met behulp van een uniaxiaal compressieapparaat (figuur 4B) onmiddellijk na de euthanasie van de dieren. Uit de resultaten bleek dat de piekkracht 113,6 N ± 18,2 N bedroeg (tabel 1).

Histologische analyse werd uitgevoerd om celinfiltratie en afzetting van extracellulaire matrix in de geïmplanteerde steigers te beoordelen (Figuur 5). H&E-kleuring onthulde cellulaire infiltratie in de poriën van de steiger en bewijs van vascularisatie, zoals blijkt uit de aanwezigheid van bloedvaten in de steigers. Bovendien toonde MGT-kleuring de aanwezigheid van collageen in de steigers aan.

Figuur 1: Steigerbeelden, poriegrootteverdeling en in vitro mineralisatie. (A) Representatieve foto's van een van appel afgeleide cellulosesteiger na verwijdering van de oorspronkelijke cellen en oppervlakteactieve stof (links) en een steiger bezaaid met MC3T3-E1-cellen na 4 weken kweek in osteogeen differentiatiemedium (rechts). Schaalbalk vertegenwoordigt 2 mm. (B) Representatieve confocale laserscanmicroscoopbeelden die gezaaide cellen tonen in van appel afgeleide cellulosesteigers na 4 weken kweek in niet-differentiatiemedium ("ND") of osteogeen differentiatiemedium ("D"). De schaalbalk staat voor 50 μm. Kleuring werd uitgevoerd op de steigers voor cellulose (rood) met propidiumjodide en voor celkernen (blauw) met DAPI. (C) Verdeling van de poriegrootte van gedecellulariseerde van appel afgeleide cellulosesteigers, voordat ze worden gezaaid met MC3T3-E1-cellen, van maximale projecties in de z-as van confocale beelden. De analyse werd uitgevoerd op in totaal 54 poriën in 3 verschillende steigers (6 poriën in 3 willekeurig geselecteerde interessegebieden per steiger). (D) Representatieve beelden van steigers gekleurd met 5-broom-4-chloor-3'-indolyfosfaat en nitroblauw tetrazolium (BCIP/NBT) om de activiteit van alkalische fosfatase (ALP) te beoordelen en met alizarinerood S (ARS) om calciumafzetting te visualiseren, wat wijst op mineralisatie (schaalbalk = 2 mm - geldt voor iedereen). De steigers die als "blanco" waren gelabeld (steigers zonder gezaaide cellen) vertoonden geen kleuring met BCIP/NBT, wat wijst op de afwezigheid van ALP-activiteit. Aan de andere kant vertoonden de met cellen gezaaide steigers gekweekt in differentiatiemedium ("D") een hogere ALP-activiteit, aangegeven door een intensere blauwe kleur, vergeleken met de celgezaaide steigers die werden gekweekt in niet-differentiatiemedium ("ND"). Voor ARS-kleuring vertoonden zowel de blanco steigers als de steigers gekweekt in niet-differentiatiemedium ("ND") een lichtere tint rood in vergelijking met de steigers gekweekt in differentiatiemedium ("D"). De aanwezigheid van calciumafzetting in de steigers gekweekt in differentiatiemedium ("D") werd geïllustreerd door een intens dieprode kleur. Elke analyse werd uitgevoerd op drie verschillende steigers (n = 3). Deze figuur is aangepast met toestemming van Leblanc Latour (2023)²⁷. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Histologie, scanning elektronenmicroscopie (SEM) en energiedispersieve spectroscopie (EDS) analyse van in vitro steigers. (A) Representatieve beelden van de bovenste histologische doorsneden van de steigers. In paraffine ingebedde steigers werden in secties van 5 μm dik gesneden die werden gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) om celinfiltratie te visualiseren, of met von Kossa (VK) om mineralisatie in de steigers te visualiseren. Scaffolds werden geïnfiltreerd met MC3T3-E1-cellen, zoals blijkt uit blauwe (kernen) en roze (cytoplasma) kleuring die zichtbaar is aan de periferie en door de steigers. Collageen (lichtroze) was ook zichtbaar (ingezoomde inzet van "H&E - D"). Mineralisatie werd alleen waargenomen aan de periferie van de poriewanden in de steigers die waren gekweekt in niet-differentiatiemedium ("ND"). De poriewanden in de steigers gekweekt in differentiatiemedium ("D") waren volledig zwart gekleurd. De analyse werd uitgevoerd op één steiger gekweekt in niet-differentiatiemedium ("ND") en op twee steigers gekweekt in differentiatiemedium ("D") (schaalbalk voor de foto's met een lagere vergroting = 1 mm, schaalbalk voor de foto's met een hogere vergroting = 50 μm). (B) Representatieve microfoto's verkregen door SEM en EDS-spectra. De steigers werden voorzien van een sputtercoating met goud en werden in beeld gebracht met behulp van een veldemissie scanning elektronenmicroscoop bij een spanning van 3,0 kV (schaalbalk = 100 μm - geldt voor iedereen). Op elke steiger werden EDS-spectra verkregen. Fosfor (2,013 keV) en calcium (3,69 keV) pieken worden aangeduid op elk EDS-spectrum. Zowel SEM als EDS werden uitgevoerd op drie verschillende steigers. Blanco: steigers zonder ingezaaide cellen. Deze figuur is aangepast met toestemming van Leblanc Latour (2023)²⁷. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Young's moduli van in vitro steigers na 4 weken kweek in niet-differentiatiemedium ("ND") of differentiatiemedium ("D"). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) van drie gerepliceerde monsters voor elke aandoening. Statistische significantie (* geeft p<0,05 aan) werd bepaald met behulp van een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) en de Tukey post-hoctest. Blanco: steigers zonder ingezaaide cellen. Deze figuur is aangepast met toestemming van Leblanc Latour (2023)²⁷. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Steigerfoto voorafgaand aan implantatie en push-out test na 8 weken implantatie: (A) Representatieve foto van een steiger voorafgaand aan implantatie; B) Uniaxiale compressie-inrichting die wordt gebruikt voor de push-out-tests, waarbij de loadcel is aangegeven met een asterisk (*) en het monster is aangegeven met een pijl. Deze figuur is aangepast met toestemming van Leblanc Latour (2023)²⁷. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Histologie-analyse van in vitro steigers. Representatieve beelden van histologische doorsneden van niet-gezaaide steigers na 8 weken implantatie. De secties werden gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) om cellen te visualiseren of Masson-Goldner's trichroom (MGT) om collageen te visualiseren. De pijl geeft rode bloedcellen aan. De aanwezigheid van collageen is zichtbaar (schaalbalk = 1 mm en 200 μm voor respectievelijk de linker- en rechterinzet). Deze figuur is aangepast met toestemming van Leblanc Latour (2023)²⁷. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Steekproefnummer	Piekkracht (N)
1	92.8
2	162.7
3	140.3
4	135.7
5	37.7
6	157.8
7	67.9
Bedoelen	113.6
SEM	18.2

Tabel 1: Gemeten piekkracht van push-out tests.

Aanvullende figuur 1: Typische spannings-rekcurve voor de modulusberekening van Young. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Verschillende in vitro en in vivo studies hebben de biocompatibiliteit van plantaardige cellulose en het mogelijke gebruik ervan in tissue engineering aangetoond 14,15,16,18,19,20, meer bepaald voor het hosten van osteogene differentiatie ^20,21. De doelstellingen van de huidige studie waren om het potentieel van van appels afgeleide cellulosesteigers voor AHO verder te onderzoeken en om de mechanische eigenschappen van deze steigers zowel in vitro als in vivo te beoordelen.

Voor in vitro studies werden preosteoblastcellen (MC3T3-E1) in de steigers gezaaid na het elimineren van de oorspronkelijke cellen uit het appelweefsel. MC3T3-E1-cellen worden vaak gebruikt om de biomineralisatie van extracellulaire matrix 28,29,30 te onderzoeken. Scaffolds werden vervolgens gedurende 4 weken gekweekt in osteogene differentiatie of niet-differentiatie medium. De bevindingen gaven aan dat de cellen zich vermenigvuldigden en differentiatie ondergingen in de steigers, vooral wanneer ze werden gekweekt in differentiatiemedium, waardoor het potentieel van cellulosesteigers afgeleid van appels om de ontwikkeling van botweefsel te ondersteunen, werd benadrukt. Celkernen werden in grote aantallen waargenomen in de poriën van de steiger, wat de waarnemingen bevestigt die in eerdere studies zijn gerapporteerd 14,15,16,17,20,21. Bovendien, vergelijkbaar met onze eerdere bevindingen¹⁴ en die van een andere groep²¹, was de gemiddelde diameter van de steigerporiën ~154 μm, waarbij de meeste poriën een diameter hadden tussen 100 μm en 200 μm (Figuur 1C). Deze afmetingen komen overeen met het ideale poriegroottebereik (100-200 μm) waarvan bekend is dat het de botgroei vergemakkelijkt⁷.

De kleuringsanalyse toonde een hogere ALP-activiteit na een kweekperiode van 4 weken in differentiatiemedium. Er werden meer calciumafzettingen waargenomen op het oppervlak van de in cellen gezaaide steigers die in differentiatiemedium waren gekweekt in vergelijking met zowel de blanco steigers als de celgezaaide steigers die in niet-differentiatiemedium waren gekweekt. Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen met gedifferentieerde hiPSC's in van appels afgeleide steigers²¹. Hoewel de aanwezigheid van ALP in de huidige studie kwalitatief werd beoordeeld, konden aanvullende tests worden uitgevoerd voor een kwantitatieve analyse. De histologische evaluatie van de steigers bevestigde verder dat de geïnfiltreerde osteoblasten de steigers na differentiatie mineraliseerden. Met name de periferie van de constructies gekweekt in niet-differentiatiemedium werd ook gekleurd met VK. Residueel CaCl₂ in de steigers kan deze niet-specifieke kleuring hebben veroorzaakt die na decellularisatie in de periferie is waargenomen. Een kwalitatieve analyse van SEM-foto's werd uitgevoerd om de mineralisatie verder te beoordelen. Na kweek in differentiatiemedium vertoonden in cellen gezaaide steigers tekenen van ECM-mineralisatie. Minerale aggregaten waren zichtbaar op het oppervlak van de steiger, met name aan de randen van de poriën. Deze waarnemingen komen overeen met eerdere studies met ECM³⁰ en plantaardige steigers²¹. Deze aggregaten waren afwezig op het oppervlak van de steigers zonder gezaaide cellen. EDS-analyse van de aggregaten onthulde de aanwezigheid van hoge niveaus van P en Ca, wat de aanwezigheid van apatiet suggereert. Van belang is dat hoewel het protocol dat in de huidige studie wordt beschreven, cellulaire infiltratie en de aanwezigheid van mineralisatie kan worden gevisualiseerd, het niet de beoordeling van hun progressie in de loop van de tijd mogelijk maakt. Histologische analyse op meerdere tijdstippen zou nodig zijn om deze progressie volledig te evalueren. Bovendien zou verdere analyse nodig zijn om cellulaire infiltratie en mineralisatie aan het oppervlak en in de hele steiger te kwantificeren. Ten slotte, terwijl de elementaire samenstelling van de minerale afzettingen werd bepaald door EDS, kunnen andere karakteriseringstechnieken, zoals röntgendiffractie (XRD), nodig zijn om informatie te verschaffen over de kristalstructuur van de waargenomen afzettingen.

De Young's modulus van de steigers was significant hoger na cultuur in differentiatiemedium (ongeveer 8-voudig). Daarentegen leek de modulus van de steigers die in niet-differentiatiemedium werden gekweekt op die van de blanco steigers (steigers zonder gezaaide cellen), vergelijkbaar met bevindingen gerapporteerd in een eerdere studie met van appel afgeleide steigers²⁰. Ondanks de hogere Young's modulus van de steigers gekweekt in differentiatiemedium, bleef deze veel lager dan die van natuurlijk bot (0,1 tot 2 GPa voor trabeculair bot en 15 tot 20 GPa voor corticaal bot)⁸, poreus allotransplantaat (3,78 GPa)³¹, alloplastische transplantaten gemaakt van poly-ether-ether-keton (3,84 GPa)³¹, titanium (50,20 GPa)³¹ en kobalt-chroomlegering (53,15 GPa)³¹ Implantaten. Daarom zijn de steigers in hun huidige samenstelling mogelijk niet geschikt voor dragende toepassingen. Opmerkelijk is dat de modulus van Young informatie geeft over de stijfheid van een materiaal. De vloeigrens kan echter ook worden overwogen om een breder begrip te krijgen van de mechanische eigenschappen van de steiger.

Gedecellulariseerde appelsteigers werden vervolgens geïmplanteerd in bilaterale calvariale defecten van 5 mm van kritische grootte bij ratten (n = 6 dieren). Push-out tests (op 7 explantaten), uitgevoerd om de integratie van de steigers in de gastheercalvaria te evalueren, gaven aan dat de gemiddelde piekkracht 113,6 N ± 18,2 N was, wat vergelijkbaar is met de eerder gerapporteerde fractuurbelasting voor calvariaal bot (127,1 ± 9,6 N)²², wat suggereert dat de steigers goed integreerden in het omringende botweefsel. Er moet echter worden opgemerkt dat de push-out-test alleen informatie geeft over het grensvlak tussen de steiger en het omringende weefsel. Eerdere studies hebben push-outtests gecombineerd met inkepingstests om een breder begrip te krijgen van de mechanische eigenschappen van de bot-implantaatinterface en de steiger zelf²². Bovendien zijn bilaterale defecten vatbaarder voor verkeerde uitlijning met de plunjer³². Juiste plaatsing van de craniale explantatie, het model met één defect of het extra klemsysteem op het universele testapparaat kan mogelijk een verkeerde uitlijning voorkomen³².

Samenvattend bevestigde deze studie dat van appel afgeleide cellulosesteigers de hechting en proliferatie van preosteoblasten kunnen bevorderen. Bovendien vond mineralisatie plaats in de met cellen gezaaide steigers die in differentiatiemedium waren gekweekt, wat leidde tot een toename van de steigermodulus van Young. De modulus bleef echter beduidend lager dan die van natuurlijk bot. Interessant is dat de kracht die nodig was om de geïmplanteerde van appel afgeleide cellulosesteigers te verplaatsen, vergelijkbaar was met de fractuurbelasting van calvariaal bot en andere soorten steigers die eerder werden gebruikt voor BTE²². Ten slotte infiltreerden cellen, net als in eerdere rapporten, de geïmplanteerde steigers en deponeerden ze collageen. Over het algemeen toont deze studie het potentieel aan van cellulosesteigers afkomstig van planten voor AHO-toepassingen. Deze bevindingen zijn in overeenstemming met een eerdere studie uitgevoerd door een andere onderzoeksgroep, die de geschiktheid van plantaardige cellulosesteigers voor AHO-doeleinden verder onderbouwt²¹. Desalniettemin benadrukt het verschil in de stijfheid van de steigers in vergelijking met trabeculair of corticaal bot het belang van het ontwikkelen van composietbiomaterialen die beter kunnen aansluiten bij de mechanische eigenschappen van natuurlijk bot. Daarom, ondanks de toenemende belangstelling voor het gebruik van plantaardige steigers voor AHO-doeleinden, kan het gebruik ervan beperkt blijven tot niet-dragende toepassingen. Zoals we eerder hebben aangetoond¹⁶, kan het opnieuw ontwerpen van plantaardige cellulosesteigers via chemische modificatie of het ontwikkelen van composieten met andere biologische/synthetische polymeren essentieel zijn voor dragende toepassingen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′,6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher	D1306	DAPI
Alizarin red S	Sigma-Aldrich	A5533	ARS
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403	Cell Culture
Calcium Chloride	ThermoFisher	AA12316	CaCl2
Calcofluor White	Sigma-Aldrich	18909
Dental drill			Surgical tool
Ethanol	ThermoFisher	615095000
Fetal bovine serum	Hyclone Laboratories	SH30396	FBS
Formalin	Sigma-Aldrich	HT501128	10% Formalin
Goldner's trichrome stain	Sigma-Aldrich	1.00485	GTC
Hematoxylin and eosin stain	Fisher Scientific	NC1470670	H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscope	Nikon	Nikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148
ImageJ software	National Institutes of Health
Irrigation saline	Baxter	JF7123	0.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cells	ATCC	CRL-2593	Pre-osteoblast cells
McIntosh apples			Canada Fancy grade
Methyl methacrylate	Sigma-Aldrich	M55909	Histological embedding
Minimum Essential Medium	ThermoFisher	M0894	α-MEM
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	O4042	4%; PFA
Penicillin/Streptomycin	Hyclone Laboratories	SV30010	Cell Culture
Periodic acid	Sigma-Aldrich	375810
Phosphate buffered saline	Hyclone Laboratories	2810305	PBS; without Ca2+ and Mg2+
Propidium iodide	Invitrogen	p3566
Scanning electron microscope	JEOL	JSM-7500F FESEM	SEM and EDS
Slide scanner microscope	Zeiss	AXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfate	Fisher Scientific	BP166	SDS
Sodium metabisulphite	Sigma-Aldrich	31448
Sodium phosphate	ThermoFisher	BP329
Sprague-Dawley rats	Charles-River Laboratories	400	Male
Sutures	Ethicon	J494G	4-0
Trephine	ACE Surgical Supply Co	583-0182	5-mm diameter
Triton-X 100	ThermoFisher	807423
Trypsin	Hyclone Laboratories	SH30236.02	Cell Culture
Tween	Fisher Scientific	BP337
Universal compression Device	CellScale	UniVert
Von Kossa stain	Sigma-Aldrich	1.00362	Histology