Een workflow voor het kwantitatief bepalen van leeftijdsgebonden maculadegeneratielaesiespecifieke variaties in fundus-autofluorescentie

Samenvatting

Dit onderzoek beschrijft een workflow om autofluorescentieniveaus te bepalen en te vergelijken uit individuele interessegebieden (bijv. drusen en subretinale drusenoïde afzettingen bij leeftijdsgebonden maculadegeneratie [AMD]), rekening houdend met variërende autofluorescentieniveaus in de fundus.

Samenvatting

Fundus autofluorescentie (FAF) beeldvorming maakt het mogelijk om intrinsieke fluoroforen van de oculaire fundus niet-invasief in kaart te brengen, met name het retinale pigmentepitheel (RPE), nu kwantificeerbaar met de komst van confocale scanning laser oftalmoscopie gebaseerde kwantitatieve autofluorescentie (QAF). Het is aangetoond dat QAF over het algemeen afneemt aan de posterieure pool bij leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD). De relatie tussen QAF en verschillende AMD-laesies (drusen, subretinale drusenoïde afzettingen) is nog onduidelijk.

Dit artikel beschrijft een workflow voor het bepalen van laesiespecifieke QAF in AMD. Er wordt gebruik gemaakt van een multimodale in vivo beeldvormingsbenadering, met inbegrip van, maar niet beperkt tot, spectrale domein, optische coherentietomografie (SD-OCT), maculavolumescanning en QAF. Met behulp van aangepaste FIJI-plug-ins wordt het bijbehorende QAF-beeld uitgelijnd met het nabij-infraroodbeeld van de SD-OCT-scan (karakteristieke oriëntatiepunten; d.w.z. vertakkingen van vaten). De foveola en de rand van de oogzenuwkop worden gemarkeerd in de OCT-beelden (en overgebracht naar het geregistreerde QAF-beeld) voor een nauwkeurige positionering van de analyseroosters.

AMD-specifieke laesies kunnen vervolgens worden gemarkeerd op individuele OCT BScans of het QAF-beeld zelf. Normatieve QAF-kaarten worden gemaakt om rekening te houden met het variërende gemiddelde en de standaarddeviatie van QAF-waarden gedurende de fundus (QAF-beelden van een representatieve AMD-groep werden gemiddeld om normatieve standaard retinale QAF AMD-kaarten te maken). De plug-ins registreren de X- en Y-coördinaten, de z-score (een numerieke meting die de QAF-waarde beschrijft in relatie tot het gemiddelde van AF-kaarten in termen van standaarddeviatie van het gemiddelde), de gemiddelde intensiteitswaarde, de standaarddeviatie en het aantal gemarkeerde pixels. De tools bepalen ook z-scores uit de grenszone van gemarkeerde laesies. Deze workflow en de analysetools zullen het begrip van de pathofysiologie en de interpretatie van klinische AF-beelden bij AMD verbeteren.

Inleiding

Fundus autofluorescentie (FAF) beeldvorming biedt een niet-invasieve mapping van natuurlijk en pathologisch voorkomende fluoroforen van de oculaire fundus¹. De meest voorkomende blauwe (488 nm excitatie) autofluorescentie (AF) exciteert lipofuscine en melanolipofuscinekorrels van het retinale pigmentepitheel (RPE)^2,3,4. De verdeling en toename/afname van korrels spelen een centrale rol bij normale veroudering en verschillende netvliesaandoeningen, waaronder leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD)⁵.

Een verdere ontwikkeling van FAF, kwantitatieve fundus autofluorescentie (QAF), maakt het nu mogelijk om topografisch opgeloste retinale AF-intensiteiten ^4,6 nauwkeurig te bepalen. Door een referentie op te nemen in het optische pad van het FAF-beeldvormingsapparaat, kunnen AF-intensiteiten worden vergeleken tussen apparaten, tijdstippen en onderwerpen. Deze techniek heeft geresulteerd in een paradigmaverschuiving met betrekking tot een veronderstelde pathogenetische factor in LMD, waarvan lange tijd werd gespeculeerd dat deze te wijten was aan overmatige accumulatie van lipofuscine in RPE-cellen⁷. Histologische en klinische kwantificering van AF heeft echter een afname van AF bij AMD aangetoond (als gevolg van de herverdeling en het verlies van autofluorescerende lipofuscine en melanolipofuscinekorrels), in plaats van de voorgestelde toename van AF ^8,9,10.

Het monitoren van AF heeft klinische implicaties. Von der Emde et al. en anderen hebben aangetoond dat AF niet alleen afneemt, maar ook verder afneemt in het beloop van AMD in intermediaire AMD-ogen met een hoog risico ^8,9. Bovendien suggereren histologische studies dat de meeste door AMD aangetaste RPE-cellen een karakteristiek gedrag vertonen met granulaataggregatie en extrusie voorafgaand aan RPE-celverlies via subductie, vervelling, migratie of atrofie 13,14,15,16. Dit geeft verder aan dat AF-verlies een trigger of een surrogaatsignaal kan zijn van dreigende ziekteprogressie.

QAF-studies hebben tot nu toe alleen AF globaal geëvalueerd aan de achterste pool, met behulp van geprefabriceerde rasterpolaire coördinatensystemen (bijv. QAF8/Delori Grid)¹⁷. Het gebruik van geprefabriceerde rasters om AF te meten, resulteert in meerdere AF-waarden op vooraf bepaalde gebieden per oog van een onderwerp. Door AF-waarden op deze manier te onderzoeken, kunnen lokale veranderingen in gebieden met pathologisch veranderde AF over het hoofd worden gezien, bijvoorbeeld in AMD bovenop of in de buurt van drusen of subretinale drusenoïde afzettingen (SDD's). Drusen, en in hogere mate SDD's, worden in verband gebracht met een hoog risico op het ontwikkelen van late LMD en verlies van gezichtsvermogen. Drusen in het bijzonder hebben een typische cyclus van toename in omvang gedurende vele jaren en kunnen snel verslechteren voorafgaand aan atrofie. Het is denkbaar dat bijvoorbeeld globaal AF afneemt bij LMD, maar toeneemt of zelfs verder afneemt in en rond deze specifieke ziektegerelateerde focale laesies.

Verschillende lokale AF-patronen kunnen ook prognostische relevantie hebben voor ziekteprogressie. Autofluorescentieniveaus kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om te beoordelen of drusen in omvang toenemen of al in regressie zijn naar atrofie. Het is al aangetoond dat veranderde AF-perilesiepatronen bij geografische atrofie een grote invloed hebben op de progressie van atrofie in de loop van de tijd¹⁸. Bovendien zouden lokale autofluorescentiepatronen meer details kunnen onthullen over de gezondheid van de RPE. Vaak toont de optische coherentietomografie (OCT) hyperreflectie in de choriocapillaris, hoewel de RPE-laag intact lijkt. Een multimodale aanpak die lokale QAF-waarden en OCT combineert, kan helpen bij het differentiëren van laesies met een hoog risico op RPE-verstoring en dreigende atrofie.

Een van de redenen waarom ruimtelijk opgeloste analyses in studies niet zijn uitgevoerd, is omdat de meest gebruikte software van de fabrikant geen hulpmiddel biedt voor dit soort analyses. AF-eigenschappen van verschillende laesies, afhankelijk van het stadium van de LMD-ziekte, zouden de pathogenese van AMD verder kunnen verklaren. Daarom zou een instrument om regionale, laesiespecifieke AF te meten wenselijk zijn. Om laesies die zich over het hele netvlies bevinden nauwkeurig te vergelijken, heeft de workflow een manier nodig om rekening te houden met verschillende gradaties van AF in de menselijke fundus¹⁹. Het meest centraal is AF karakteristiek lager vanwege de schaduweffecten van maculapigment en verschillende korreltellingen^20,21.

AF bereikt zijn piek bij ~9° (afstand tot de fovea in alle richtingen) en neemt perifeer in grotere mate af⁴. Daarom, als men de absolute waarden van AF-niveaus van zachte drusen (gelokaliseerd in de fovea en parafovea in gebieden met lage AF) en SDD's (paracentraal in gebieden met hoge AF) zou vergelijken, zouden de resultaten niet vergelijkbaar zijn²². Geïnspireerd door het werk van Pfau et al. en het concept van gevoeligheidsverlies (het corrigeren van gevoeligheid gemeten in AMD voor de heuvel van het gezichtsvermogen [afnemende gevoeligheid van het netvlies met afstand tot de fovea] van gezonde controles) voor fundusgecontroleerde perimetrie, wordt AF vergeleken met gestandaardiseerde AF-waarden in de macula^23,24. De resultaten worden gerapporteerd als z-scores (numerieke meting van de relatie van een interessegebied met het gemiddelde).

Het doel van deze studie is het evalueren van het gebruik van een nieuw hulpmiddel voor het meten van lokale QAF-niveaus in verschillende soorten laesies bij patiënten met AMD. Deze tool is ontworpen om autofluorescentieniveaus te meten van laesies die zijn geïdentificeerd op OCT-scans. Dit maakt het mogelijk om lokale autofluorescentieniveaus in laesies, zoals zachte drusen of SDD's, te beoordelen en maakt het mogelijk om AF-veranderingen van laesies in de loop van de tijd te volgen. Het potentiële nut van deze tool is om een nieuwe structurele biomarker mogelijk te maken die de gezondheid van de RPE schat en mogelijk prognostische waarde heeft voor de onderzochte laesies.

Protocol

De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Bonn (protocolcode 305/21). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle proefpersonen die bij het onderzoek betrokken waren. We hebben alle deelnemers aan de video gevraagd om vrijwaringsformulieren te ondertekenen die ons toestemming geven om hun beeltenis en persoonlijke informatie te gebruiken bij het maken van een online video.

1. Kwantitatieve autofluorescentie (QAF) beeldacquisitie

1. Voor nauwkeurige beeldacquisitie met het QAF-apparaat moet u ervoor zorgen dat de deelnemer comfortabel voor het apparaat zit. Laat de deelnemer zijn kin en voorhoofd tegen de kin- en hoofdsteun drukken. Pas de hoogte van de kinsteun aan totdat de zijdelingse ooglidhoek op dezelfde hoogte is als de rode markering.
2. Zorg ervoor dat het beeld wordt scherpgesteld in de nabij-infraroodmodus door aan het wiel op het opnameapparaat te draaien totdat de kleine vaten scherp zijn. Zoom in op het oog door de camera naar voren te bewegen totdat de hoeken van het beeld gelijkmatig verlicht zijn. Als vuistregel geldt dat u de scherpstelling aanpast aan het sferische equivalent. Verminder de focus voorafgaand aan QAF-beeldvorming met een of twee dioptrieën, aangezien blauwe QAF een kortere golflengte gebruikt, en schakel de modus van het QAF-apparaat over van de nabij-infrarood- naar de QAF-modus.
3. Pas de verlichting opnieuw aan en schaal deze op en verfijn de focus van het beeld totdat de kleine vaten die zich het dichtst bij de fovea bevinden scherp zijn en het beeld helder wordt verlicht zonder rode stippen (wat wijst op overbelichting). Bleekt het fotopigment door ten minste 30 seconden in de QAF-modus te wachten voorafgaand aan de beeldacquisitie, zodat de voortdurende excitatie van blauw licht het fotoreceptorpigment in het gezichtsveld van de camera-instellingen kan bleken.
4. Om beelden vast te leggen, drukt u op beeldacquisitie op het touchpad van het beeldapparaat ; zorg ervoor dat u meer dan één QAF-afbeelding vastlegt in geval van knipperen of plotselinge oogbewegingen tijdens de acquisitie.
   OPMERKING: De workflow vereist ook spectrale domein optische coherentietomografie (SD-OCT)-beelden. OCT-beeldacquisitie wordt elders uitgelegd, omdat het veel wordt gebruikt in de klinische praktijk²⁵.

2. Afbeelding exporteren

1. Zorg er voor deze analysepijplijn voor dat de QAF- en OCT-installatiekopieën de XML-bestandsindeling (Extensible Markup Language) hebben. Klik in de HEYEX-viewer met de rechtermuisknop op een gewenste QAF/OCT-afbeelding en selecteer Exporteren | als XML in het vervolgkeuzemenu.

3. Open-source plug-ins voor QAF-analyse - het installeren van de pijplijn

OPMERKING: De gepresenteerde QAF-software is een opensource-plug-in met de naam "Spectralis-pijplijn" die is gemaakt voor de opensourcesoftware ImageJ (FIJI-uitbreiding)²⁶.

1. Om toegang te krijgen tot de plug-in, opent u FIJI, selecteert u Help en vervolgens Bijwerken in het vervolgkeuzemenu en klikt u vervolgens op Updatesites beheren om de Creative Computation Update Site "https://sites.imagej.net/CreativeComputation/" toe te voegen aan de reeds bestaande updatesites.
2. Download de plug-ins en start FIJI opnieuw. Nu is de Spectralis Pipeline geïnstalleerd. De verschillende Spectralis-plug-ins bevinden zich onder het vervolgkeuzemenu Plug-ins | Spectralis en plug-ins | SpectralisBatch.

4. Setup - gegevensopslag

OPMERKING: Om een naadloze workflow mogelijk te maken, is het aan te raden om de mappenstructuur als volgt in te stellen. Stel eerst een map in voor elk studieonderwerp. Oculus dexter (OD) en oculus sinister (OS) verwijzen respectievelijk naar het rechter- en linkeroog, en deze afkortingen worden in deze workflow gebruikt.

1. Stel voor elk onderzocht oog van elke proefpersoon één map in voor een OCT, respectievelijk OD_OCT en OS_OCT genoemd. Laat de Spectralis-pijplijn automatisch de uitvoer van de plug-in "Mark_BScans_OCT" opslaan als door tabs gescheiden waarden in deze mappen.
2. Maak voor de QAF-afbeeldingen twee mappen met de naam OD_QAF en OS_QAF.
3. Maak extra mappen als andere multimodale beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt. Zorg ervoor dat de resulterende mappenstructuur lijkt op de onderstaande structuur:
   CASE_ID
   OD_OCT
   OD_QAF
   OD_other_imaging_modality
   OS_OCT
   OS_QAF
   OS_other_imaging_modality

5. Conversie van het QAF XML-bestand naar een QAF-image (gebruikte plug-in: QAF_xml_reader)

1. De Spectralis QAF XML-exportbestanden worden opgeslagen in rood-groen-blauw (RGB) formaat, beperkt tot een schaal van 0 tot 255 (wat staat voor gemeten AF-waarden) en inclusief "standaard" en "zwarte" kalibratiegebieden. De plug-in "QAF_xml_reader" produceert een QAF-image. Open hiervoor het vervolgkeuzemenu plug-ins , selecteer Spectralis | QAF_XML_Reader en gooi het openingsscherm weg.
2. Er verschijnt een nieuw venster met de prompt Choose a directory containing a Spectralis XML QAF Export:. Selecteer de directory en klik op Selecteren.
3. Voer de referentiekalibratiefactor (RCF) van het QAF-apparaat in (opgenomen in de beeldinformatie van het QAF-beeld) en de leeftijd van de patiënt op het moment dat het beeld werd gemaakt.
4. Het volgende venster heet QAF-parameters. Als de patiënt pseudofak is bij het verkrijgen van beelden, selecteer dan in plaats daarvan de leeftijd van 20 jaar (dit heeft tot gevolg dat er geen leeftijdscorrectie wordt toegepast). Nadat u op OK hebt geklikt en een pop-up met het label Toewijzen aan 8 bits verschijnt, voert u de minimale QAF-waarde (qafMin) en de maximale QAF-waarde (qafMax) in voor een QAF-afbeelding met kleurcodering. Als qafMin en qafMax onbekend zijn, gebruikt u de standaardinstellingen, klikt u op OK en bekijkt u de originele afbeelding met het label Raw QAF-gegevens die wordt weergegeven, evenals de 32-bits QAF- en 8-bits kleurgecodeerde QAF-afbeelding.
   OPMERKING: De kleurgecodeerde QAF-afbeelding wordt uitsluitend gebruikt voor illustratieve doeleinden; de 32-bits QAF-afbeelding met werkelijke QAF-waarden wordt gebruikt voor verdere analyse.

6. QAF-images registreren met de OCT-image (gebruikte plug-in: Register_OCT_2)

OPMERKING: Deze stap is nodig om het OCT-beeld nauwkeurig uit te lijnen met het QAF-beeld, zodat laesies in de QAF-afbeeldingen en OCT-BScans worden uitgelijnd.

1. Toegang tot de plug-in via het vervolgkeuzemenu Plug-ins | Spectralis, of maak een sneltoets om toegang te krijgen tot de verschillende gebruikte plug-ins. Om dit te bereiken, selecteert u Register_OCT_2 onder Plug-ins | Sneltoetsen | Voeg snelkoppeling toe en kies de gewenste sneltoets.
2. Klik na het openen van de plug-in op OK in het eerste venster dat verschijnt. Vervolgens verschijnt er een venster met de vraag: Kies een map met de Spectralis OCT XML-export: in het hoofdvenster van ImageJ. Selecteer de map met de Spectralis OCT XML Export en klik op Openen.
   OPMERKING: De OCT wordt nu geladen, wat, afhankelijk van de verwerkingskracht van de gebruikte computer, tot 2 minuten kan duren.
3. Wacht vervolgens tot er een venster verschijnt met de prompt Geregistreerde afbeeldingen opslaan in: . Selecteer de map waar de EnFaceStack (uitgelijnd afbeeldingsbestand) wordt opgeslagen en klik op Openen.
4. Wacht op een pop-upvenster met de prompt Kies een afbeelding om toe te voegen aan de EnFaceStack: om te verschijnen, selecteert u de 32-bits QAF-afbeelding om de afbeelding uit te lijnen met de SD-OCT en klikt u op Openen. Als alle benodigde afbeeldingen in deze EnFaceStack zijn opgenomen, selecteert u Annuleren.
5. Wanneer de gebruiker in het volgende venster wordt gevraagd een label voor de EnFaceStack te selecteren, selecteert u het vooraf gemaakte QAF-label ; U kunt ook de gewenste naam van de modaliteit invoeren in het vak Overig. Selecteer OK om de afbeelding te registreren.
   OPMERKING: Gebruik geen spaties of andere interpunctie in het veld Overig .
6. Let op de drie vensters die tevoorschijn komen. De eerste is gelabeld als Localizer en geeft de SD-OCT weer als een afbeelding met het linkeroog (OS). Het tweede venster heet QAF of een van de andere modaliteiten die eerder zijn geselecteerd als het oorspronkelijke linker (OS) of rechter (OD) oog. Het laatste venster heet Oriëntatiepunten, waarin wordt gevraagd om één tot drie oriëntatiepunten in elke afbeelding te selecteren.
7. Lijn de twee afbeeldingen uit door één tot drie oriëntatiepunten per afbeelding te selecteren - vertakkingen van vaten of andere kenmerken die zich op beide modaliteiten bevinden. Zoom in (gebruik het toetsenbordteken " + om in te zoomen en " -" om uit te zoomen) voordat u het oriëntatiepunt selecteert. Zorg ervoor dat de geselecteerde oriëntatiepunten zowel verticaal als horizontaal in de afbeelding worden verspreid. Zodra alle oriëntatiepunten zijn geannoteerd, selecteert u OK op het tabblad Oriëntatiepunten en Annuleren bij de volgende prompt.
8. Wanneer een venster met de vraag Wilt u de resultaten zien verschijnt, selecteert u Ja om te controleren of de afbeelding correct is uitgelijnd. Doe dit door in te zoomen op een klein vaartuig en de cursor ernaast te plaatsen, en vervolgens omhoog of omlaag te scrollen om te controleren hoeveel het vaartuig beweegt ten opzichte van de cursor. Als de uitlijning niet nauwkeurig is, verwijdert u het bestand ".tiff" in de map OD_QAF en start u het proces opnieuw vanaf het begin van stap 2.
   OPMERKING: Aangezien de markeringen op Mark_BScans_OCT nauwkeurig moeten zijn, moet de uitlijning tussen het SD-OCT- en QAF-beeld ook zeer nauwkeurig zijn. Op de meeste afbeeldingen kan pixel-perfecte uitlijning worden bereikt, hoewel in sommige gevallen de uitlijning beperkt is tot een nauwkeurigheid van drie of vier pixels.

7. Een gemiddelde QAF-afbeelding maken ter vergelijking (gebruikte plug-in: StandardRetina/BatchStandardRetina)

OPMERKING: QAF-waarden zijn sterk afhankelijk van de locatie van het netvlies (bijv. centrale schaduw veroorzaakt door maculapigment). Daarom moeten de QAF-waarden van drusen worden vergeleken met de standaard QAF-waarden van dezelfde regio. Als voorwaarde voor analyse maakt de StandardRetina een enface-kaart van gemiddelde QAF-beelden (bijvoorbeeld van een op leeftijd afgestemd controlecohort). De resulterende enface-kaart toont een pixel-voor-pixel kaart van een gemiddelde QAF-waarde voor het centrale netvlies.

1. Er zijn twee manieren om standaard netvliezen te maken binnen de Spectralis-pijplijn: de eerste, AddToStandardRetina_OCT, staat één nieuw geval tegelijk toe aan de enface-kaart, terwijl de tweede, BatchStandardRetina, meerdere gevallen tegelijk toevoegt.
   1. Als u één afbeelding tegelijk wilt toevoegen, selecteert u Plug-ins | Spectralis | AddToStandardRetina_OCT en sluit het openingsscherm. Wanneer er een venster verschijnt met de tekst Kies een map met een Spectralis OCT XML-export, selecteert u de map en klikt u op Selecteren om de BScan te openen.
   2. Wanneer een nieuw venster verschijnt met de prompt Kies een map met geregistreerde EnFace-afbeeldingen:, selecteer de juiste map en klik op Selecteren.
   3. Let op de drie vensters die verschijnen, een met het label EnFaceStack dat de gestapelde afbeeldingen weergeeft uit de map die in de tweede stap is geselecteerd, het tweede met het label Bscan Stack met de OCT BScan en een derde venster dat in het midden verschijnt met het label Choose Modality. Selecteer een modaliteit uit de EnFaceStack.
   4. Selecteer een modaliteit en observeer het nieuwe venster dat verschijnt met de prompt Kies een map met de StandardRetina. Als er nog geen map met een StandardRetina bestaat, selecteert u een lege map om een nieuwe StandardRetina te maken.
   5. Bekijk de nieuwe StandardRetina, scrol omhoog en omlaag en verplaats de cursor om het gemiddelde en de standaarddeviatie voor die specifieke locatie weer te geven. Klik op de knop Accepteren? Om de meest recente foto toe te voegen aan de StandardRetina of deze te verwijderen.
2. Als u meerdere afbeeldingen tegelijk wilt toevoegen, gebruikt u Batch_QAF_StandardRetina.
   1. Bereid eerst een "manifest.txt"-bestand voor in dezelfde map als de case-ID's en zorg ervoor dat het relatieve pad van de locatie van het .txt-bestand naar de OCT en de EnFaceStack wordt weergegeven. Scheid de twee door een tabspatie en zorg ervoor dat er geen extra witruimte voor en achter de namen staat. Het bestand moet er als volgt uitzien:
      pathToOCT_1>pathToEnFaceStack_1>001/OD-OCT>001/OD-QAF
      pathToOCT_2>pathToEnFaceStack_2>002/OD-OCT>002/OD-QAF
   2. Maak het bestand aan in spreadsheetsoftware en sla het op als txt-bestand. Zorg ervoor dat alle paden de segment(tekenletters) QAF bevatten om het manifestbestand goed te laten werken. De plug-ins bevinden zich onder het vervolgkeuzemenu Plug-ins | SpectralisBatch-Batch | QAF_StandardRetina.
   3. Sluit het openingsscherm en wacht tot er een nieuw venster wordt geopend met de prompt Selecteer de eerste Standard Retina. Selecteer een map met een reeds bestaande StandardRetina of selecteer een lege map om een nieuwe StandardRetina aan te maken.
   4. Zoek naar een prompt met het label Select Modality om te verschijnen; de standaardinstelling is QAF. Zorg ervoor dat de bestandsnaam van de betreffende modaliteit exact overeenkomt met de bestandsnaam voor een segment in elke EnFaceStack die in het manifestbestand wordt genoemd. Wanneer vervolgens een venster wordt geopend waarin de gebruiker wordt gevraagd een manifestbestand te kiezen (eerder beschreven), klikt u op Annuleren als er geen ander manifestbestand aan dit StandardRetina-bestand moet worden toegevoegd of selecteert u een ander manifestbestand. Bekijk de nieuwe StandardRetina in een nieuw venster met de naam Accepteren? en beslis of u de nieuwste batch aan de StandardRetina wilt toevoegen of de nieuwste batch wilt verwijderen.
      OPMERKING: Het proces van het combineren van alle QAF's tot een StandardRetina kan enige tijd duren.

8. Gebieden annoteren die van belang zijn voor analyse (gebruikte plug-in: Mark_BScans_OCT)

1. Als u laesies (zoals drusen) wilt markeren, opent u Plug-ins | Spectralis | Mark_BScans_OCT en negeer de openingsprompt. Zoek naar een nieuw venster met het label Kies een map met een Spectralis OCT XML-export om te verschijnen. Kies de map met de gewenste OCT en klik op OK.
2. Nadat FIJI de LGO heeft geladen, observeert u het nieuwe venster met het label Kies een map met geregistreerde en gezichtsafbeeldingen om te verschijnen. Selecteer de map met de EnFaceStack en klik op Selecteren.
3. Er verschijnen nu drie nieuwe vensters, één met de naam EnFaceStack, één met de naam BscanStack en één met de naam User Parameters.
   1. In het venster Gebruikersparameters wordt de gebruiker gevraagd de volgende parameters in te voeren: Case-ID, die vervolgens wordt weergegeven in de naam van het uitgevoerde csv-bestand, bandbreedte in mm, de breedte van de vlaklijn, de regelbreedte van BScan en de dekking van het regiomasker.
      1. De parameter bandbreedte in mm bepaalt de breedte van elke iso-hull in millimeters (mm). Gebruik de lijnbreedte van Enface om de lijndikte van gemarkeerde laesies in het venster met het label EnFaceStack te wijzigen.
      2. De BScan-lijndikte bepaalt de lijnbreedte op het venster Bscan Stack. Houd er rekening mee dat het instellen van deze parameter op 1 in de meeste gevallen de beste instelling voor de regeldikte is.
      3. Kies tussen een En-gezichtsmasker of een afstandskaart die in een apart venster wordt weergegeven om te beslissen of de binnenbanden moeten worden ingekleurd. Klik daarna op gereed in het venster Markeren in BScan in de plug-in.
   2. Wanneer u vervolgens wordt gevraagd om een reeds bestaande StandardRetina te selecteren, selecteert u de map met de StandardRetina en klikt u op Selecteren. Merk op dat als een StandardRetina is geselecteerd, de uitvoer Mark_BScans_OCT de modus z-score selecteert (van een gemeten QAF-waarde in vergelijking met StandardRetina). Als de ruwe QAF-waarde de voorkeur heeft, klikt u op Annuleren en wacht u op een nieuw venster met het label Bericht dat waarschuwt dat de resultaten onbewerkte waarden zijn, geen z-scores.
4. Zoek naar een nieuw venster om te verschijnen met de prompt Kies een map met de opgeslagen status met de opgeslagen gegevens. Als er een opslagbestand bestaat, klikt u op de map met de segmenten | Selecteren. Als de voortgang niet moet worden opgeslagen, selecteert u annuleren. Zoek naar een nieuw venster met het label Markeren in BScan en selecteer in een vervolgkeuzemenu de optie opslaan, negeren, gereed en markeren.
   1. Merken: Begin met het annoteren van de interessegebieden in de BScan, met vergelijkbare commando's als in de "Register_OCT_2" plug-in die hierboven is uitgelegd. Als u een gebied wilt markeren, selecteert u starten door met de rechtermuisknop te klikken en de muiscursor naar het einde van de laesie te slepen, ervoor te zorgen dat markering is geselecteerd in het venster Markeren in B-Sscan en op OK te klikken. Het interessegebied is nu gemarkeerd in deze BScan.
   2. Negeren: Selecteer Negeren in het venster Markeren in BScan en klik op OK om de markering te negeren.
   3. Redden: Selecteer opslaan in het venster Markeren in BScan en klik op OK om een nieuw venster te laten verschijnen, met de prompt selecteer een map om de status op te slaan. Selecteer een reeds bestaande map of maak een nieuwe map aan. Open reeds bestaande bestanden door "Mark_BScans_OCT" te starten en selecteer de map met de opslagstatus wanneer het venster Kies een map met de opgeslagen status verschijnt.
      OPMERKING: Meerdere opslagstatussen kunnen niet in één map worden opgeslagen; Opslaan van statussen van de ene landinstelling naar de andere kan niet gemakkelijk worden omgeschakeld (bijv. DUITS naar VS).
   4. Klaar: Selecteer gereed in het venster Markeren in BScan en klik op OK om een nieuw venster met het label kies modaliteit te laten verschijnen.
   5. Wanneer een prompt met het label breng de juiste modaliteit bovenop de enface-stapel verschijnt, brengt u de modaliteit met de naam QAF bovenop, die is uitgelijnd met "Register_OCT_2". Doe dit door door de EnFaceStack te scrollen, het venster En face Stack te selecteren of op de pijl naar links of rechts te klikken. Merk op dat de naam van de modaliteit in de linkerbovenhoek wordt weergegeven.
   6. Als u de laesies beter wilt inspecteren en markeren, zoomt u in op het Scan-venster. Klik op het B-Scan-venster , wijs met de muis in de richting om in te zoomen en druk op de + -toets; Druk op de toets - om uit te zoomen.
   7. Blader door de BScan-stapel door met de muis omhoog of omlaag te scrollen, de balk onderaan naar links of rechts te slepen om door de scan te bladeren, of door het B-Scan-frame te selecteren en op de linker- en rechterpijltjestoetsen op het toetsenbord te klikken. Merk op dat een overzicht van het huidige gebied in de BScan-stack wordt gegeven door de rode lijn in het EnFaceStack-venster en linksboven in het BScan-venster waar het BScan-nummer (bijv. 31/120) wordt weergegeven.
5. Klik op OK om een nieuw .tsv-bestand aan te maken in de bijbehorende map "OD_OCT" of "OS_OCT". Merk op dat de .tsv-bestandsnaam zal bestaan uit "Mark_Bscans_OCT" plus de case-ID die is ingevoerd, de lateraliteit en de modaliteit die is gekozen in de laatste stap van Mark_Bscans_OCT. Bovendien worden kleurgecodeerde "iso-hulls" van de drusen nu weergegeven in de EnFaceStack.

Resultaten

De uitvoer weergeven
Om de resultaten adequaat te analyseren en er conclusies uit te trekken, is het belangrijk om het uitvoerbestand van Mark_Bscans_OCT te begrijpen. De eerste drie kolommen zijn gelabeld na de case-ID, de lateraliteit van het bestand en de gekozen beeldvormingsmodaliteit. De vierde kolom wordt aangeduid met de modus en heeft het label z-score. Merk op dat op het moment van schrijven van deze tekst Mark BScans alle laesies slechts in één keer kan berekenen; De rijen verwijzen naar iso-hulls, waarvan de afstanden tot de buitenrand van de laesie worden gespecificeerd in de onderste en bovenste kolommen van de spreadsheet. Iso-hulls meten AF in z-scores (in het geval van QAF) in een gespecificeerde omtrek rond de laesie. Merk op dat de minimumwaarde van een pixel in een iso-hull kan worden gevonden in de kolommen met het label min, de kolommen met het label mediaan, max, gemiddelde en stdev, respectievelijk de mediaan, het maximum, het gemiddelde en de standaarddeviatie van het gemiddelde van de pixelwaarden in eeniso-hull. De kolom n bevat het totaal aantal pixels in een iso-hull. Figuur 1 toont een enkelvoudig gemarkeerde zachte drusen van een 84-jarige mannelijke patiënt met intermediaire leeftijdsgebonden maculadegeneratie (iAMD).

Figuur 2 toont het linkeroog van een representatieve patiënt met SDD's gemarkeerd met de QAF-Workflow tool (Figuur 3). SDD's bij deze patiënt waren geassocieerd met verlaagde AF (z-score = -0,4 ± 0,2). Evenzo vertoonden de iso-hulls rond de SDD een verminderde AF (bijv. de dichtstbijzijnde iso-hull = -0,3 ± 0,3) in vergelijking met de StandardRetina. Een plausibele verklaring voor dit fenomeen zou schaduweffecten (verminderde doorschijnendheid) van SDD-laesies op de RPE kunnen zijn. Het gebruik van SDD's was voorbeeldig. De tool maakt het ook mogelijk om lokale AF-niveaus in andere laesies, zoals drusen, te beoordelen. Bovendien maakt de tool het mogelijk om AF-veranderingen van laesies in de loop van de tijd te volgen.

Figuur 1: Een enkelvoud gemarkeerde zachte drusen van een 84-jarige mannelijke patiënt met intermediaire leeftijdsgebonden maculadegeneratie (iAMD). (A) Het QAF-beeld van een linkeroog met de gemarkeerde drusen. (B) Close-up van de drusen: bruin centrum dat de gemarkeerde drusen vertegenwoordigt en gekleurde banden die de omringende iso-rompen voorstellen. De onderstaande tabel geeft het uitvoerbestand weer. QAF-drusenwaarden worden vergeleken met overeenkomstige QAF-waarden van de overeenkomstige excentriciteit van de StandardRetina. Dit resulteert in z-scores die de afwijking van het gemiddelde van niet-getroffen gebieden vertegenwoordigen. Het blauwe kader toont van links naar rechts: de casus-ID, lateraliteit van het oog, gebruikte modaliteit en de gewenste output (in dit geval z-scores). Kolommen binnen het oranje vak geven de grenzen van het gemeten gebied in millimeters aan (ondergrens = ondergrens, bovengrens = bovengrens). Het groene vak labelt de kolommen met de QAF-metingen. Van links naar rechts bevatten deze het minimum, de mediaan, het maximum, het aantal pixels, het gemiddelde en de standaarddeviatie van het gemiddelde. Elke rij vertegenwoordigt een iso-hull, rijen binnen het blauwe vak vertegenwoordigen waarden binnen de laesie en rijen binnen het paarse vak tonen de iso-hulls rond elke laesie (van boven naar beneden met toenemende afstand tot de laesie). Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Gemarkeerde SDD's in een QAF-afbeelding van een 80-jarige vrouwelijke patiënt met vroege AMD. (A) SDD's zijn te zien in de QAF-afbeelding. Dezelfde QAF-afbeelding wordt weergegeven met ingedrukte annotaties van SDD's. (B) Rond elke gemarkeerde laesie zijn de iso-hulls afgebeeld met kleurcodering (lichtgroen, donkergroen en rood). (C) Een vergrote versie van de blauwe rechthoek. De buitenrand van elke SDD is blauw gemarkeerd. Afkortingen: QAF = kwantitatieve autofluorescentie; LMD = leeftijdsgebonden maculadegeneratie; SDD = subretinale drusenoïde afzetting. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3: Workflow om de AF van laesies te bepalen. Deze afbeelding visualiseert de softwareplug-ins die nodig zijn om laesiespecifieke AF te bepalen. (A) Afbeelding toont een kleurgecodeerd QAF-beeld dat kan worden gebruikt om de verdeling van QAF-waarden te visualiseren, maar mag niet worden gebruikt voor verdere analyse. (B) Op de voorgrond wordt een QAF-beeld getoond, met op de achtergrond het infraroodbeeld van de SD-OCT-scan. Dit wordt verondersteld de uitlijning te visualiseren met behulp van vertakkingen van bloedvaten. Dit kan met behulp van de Register_OCT_2 plug-in. (C) Een StandardRetina die wordt gebruikt om de z-scorewaarden van laesies te meten. StandardRetinas kunnen worden gemaakt met behulp van StandardRetina/BatchStandardRetina. (D) Een BScan met blauwe pijlen die naar SDD's wijzen, die worden gemarkeerd door gele lijnen (let op: laesies worden altijd gemarkeerd onder de RPE, onafhankelijk van de locatie in de z-richting) wordt afgebeeld. (E) Alle gemarkeerde laesies zijn afgedrukt op een QAF-afbeelding (zie figuur 1). De laatste twee stappen worden uitgevoerd met behulp van de Mark_BScans_OCT plug-in. Afkortingen: AF = autofluorescentie; QAF = kwantitatieve autofluorescentie; SDD = subretinale drusenoïde afzetting; IR = infrarood; RPE = retinaal pigmentepitheel; SD-OCT = spectraal domein optische coherentietomografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Deze workflow biedt een stapsgewijze handleiding voor het gebruik van open-source FIJI-plug-intools om AF van AMD-specifieke laesies te bepalen en te vergelijken. De plug-ins bieden gebruiksvriendelijke sjablonen die geen codeerkennis vereisen en die door artsen kunnen worden toegepast zonder technische ondersteuning²⁷. Voor zover wij weten, zijn deze tools uniek in hun soort voor laesie-specifieke AF-kwantificering.

QAF-waarden variëren van nature over het netvlies, met waarden die hoger zijn aan de periferie en lager in de macula als gevolg van ongelijke verdeling van lipofuscine en melanolipofuscine in het netvlies, de lage AF van bloedvaten en ongelijke verdeling van maculaire pigmenten. Vanwege de grote variatie van natuurlijk voorkomende QAF-niveaus in het netvlies, is het rechtstreeks analyseren van absolute QAF-waarden van laesies geen veelbelovende benadering. Een hypoautofluorescerende laesie in de periferie kan bijvoorbeeld nog steeds hogere absolute QAF-waarden hebben dan de fysiologische fluorescentieniveaus van de macula. Het gebruik van een StandardRetina en het gebruik van z-scores om de fluorescentieniveaus van drusen te meten, corrigeren voor deze natuurlijk voorkomende variantie van QAF-waarden.

Een z-score is een numerieke meting van de relatie van een interessegebied met het gemiddelde in de StandardRetina. Het wordt berekend door het gemiddelde van een individu af te trekken van het gemiddelde van de StandardRetina op dezelfde locatie en vervolgens het resultaat te delen door de standaarddeviatie. Deze standaardisatie maakt het mogelijk om verschillende QAF-beelden met elkaar te vergelijken, omdat de z-score aangeeft hoeveel standaarddeviaties een waarde afwijkt van het gemiddelde. Een positieve z-score geeft aan dat de waarde boven het gemiddelde ligt, terwijl een negatieve z-score aangeeft dat deze onder het gemiddelde ligt.

Het is belangrijk op te merken dat er mogelijke valkuilen kunnen zijn waarmee rekening moet worden gehouden. Hoewel deze methode rekening houdt met de variërende hoeveelheid AF-niveaus in de fundus, is het misschien nog steeds niet de meest nauwkeurige manier om de AF van een RPE te meten en te vergelijken. Individuen hebben verschillende niveaus en topografie van maculaal luteaal pigment, en laesies kunnen ook de doorschijnendheid van het bovenliggende netvlies beïnvloeden^28,29. Het is daarom aannemelijk dat de gemeten verminderde AF in gebieden met SDD's (zie representatieve resultaten) een gevolg is van schaduweffecten in plaats van verminderde fluoroforen in de RPE^30,31,32.

We werken momenteel aan een workflow om rekening te houden met retinale reflectiviteit, dikte en gekwantificeerd maculapigment (met behulp van groene en blauwe AF) met lineaire gemengde modellen. Bovendien gebruikt QAF tot nu toe een leeftijdsafhankelijke correctiefactor om rekening te houden met lenticulaire troebeling die geen rekening houdt met interindividuele verschillen in de lenticulaire troebeling van deelnemers van een vergelijkbare leeftijd^{van 33} jaar. Daarom werken we momenteel aan een workflow voor een gepersonaliseerde correctiefactor van lenticulaire autofluorescentie en vertroebeling. Om op betrouwbare wijze informatie over AF uit kleine laesies te extraheren, is een adequate test-hertestbetrouwbaarheid van QAF-beelden nodig. Om verder onderscheid te maken tussen die QAF-beelden waarbij een meer gedetailleerde analyse haalbaar is, onderzoeken we "QAF-beeldbetrouwbaarheidsindices" die de test-hertestbetrouwbaarheid van QAF-beelden kunnen voorspellen. In het huidige stadium is de voorzichtige aanpak om dubbele beelden te verkrijgen en de betrouwbaarheid van laesiespecifieke AF opnieuw te testen.

De gepresenteerde methode voor het aanvullend analyseren van de iso-hulls van laesies was technisch moeilijk te implementeren, omdat iso-hulls van naburige laesies samensmelten. Gebieden met gefuseerde iso-rompen kunnen verschillend worden gekarakteriseerd, afhankelijk van welke laesie wordt overwogen. Onze oplossing was om alle laesies van één type als één laesie te beschouwen en hun periferie te analyseren als een gezamenlijke iso-romp. Deze methode vermindert echter drastisch de mogelijkheid om de iso-hulls van individuele drusen te meten en kan worden beschouwd als een verdere valkuil van deze techniek. Meer technisch geavanceerde methoden om rekening te houden met gefuseerde iso-hulls of opgeschorte rapportage van AF in gebieden met gefuseerde iso-hulls zouden de analyse van AF in de omtrek van laesies in de toekomst kunnen vergemakkelijken.

We gebruikten LMD als modelziekte voor deze studie. De workflow kan ook worden aangepast om laesies bij andere ziekten te bestuderen. Tot nu toe is QAF gebruikt bij veel chorioretinale aandoeningen, waaronder recessieve ziekte van Stargardt, Bestrophin-1-geassocieerde ziekten, verschillende vormen van retinitis pigmentosa, acute zonale occulte uiterlijke retinopathie, pseudoxanthoma elasticum en andere 17,33,34,35,36,37 . Aangezien deze workflow gebruikmaakt van open-source software, moedigen we anderen aan om dit werk te dupliceren bij het bepalen van laesiespecifieke AF en onze kennis van netvliesaandoeningen uit te breiden. Samenvattend presenteren we een workflow om AF-niveaus van verschillende retinale laesies in de macula te bepalen en te vergelijken. Deze workflow maakt de weg vrij voor een meer diepgaande analyse van AF en zou de ontwikkeling van nieuwe biomarkers in AMD en daarbuiten kunnen vergemakkelijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BatchStandardRetina plugin	n.v.t.	n.v.t.	n.v.t.
FIJI (Image J)	n.v.t.	n.v.t.	n.v.t.
Mark_Bscans_OCT plugin	n.v.t.	n.v.t.	n.v.t.
Microspft office	Microsoft	n.v.t.	n.v.t.
QAF_xml_reader plugin	n.v.t.	n.v.t.	n.v.t.
Register_OCT_2 plugin	n.v.t.	n.v.t.	n.v.t.
Spectralis	Heidelberg Engineering	n.v.t.	QAF-extensie
StandardRetina plugin	n.v.t.	n.v.t.	n.v.t.