Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gedecellulariseerde van appel afgeleide steigers voor botweefselengineering in vitro en in vivo

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65226

⸱

23 februari 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Ottawa, 2Department of Biology, University of Ottawa, 3Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa, 4Department of Surgery, University of Ottawa, 5Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa, 6Institute for Science, Society and Policy, University of Ottawa, 7SymbioticA, School of Human Sciences, University of Western Australia

In dit artikel

Samenvatting

In deze studie beschrijven we methoden voor decellularisatie, fysieke karakterisering, beeldvorming en in vivo implantatie van plantaardige biomaterialen, evenals methoden voor celzaaiing en differentiatie in de steigers. De beschreven methoden maken het mogelijk om plantaardige biomaterialen te evalueren voor toepassingen op het gebied van botweefseltechnologie.

Samenvatting

Biomaterialen van plantaardige cellulose zijn gebruikt in verschillende toepassingen voor weefselmanipulatie. In vivo studies hebben de opmerkelijke biocompatibiliteit aangetoond van steigers gemaakt van cellulose afkomstig van natuurlijke bronnen. Bovendien bezitten deze steigers structurele kenmerken die relevant zijn voor meerdere weefsels, en bevorderen ze de invasie en proliferatie van zoogdiercellen. Recent onderzoek met behulp van gedecellulariseerd appelhypanthiumweefsel heeft de gelijkenis van de poriegrootte met die van trabeculair bot aangetoond, evenals het vermogen om osteogene differentiatie effectief te ondersteunen. De huidige studie onderzocht verder het potentieel van van appel afgeleide cellulosesteigers voor botweefselmanipulatie (AHO) toepassingen en evalueerde hun in vitro en in vivo mechanische eigenschappen. MC3T3-E1 preosteoblasten werden gezaaid in van appels afgeleide cellulosesteigers die vervolgens werden beoordeeld op hun osteogene potentieel en mechanische eigenschappen. Alkalische fosfatase en alizarinerode S-kleuring bevestigden osteogene differentiatie in steigers gekweekt in differentiatiemedium. Histologisch onderzoek toonde wijdverspreide celinvasie en mineralisatie over de steigers aan. Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) onthulde minerale aggregaten op het oppervlak van de steigers en energiedispersieve spectroscopie (EDS) bevestigde de aanwezigheid van fosfaat- en calciumelementen. Ondanks een significante toename van de Young-modulus na celdifferentiatie, bleef deze echter lager dan die van gezond botweefsel. In vivo studies toonden celinfiltratie en afzetting van extracellulaire matrix in de gedecellulariseerde van appel afgeleide steigers na 8 weken implantatie in calvaria van ratten. Bovendien was de kracht die nodig was om de steigers van het botdefect te verwijderen vergelijkbaar met de eerder gerapporteerde fractuurbelasting van inheems calvariaal bot. Over het algemeen bevestigt deze studie dat van appel afgeleide cellulose een veelbelovende kandidaat is voor AHO-toepassingen. Het verschil tussen de mechanische eigenschappen en die van gezond botweefsel kan de toepassing ervan echter beperken tot scenario's met een lage belasting. Aanvullende structurele re-engineering en optimalisatie kunnen nodig zijn om de mechanische eigenschappen van van appel afgeleide cellulosesteigers voor dragende toepassingen te verbeteren.

Inleiding

Grote botdefecten veroorzaakt door een verwonding of ziekte vereisen vaak biomateriaaltransplantaten voor volledige regeneratie1. De huidige technieken die zijn ontworpen om de regeneratie van botweefsel te verbeteren, maken regelmatig gebruik van autologe, allogene, xenogene of synthetische transplantaten2. Voor autologe bottransplantatie, beschouwd als de "gouden standaard" -transplantatiepraktijk om grote botdefecten te herstellen, wordt bot uit de patiënt gehaald. Deze entprocedure heeft echter verschillende nadelen, waaronder beperkingen van grootte en vorm, beschikbaarheid van weefsel enmorbiditeit op de bemonsteringsplaats3. Bovendien zijn autologe transplantatieprocedures vatbaar voor postoperatieve wondinfecties, daaropvolgende fracturen, hematoomvorming op de bemonsterings- of gereconstrueerde plaats en postoperatieve pijn4. Bone tissue engineering (AHO) biedt een potentieel alternatief voor conventionele bottransplantatiemethoden5. Het combineert structurele biomaterialen en cellen om nieuw functioneel botweefsel op te bouwen. Bij het ontwerpen van biomaterialen voor BTE is het van cruciaal belang om een macroporeuze structuur, oppervlaktechemie die celhechting bevordert en mechanische eigenschappen te combineren die sterk lijken op die van natuurlijk bot6. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de ideale poriegrootte en elasticiteitsmodulus voor biomaterialen die in AHO worden gebruikt, respectievelijk ongeveer 100-200 μm7 en 0,1-20 GPa zijn, afhankelijk van de entplaats8. Bovendien zijn de porositeit en poriëninterconnectiviteit van de steigers kritische factoren die van invloed zijn op celmigratie, diffusie van voedingsstoffen en angiogenese8.

BTE heeft veelbelovende resultaten laten zien met verschillende biomaterialen die zijn ontwikkeld en geëvalueerd als alternatieve opties voor bottransplantaten. Sommige van deze biomaterialen zijn osteoinductieve materialen, hybride materialen en geavanceerde hydrogels8. Osteoinductieve materialen stimuleren de ontwikkeling van nieuw gevormde botstructuren. Hybride materialen zijn samengesteld uit synthetische en/of natuurlijke polymeren8. Geavanceerde hydrogels bootsen de extracellulaire matrix (ECM) na en zijn in staat om de nodige bioactieve factoren af te geven om de integratie van botweefsel te bevorderen8. Hydroxyapatiet is een traditioneel materiaal en een veel voorkomende keuze voor AHO vanwege de samenstelling en biocompatibiliteit9. Bioactief glas is een ander type biomateriaal voor AHO, waarvan is aangetoond dat het specifieke celreacties stimuleert om genen te activeren die nodig zijn voor osteogenese10,11. Biologisch afbreekbare polymeren, waaronder poly(glycolzuur) en poly(melkzuur), zijn ook op grote schaal gebruikt in AHO-toepassingen12. Ten slotte hebben natuurlijke of natuurlijk afgeleide polymeren zoals chitosan, chitine en bacteriële cellulose ook bemoedigende resultaten voor BTE13 aangetoond. Hoewel zowel synthetische als natuurlijke polymeren potentieel hebben voor AHO, vereist de ontwikkeling van een functionele steiger met de gewenste macrostructuur doorgaans uitgebreide protocollen.

Omgekeerd kunnen inheemse macroscopische cellulosestructuren gemakkelijk worden afgeleid uit diverse planten en onze onderzoeksgroep heeft eerder de toepasbaarheid aangetoond van op cellulose gebaseerde steigers afgeleid van planten op verschillende weefselreconstructies. Na een eenvoudige behandeling met oppervlakteactieve stoffen hebben we de inherente structuur van het plantmateriaal benut en het potentieel ervan als veelzijdig biomateriaal benadrukt14. Bovendien kunnen deze op cellulose gebaseerde steigers worden gebruikt voor in vitro celkweektoepassingen van zoogdieren14, zijn ze biocompatibel en ondersteunen ze spontane subcutane vascularisatie 14,15,16,17. Zowel onze onderzoeksgroep als anderen hebben aangetoond dat deze steigers kunnen worden verkregen uit specifieke planten op basis van de beoogde toepassing 14,15,16,17,18,19,20. De vasculaire structuur die wordt waargenomen in plantenstengels en -bladeren vertoont bijvoorbeeld een opvallende gelijkenis met de structuur die wordt aangetroffen in dierlijke weefsels19. Bovendien kunnen cellulosesteigers afkomstig van planten gemakkelijk worden gevormd en onderworpen aan biochemische modificaties aan het oppervlak om de gewenste eigenschappen te bereiken16. In een recente studie hebben we een zoutbuffer opgenomen tijdens het decellularisatieproces, wat leidt tot een verbeterde celhechting die zowel in vitro als in vivo wordt waargenomen16. In dezelfde studie toonden we de toepasbaarheid van plantaardige cellulosesteigers in composiet biomaterialen aan door hydrogels op het oppervlak van de steigers te gieten. In recente studies is aangetoond dat de functionalisering van plantaardige steigers hun effectiviteitverbetert18. Een studie uitgevoerd door Fontana et al. (2017) onthulde bijvoorbeeld dat de hechting van menselijke dermale fibroblasten werd ondersteund door RGD-gecoate gedecellulariseerde stengels, terwijl niet-gecoate stengels niet hetzelfde vermogen vertoonden18. Bovendien toonden de auteurs ook aan dat gemodificeerde gesimuleerde lichaamsvloeistof kan worden gebruikt om gedecellulariseerde plantenstengels kunstmatig te mineraliseren. In recentere studies onderzochten we het concept van mechanosensitieve osteogenese in plantaardige cellulosesteigers en beoordeelden we hun potentieel voor BTE17,20. Bovendien gebruikten Lee et al. (2019) plantaardige steigers om botachtige weefsels te cultiveren in een in vitro-setting 21. Door middel van uitgebreide evaluaties van verschillende plantaardige bronnen, identificeerden de auteurs van appels afgeleide steigers als de meest optimale voor de kweek en differentiatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). Bovendien stelden de auteurs voor dat de structurele en mechanische kenmerken van de van appels afgeleide steigers een cruciale rol spelen bij hun geschiktheid voor het beoogde doel. Omdat het de eerste van planten afgeleide steigers zijn die worden geïmplementeerd in weefselmanipulatietoepassingen, is uitgebreid aangetoond dat van appel afgeleide steigers een opvallend vergelijkbare architectuur hebben als die van menselijk bot, met name in termen van hun onderling verbonden poriën variërend van 100 tot 200 μm in diameter14,21.

In de huidige studie onderzochten we verder het potentieel van van appels afgeleide cellulosesteigers voor AHO en voerden we een analyse uit van hun mechanische eigenschappen, zowel in vitro als in vivo. Hoewel er studies zijn gedaan naar het potentieel van van appels afgeleide steigers voor BTE 17,20,21, zijn hun mechanische eigenschappen onvoldoende onderzocht. De resultaten toonden wildverspreide invasie en osteogene differentiatie van MC3T3-E1 preosteoblasten gezaaid in steigers die gedurende 4 weken in differentiatiemedium werden gekweekt. De Young-modulus van deze steigers was 192,0 ± 16,6 kPa, wat aanzienlijk hoger was dan die van de blanco steigers (steigers zonder gezaaide cellen) (31,6 ± 4,8 kPa) en de met cellen bezaaide steigers gekweekt in niet-differentiatiemedium (24,1 ± 8,8 kPa). Er moet echter worden opgemerkt dat de Young-modulus van gezond menselijk botweefsel doorgaans binnen het bereik van 0.1-2 GPa valt voor trabeculair bot en ongeveer 15-20 GPa voor corticaal bot8. Desalniettemin, na een implantatie van 8 weken in een knaagdier calvariaal defect, leken de met cellen gezaaide steigers goed geïntegreerd te zijn in het omringende bot, zoals blijkt uit een gemiddelde piekkracht van 113,6 N ± 18,2 N in push-outtests, wat vergelijkbaar is met de eerder gerapporteerde fractuurbelasting van native calvariaal bot22. Over het algemeen zijn de resultaten van deze studie veelbelovend, met name voor niet-dragende toepassingen. Van appel afgeleide cellulosesteigers bezitten momenteel echter niet de nodige mechanische eigenschappen om precies overeen te komen met het omringende botweefsel op een implantaatplaats. Daarom is verdere ontwikkeling nodig om het volledige potentieel van deze steigers te ontsluiten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimentele protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Ottawa.

1. Voorbereiding van de steiger

  1. Snijd McIntosh-appels (Canada Fancy) met een mandolinesnijder in plakken van 8 mm dik. Snijd het hypanthiumweefsel van de appelschijfjes in vierkanten van 5 mm x 5 mm.
  2. Plaats de vierkante monsters gedurende 2 dagen in 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS).
  3. Was de gedecellulariseerde monsters met gedeïoniseerd water en incubeer ze een nacht bij kamertemperatuur (RT) in 100 mM CaCl2 om de resterende oppervlakteactieve stof te verwijderen.
  4. Steriliseer de monsters (d.w.z. steigers) gedurende 30 minuten in 70% ethanol, was ze met gedeïoniseerd water en plaats ze in een kweekplaat met 24 putjes voordat ze worden gezaaid.

2. Celkweek en steigerzaaien

  1. Onderhoud MC3T3-E1 Subclone 4-cellen in met celkweek behandelde schalen met een diameter van 10 cm in celkweekomstandigheden (37°C in een bevochtigde atmosfeer van 95% lucht en 5% CO2).
  2. Bereid celkweekmedium gemaakt van Eagle's minimale essentiële medium - alfamodificatie (α-MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.
  3. Maak de cellen los van de kweekschalen door trypsinisatie (0,05% trypsine-EDTA) zodra ze 80% confluentie hebben bereikt.
  4. Centrifugeer de celsuspensie bij c.a. 200 x g gedurende 3 min. Zuig het supernatans op en resuspendeer de cellen in α-MEM bij 2,5 x 107 cellen per ml.
  5. Pipetteer een aliquot van 40 μl van de celsuspensie op het oppervlak van de steigers en laat de cellen gedurende 1 uur hechten in celkweekomstandigheden. Voeg vervolgens 2 ml kweekmedium toe aan elk kweekputje van de kweekplaat.
  6. Vul het kweekmedium elke 2-3 dagen gedurende 14 dagen aan.
  7. Bereid een differentiatiemedium voor door 50 μg/ml ascorbinezuur en 4 mM natriumfosfaat toe te voegen aan het eerder beschreven celkweekmedium.
  8. Induceer differentiatie van MC3T3-E1-cellen door de scaffolds gedurende 4 weken in differentiatiemedium te incuberen. Vul het medium elke 3-4 dagen aan. Tegelijkertijd incuberen scaffolds in niet-differentiatiecultuurmedium (d.w.z. medium zonder de supplementen om differentiatie te induceren) voor dezelfde duur, met hetzelfde mediumveranderingsschema om als negatieve controle te dienen.

3. Metingen van de poriegrootte met behulp van confocale laserscanmicroscopie

  1. Was de gedecellulariseerde van appel afgeleide steigers met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Incubeer de steigers in 1 ml 10% (v/v) calcofluor witte beits gedurende 25 minuten in het donker bij RT.
  3. Was de steigers (n = 3) met PBS en breng drie willekeurig geselecteerde gebieden per steiger in beeld met een hogesnelheidsresonantie confocale laserscanmicroscoop (CLSM) met een vergroting van 10x, met behulp van een DAPI-kanaal, als volgt:
    1. Configuratie laser-emissiefilter: 405 nm (laser); 425-475 Nm (emissie)
    2. Pas het laservermogen en de detector handmatig aan om een optimale beeldacquisitie te garanderen. Verkrijg een z-stack van 20 afbeeldingen met een stapgrootte van 5 μm.
  4. Gebruik de ImageJ-software om de confocale beelden als volgt te verwerken en te analyseren:
    1. Gebruik de functie Z-Project tot maximale intensiteit om een afbeelding te maken en pas de functie Randen zoeken toe om de rand van de poriën te markeren.
    2. Traceer de poriën handmatig met behulp van het gereedschap Selectie uit de vrije hand .
    3. Pas elke porie als een ellips, meet de lengte van de hoofdas, verzamel alle metingen (in totaal 54 in de huidige studie - 6 in 3 willekeurig geselecteerde gebieden voor elke steiger) en bereken de gemiddelde lengte.

4. Analyse van de celdistributie met behulp van confocale laserscanmicroscopie

  1. Was de met cellen bezaaide steigers die in het niet-differentiatie- of differentiatiemedium zijn gekweekt, driemaal met PBS. Bevestig de steigers met 4% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.
  2. Was elke steiger grondig met gedeïoniseerd water, permeabiliseer de cellen gedurende 5 minuten met een Triton-X 100-oplossing en was opnieuw met PBS.
  3. Incubeer de steigers in 1 ml 1% periodiek zuur gedurende 40 minuten en spoel ze af met gedeïoniseerd water14,16.
  4. Incubeer de steigers in 1 ml van een oplossing die 100 mM natriummetabisulfiet en 0,15 M zoutzuur bevat, aangevuld met 100 μg/ml propidiumjodide. Dompel de steigers volledig onder in de oplossing.
  5. Was de steigers met PBS en kleur de celkernen door de steigers gedurende 10 minuten in het donker te incuberen in een 5 mg/ml DAPI-oplossing. Was opnieuw grondig en bewaar de steigers in PBS voordat u de beeldvorming uitvoert.
  6. Beeld drie willekeurig geselecteerde oppervlakken van drie verschillende celgezaaide steigers met een snelle resonantie CLSM bij een vergroting van 10x, met behulp van DAPI- en TRITC-kanalen, als volgt:
    1. Configuratie laser-emissiefilter:
      DAPI: Laser: 405 nm; Emissie: 425-475 nm
      TRITC: Laser: 561 nm; Emissie: 570-620 nm
    2. Pas het laservermogen en de detector handmatig aan om een optimale beeldacquisitie te garanderen. Verkrijg een z-stack van 20 afbeeldingen met een stapgrootte van 5 μm.
  7. Gebruik ImageJ-software om de confocale beelden te verwerken en een maximale projectie in de z-as te creëren voor beeldanalyse met behulp van de functie Z-Project tot maximale intensiteit .

5. Alkalische fosfatase-analyse

  1. Was de met cellen bezaaide steigers die in het niet-differentiatie- of differentiatiemedium zijn gekweekt, driemaal met PBS. Bevestig de steigers met 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 30 minuten. Repareer lege steigers (steigers zonder zaadcellen) om als negatieve controle te dienen.
  2. Bereid een kleuringsoplossing van 5-broom-4-chloor-3'-indolyfosfaat en nitroblauwtetrazolium (BCIP/NBT) door één BCIP/NBT-tablet op te lossen in 10 ml gedeïoniseerd water.
  3. Was de vaste steigers met een 0.05% Tween-oplossing en kleur ze gedurende 20 minuten met de BCIP/NBT-oplossing bij RT. Was de bevlekte steigers met een 0.05% Tween-oplossing en bewaar ze in PBS voorafgaand aan de beeldvorming.
  4. Stel je de bevlekte steigers voor met een 12-megapixel digitale camera.

6. Analyse van calciumdepositie

  1. Was de met cellen bezaaide steigers die in het niet-differentiatie- of differentiatiemedium zijn gekweekt, driemaal met PBS. Bevestig de steigers met 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 30 minuten. Repareer lege steigers (steigers zonder zaadcellen) om als negatieve controle te dienen.
  2. Bereid een 2% (w/v) alizarinerode S (ARS) kleuringsoplossing.
  3. Was de vaste steigers met gedeïoniseerd water en kleur ze met de ARS-oplossing gedurende 1 uur bij RT. Was de bevlekte steigers met gedeïoniseerd water en bewaar ze in PBS voordat ze worden geïoniseerd.
  4. Stel je de bevlekte steigers voor met een 12-megapixel digitale camera.

7. Mineralisatie analyse

  1. Was de met cellen bezaaide steigers die in het niet-differentiatie- of differentiatiemedium zijn gekweekt, driemaal met PBS. Bevestig de steigers met 4% paraformaldehyde gedurende 48 uur. Repareer lege steigers (steigers zonder zaadcellen) om als negatieve controle te dienen.
  2. Dehydrateer de monsters in oplossingen met ethanolconcentraties die oplopen van 50% tot 100%, zoals eerder beschreven23.
  3. Voer scanning-elektronenmicroscopie (SEM) en energiedispersieve spectroscopie (EDS) uit om minerale aggregaten als volgt te analyseren:
    1. Droog de monsters met behulp van een kritische puntdroger, volgens het protocol van de fabrikant24.
    2. Breng een 5-nm goudlaag aan op de steigers met behulp van een gouden sputtercoater, volgens het protocol van de fabrikant25.
    3. Breng het oppervlak van de steigers in beeld met een scanning-elektronenmicroscoop ingesteld op 3 kV, bij een vergroting van 85x.
    4. Voer EDS uit door de scanning-elektronenmicroscoop in te stellen op 15 kV. Verkrijg op drie willekeurig geselecteerde gebieden per steiger EDS-spectra voor analyse van de samenstelling van minerale aggregaten.

8. Young's modulusmetingen

  1. Verwijder de met cellen bezaaide steigers uit hun respectievelijke incubatiemedium en test de monsters onmiddellijk.
  2. Met behulp van een op maat gemaakt uniaxiaal compressieapparaat uitgerust met een 1,5 N load cell, drukt u de steigers (n = 3 per toestand) samen met een constante snelheid van 3 mm·min-1 tot een maximale drukrek van 10% van de steigerhoogte.
  3. Bepaal de Young's modulus uit de helling van het lineaire gedeelte van de spanning-rek curven. In de huidige studie werd de modulus bepaald tussen 9% en 10% rek.

9. Celinfiltratie en mineralisatieanalyse door histologie: In vitro steigers

  1. Was de met cellen bezaaide steigers die zijn gekweekt in niet-differentiatie- of differentiatiemedium driemaal met PBS.
  2. Fixeer de met cellen bezaaide steigers gedurende 48 uur met 4% paraformaldehyde voordat ze opnieuw worden gesuspt in 70% ethanol voor opslag.
  3. Histologie:
    OPMERKING: In de huidige studie werd de volledige histologische voorbereiding (inbedding, doorsnede en kleuring) beschreven in de volgende stappen uitgevoerd door de Louise Pelletier Histology Core Facility (University of Ottawa).
    1. Na uitdroging en inbedding in paraffine, snijdt u de monsters in seriële secties van 5 μm dik, beginnend 1 mm in de steigers, en monteert u de secties op microscoopglaasjes.
    2. Kleur de secties met hematoxyline en eosine (H&E) of von Kossa (VK) vlekken.
    3. Breng de secties in beeld met een diascannermicroscoop bij een vergroting van 40x (n = 1 steiger in niet-differentiatiemedium en n = 2 steigers in differentiatiemedium in de huidige studie).
    4. Evalueer met behulp van ImageJ-software de infiltratie van cellen (H&E-kleuring) en mineralisatie (VK-kleuring) visueel.

10. Model met calvariaal defect bij ratten

  1. Laat experimentele protocollen beoordelen en goedkeuren door de plaatselijke dierenverzorgingscommissie.
  2. Bereid ronde (5 mm diameter en 1 mm dikte) gedecellulariseerde steigers voor volgens sectie 1 hierboven beschreven en met behulp van een biopsiepons van 5 mm.
  3. Voer bilaterale craniotomie uit volgens een vastgesteld protocol26, als volgt:
    1. Verdoof mannelijke Sprague-Dawley-ratten met isofluraan, eerst met 3% totdat ze bewusteloos zijn, en vervolgens met 2-3% tijdens de procedure.
    2. Leg het periosteum en de schedel bloot door met een scalpelmesje in de bovenliggende huid te snijden. Verwijder het periosteum.
    3. Creëer bilaterale defecten in beide pariëtale botten aan weerszijden van de sagittale hechting met behulp van een tandartsboor uitgerust met een trephine met een diameter van 5 mm onder constante irrigatie van 0,9% NaCl.
    4. Reinig het omringende bot met 0,9% NaCl om eventuele botfragmenten te verwijderen.
    5. Plaats de cirkelvormige, gedecellulariseerde steigers in de defecten.
    6. Sluit de bovenliggende huid met 4-0 hechtingen.
  4. Geef de ratten onbeperkt toegang tot voedsel en water en houd ze dagelijks in de gaten.
  5. Na 8 weken na implantatie de ratten euthanaseren door CO2 -inhalatie en thoracale perforatie als secundaire euthanasiemaatregel.
  6. Om de schedel bloot te leggen en de implantaten op te halen, verwijdert u de huid die de schedel bedekt met een scalpelmesje.
  7. Snijd de schedel bij de frontale en occipitale botten en aan de zijkant van beide pariëtale botten met behulp van een tandartsboor om het bovenste deel van de schedel volledig te verwijderen.

11. Push-out test

  1. Sluit een uniaxiaal compressieapparaat (met een 445 N load cell) aan op de USB-data-acquisitiemodule.
  2. Sluit de data-acquisitiemodule aan op een computer die is uitgerust met een softwaretoepassing voor data-acquisitie.
  3. Plaats onmiddellijk na craniale extractie elk monster (n = 7 implantaten van 4 dieren in het huidige onderzoek) op de monsterhouder van het uniaxiale compressieapparaat, zodat de dorsale zijde van het bot naar boven wijst.
  4. Laat de zuiger met 0.5 mm/min zakken totdat u het geëxtraheerde implantaat lichtjes raakt.
  5. Start de test door de zuiger door het implantaat te laten zakken totdat deze volledig is weggedrukt terwijl u compressie toepast met een constante snelheid van 0,5 mm/min met behulp van de data-acquisitiesoftware.
  6. Registreer de piekkracht op de kracht-verplaatsingscurve met behulp van de data-acquisitiesoftware.

12. Celinfiltratie en mineralisatieanalyse door histologie: In vivo steigers

  1. Fixeer de geëxtraheerde calvaria en implantaten gedurende 72 uur in 10% neutraal gebufferde formaline voordat ze opnieuw worden gesuspt in 70% ethanol voor opslag.
  2. Histologie:
    OPMERKING: In de huidige studie werd alle histologische voorbereiding (inbedding, doorsnede en kleuring) beschreven in de volgende stappen uitgevoerd door Accel Labs (Montreal, QC, Canada).
    1. Snijd de monsters (ingebed in methylmethacrylaat) in secties van 6 μm dik op drie verschillende niveaus (boven, onder en naar het midden) en monteer ze op microscoopglaasjes.
    2. Beits de secties met H&E of Masson-Goldner's trichrome (MGT).
  3. Breng de secties in beeld met een diascannermicroscoop met een vergroting van 40x (4 explantaten van 2 dieren in de huidige studie).
  4. Evalueer met behulp van ImageJ-software visueel celinfiltratie (H&E-kleuring) en collageenafzetting (MGT-kleuring).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Meting van de poriegrootte, celverdeling en in vitro mineralisatie (Figuur 1 en Figuur 2)
Volledige verwijdering van native cellulaire componenten van de appelweefselsteigers werd bereikt na behandeling van de steigers met SDS en CaCl2 (Figuur 1A). De steigers vertoonden een zeer poreuze structuur, die werd bevestigd met behulp van confocale microscopie. De kwantificering van de beelden toonde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende in vitro en in vivo studies hebben de biocompatibiliteit van plantaardige cellulose en het mogelijke gebruik ervan in tissue engineering aangetoond 14,15,16,18,19,20, meer bepaald voor het hosten van osteogene differentiatie 20,21. De ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Verklaring inzake belangenverstrengeling: M.L.L., M.T., R.J.H., C.M.C., I.C. en A.P. zijn uitvinders van octrooiaanvragen ingediend door de Universiteit van Ottawa en Spiderwort Inc. met betrekking tot het gebruik van plantaardige cellulose voor AHO-toepassingen. M.L.L., R.J.H., C.M.C. en A.P. hebben financiële belangen in Spiderwort Inc.

Dankbetuigingen

Financiering voor dit project werd verstrekt door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (Discovery Grant) en door de Li Ka Shing Foundation. MLL kreeg steun van het Ontario Centers of Excellence TalentEdge-programma en RJH werd ondersteund door een NSERC-postdoctorale beurs en een Ontario Graduate Scholarship (OGS).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4′,6-diamidino-2-phenylindoleThermoFisherD1306DAPI
Alizarin red SSigma-AldrichA5533ARS
Ascorbic acidSigma-AldrichA4403Celcultuur
Calcium ChlorideThermoFisherAA12316CaCl2
Calcofluor WhiteSigma-Aldrich18909
Dental drillChirurgisch instrument
EthanolThermoFisher615095000
Fetal bovine serumHyclone LaboratoriesSH30396FBS
FormalinSigma-AldrichHT50112810% Formalin
Goldner's trichrome stainSigma-Aldrich1.00485GTC
Hematoxylin and eosin stainFisher ScientificNC1470670H&E
High-speed resonant confocal laser scanning microscopeNikonNikon Ti-E A1-R
Hydrochloric acidSigma-Aldrich258148
ImageJ softwareNational Institutes of Health
Irrigation salineBaxterJF71230.9% NaCl
MC3T3-E1 Subclone 4 cellsATCCCRL-2593Pre-osteoblast cellen
McIntosh applesCanada Fancy grade
Methyl methacrylateSigma-AldrichM55909Histologisch inbedden
Minimum Essential MediumThermoFisherM0894α-MEM
ParaformaldehydeFisher ScientificO40424%; PFA
Penicillin/StreptomycinHyclone LaboratoriesSV30010Celcultuur
Periodic acidSigma-Aldrich375810
Phosphate buffered salineHyclone Laboratories2810305PBS; zonder Ca2+ en Mg2+
Propidium iodideInvitrogenp3566
Scanning electron microscopeJEOLJSM-7500F FESEMSEM en EDS
Slide scanner microscopeZeissAXIOVERT 40 CFL
Sodium dodecyl sulfateFisher ScientificBP166SDS
Sodium metabisulphiteSigma-Aldrich31448
Sodium phosphateThermoFisherBP329
Sprague-Dawley ratsCharles-River Laboratories400Mannetjes
SuturesEthiconJ494G4-0
TrephineACE Surgical Supply Co583-01825 mm diameter
Triton-X 100ThermoFisher807423
TrypsinHyclone LaboratoriesSH30236.02Celcultuur
TweenFisher ScientificBP337
Universal compression DeviceCellScaleUniVert
Von Kossa stainSigma-Aldrich1.00362Histologie

Referenties

  1. Schmitz, J. P., Hollinger, J. O. The critical size defect as an experimental model for craniomandibulofacial nonunions. Clinical Orthopaedics and Related Research. 205, 299-308 (1986).
  2. Yu, X., Tang, X., Gohil, S. V., Laurencin, C. T. Biomaterials for bone regenerative engineering. Advanced Healthcare Materials. 4 (9), 1268-1285 (2015).
  3. Parikh, S. N. Bone graft substitutes: Past, present, future. Journal of Postgraduate Medicine. 48 (2), 142-148 (2002).
  4. Silber, J. S., et al. Donor site morbidity after anterior iliac crest bone harvest for single-level anterior cervical discectomy and fusion. Spine (Phila Pa 1976). 28 (2), 134-139 (2003).
  5. Amini, A. R., Laurencin, C. T., Nukavarapu, S. P. Bone tissue engineering: recent advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 40 (5), 363-408 (2012).
  6. Butler, D. L., Goldstein, S. A., Guilak, F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics. Journal of Biomechanical Engineering. 122 (6), 570-575 (2000).
  7. Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
  8. Bose, S., Roy, M., Bandyopadhyay, A. Recent advances in bone tissue engineering scaffolds. Trends in Biotechnology. 30 (10), 546-554 (2012).
  9. Yoshikawa, H., Myoui, A. Bone tissue engineering with porous hydroxyapatite ceramics. Journal of Artificial Organs. 8 (3), 131-136 (2005).
  10. Fu, Q., Saiz, E., Rahaman, M. N., Tomsia, A. P. Bioactive glass scaffolds for bone tissue engineering: state of the art and future perspectives. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 31 (7), 1245-1256 (2011).
  11. Xynos, I. D., Edgar, A. J., Buttery, L. D. K., Hench, L. L., Polak, J. M. Ionic products of bioactive glass dissolution increase proliferation of human osteoblasts and induce insulin-like growth factor II mRNA expression and protein synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276 (2), 461-465 (2000).
  12. Kroeze, R., Helder, M., Govaert, L., Smit, T. Biodegradable polymers in bone tissue engineering. Materials. 2 (3), 833-856 (2009).
  13. Venkatesan, J., Vinodhini, P. A., Sudha, P. N. Chitin and chitosan composites for bone tissue regeneration. Advances in Food and Nutrition Research. 73, 59-81 (2014).
  14. Modulevsky, D. J., Lefebvre, C., Haase, K., Al-Rekabi, Z., Pelling, A. E. Apple derived cellulose scaffolds for 3D mammalian cell culture. PLoS One. 9 (5), e97835(2014).
  15. Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Biocompatibility of subcutaneously implanted plant-derived cellulose biomaterials. PLoS One. 11 (6), e0157894(2016).
  16. Hickey, R. J., Modulevsky, D. J., Cuerrier, C. M., Pelling, A. E. Customizing the shape and microenvironment biochemistry of biocompatible macroscopic plant-derived cellulose scaffolds. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (11), 3726-3736 (2018).
  17. Hickey, R. J., Leblanc Latour, M., Harden, J. L., Pelling, A. E. Designer scaffolds for interfacial bioengineering. Advanced Engineering Materials. 25, 2201415(2023).
  18. Fontana, G., et al. Biofunctionalized plants as diverse biomaterials for human cell culture. Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601225(2017).
  19. Gershlak, J. R., et al. Crossing kingdoms: Using decellularized plants as perfusable tissue engineering scaffolds. Biomaterials. 125, 13-22 (2017).
  20. Leblanc Latour, M., Pelling, A. E. Mechanosensitive osteogenesis on native cellulose scaffolds for bone tissue engineering. Journal of Biomechanics. 135, 111030(2022).
  21. Lee, J., Jung, H., Park, N., Park, S. H., Ju, J. H. Induced osteogenesis in plants decellularized scaffolds. Scientific Reports. 9 (1), 20194(2019).
  22. Zhao, J., et al. Enhanced healing of rat calvarial defects with sulfated chitosan-coated calcium-deficient hydroxyapatite/bone morphogenetic protein 2 scaffolds. Tissue Engineering. Part A. 18 (1-2), 185-197 (2012).
  23. Murtey, M. D., Ramasamy, P. Sample Preparations for Scanning Electron Microscopy - Life Sciences. In: Modern Electron Microscopy in Physical and Life Sciences. , 161-186 (2016).
  24. tousimis Critical Point Dryers - Samdri®-PVT-3D. , https://tousimis.com/critical_point_dryers/detail.html?Pid=8755B (2022).
  25. Leica EM ACE200 Vacuum Coater. , https://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-ace200/ (2023).
  26. Spicer, P. P. Evaluation of bone regeneration using the rat critical size calvarial defect. Nature Protocols. 7 (10), 1918-1929 (2012).
  27. Leblanc Latour, M. Cellulose biomaterials for bone tissue engineering [dissertation]. , Department of Physics, Faculty of Science, University of Ottawa, Ottawa, Canada. (2023).
  28. Kodama, H. -A., Amagai, Y., Sudo, H., Kasai, S., Yamamoto, S. Establishment of a clonal osteogenic cell line from newborn mouse calvaria. Japanese Journal of Oral Biology. 23 (4), 899-901 (1981).
  29. Wang, D., et al. Isolation and characterization of MC3T3-E1 preosteoblast subclones with distinct in vitro and in vivo differentiation/mineralization potential. Journal of Bone and Mineral Research. 14 (6), 893-903 (1999).
  30. Addison, W. N., et al. Extracellular matrix mineralization in murine MC3T3-E1 osteoblast cultures: An ultrastructural, compositional and comparative analysis with mouse bone. Bone. 71, 244-256 (2015).
  31. Heary, R. F., Parvathreddy, N., Sampath, S., Agarwal, N. Elastic modulus in the selection of interbody implants. Journal of Spine Surgery. 3 (2), 163-167 (2017).
  32. Lawson, Z. T., et al. Methodology for performing biomechanical push-out tests for evaluating the osseointegration of calvarial defect repair in small animal models. MethodsX. 8, 101541(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Cellulose-biomaterialenosteogene differentiatiemechanische eigenschappencelinvasiemineralisatie-assayconfocale microscopieAlizarine Rood-kleuringYoung-modulus
Gedecellulariseerde van appel afgeleide steigers voor botweefselengineering in vitro en in vivo
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.