Method Article

Verbeterde methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en het uitrollen van hele bergen van primordia van maïsbladeren voor fluorescentie en confocale beeldvorming

DOI:

10.3791/65239

⸱

September 22nd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, School of Science and Engineering, Ateneo de Manila University, 2Division of Biological Sciences, Interdisciplinary Plant Group, and Missouri Maize Center, University of Missouri

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maïsblad primordia zijn diep verwarmd en gerold, waardoor ze moeilijk te bestuderen zijn. Hier presenteren we methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en ontrolde hele bergen van maïsblad primordia voor fluorescentie en confocale beeldvorming.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In maïs (Zea mays) en andere grassen (Poaceae) zijn de blad primordia diep ingekapseld en gerold in de bladkrans, waardoor het moeilijk is om de vroege bladontwikkeling te bestuderen. Hier beschrijven we methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en uitgerolde hele mounts van maïsblad primordia voor fluorescentie en confocale beeldvorming. De eerste methode maakt gebruik van een draadstripper om de bovenste delen van oudere bladeren te verwijderen, waardoor de punt van het blad primordium wordt blootgesteld en de meting ervan mogelijk is voor nauwkeurigere transversale bemonstering. De tweede methode maakt gebruik van heldere, dubbelzijdige nanotape om primordia van het hele blad uit te rollen en te monteren voor beeldvorming. We tonen het nut van de twee methoden bij het visualiseren en analyseren van fluorescerende eiwitreporters in maïs. Deze methoden bieden een oplossing voor de uitdagingen van de kenmerkende morfologie van maïsblad primordia en zullen nuttig zijn voor het visualiseren en kwantificeren van anatomische en ontwikkelingskenmerken van bladeren in maïs en andere grassoorten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grasgewassen zijn een belangrijke bron van voedsel en biobrandstof voor de wereldbevolking1, en het verbeteren van de bladanatomie heeft het potentieel om hun productiviteit te verhogen 2,3. Ons huidige begrip van hoe bladanatomie wordt gereguleerd in grassen is echter beperkt4 en vereist de analyse van bladprimordia, omdat veel anatomische en fysiologische kenmerken van het blad vroeg in de ontwikkeling vooraf zijn bepaald 5,6,7. Cellulaire beeldvormingstechnieken, zoals fluorescentie en confocale beeldvorming, zijn onmisbaar voor het bestuderen van de anatomie van grasbladeren en cellulaire eigenschappen, maar deze technieken zijn moeilijk toe te passen op primordia van grasbladeren omdat ze diep zijn ingebakken en in de bladkrans zijn gerold. We hebben dit probleem aangepakt door methoden te ontwikkelen voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en uitgerolde hele bladbevestigingen voor fluorescentie en confocale analyse van maïsbladprimordia, een modelsysteem voor het bestuderen van de anatomie en ontwikkeling van grasbladeren 2,8.

Het maïsblad bestaat, zoals alle grasbladeren, uit een riemachtig blad met een schede dat zich om de stengel wikkelt en zich ontwikkelt tot scheut 9,10,11,12,13. De bladeren ontwikkelen zich uit het scheut-apicale meristeem (SAM) in een distichous-patroon, waarbij elk nieuw blad in de tegenovergestelde positie van het vorige blad begint, wat resulteert in twee rijen bladeren langs de verticale as (figuur 1A)14 . Het ontwikkelingsstadium van elk blad primordium wordt geïdentificeerd door zijn positie ten opzichte van de SAM, waarbij het dichtstbijzijnde primordium wordt aangeduid als plastochron1 (P1) en de volgende primordia wordt aangeduid als P2, P3, enzovoort (figuur 1B, C) 2. Tijdens de ontwikkeling (figuur 1D) verschijnt het blad primordium eerst als een halvemaanvormige steunbeer rond de basis van de SAM (P1), en groeit vervolgens uit tot een kapvormig primordium dat zich uitstrekt over het meristeem (P2)9,10,11. De basale randen van de kap breiden zich vervolgens zijdelings uit en overlappen elkaar naarmate de punt naar boven groeit en een kegelvormig primordium (P3-P5)10 vormt. Het primordium groeit dan snel in lengte en de schede-bladgrens aan de basis wordt prominenter met de vorming van de ligule, de franjeachtige projectie aan de adaxiale kant van het blad (P6/P7). Ten slotte ontrolt het blad zich als het uit de krans komt tijdens steady-state groei, waarbij de delende cellen beperkt zijn binnen het kleine basale gebied van het blad, waardoor een gradiënt wordt gevormd met uitzettende en differentiërende cellen langs de proximaal-distale as (P7 / P8)15. De scheuttop van een maïszaailing bevat meerdere primordia in verschillende stadia van ontwikkeling, waardoor het een uitstekend model is voor het bestuderen van bladontwikkeling8.

Nauwkeurige analyse van vroege bladontwikkeling vereist stadiëring of het gebruik van gestandaardiseerde criteria om verschillende stadia van primordiumontwikkeling te definiëren in relatie tot andere groei- of morfologische parameters. Omdat de bladprimordia verborgen zijn in de grasscheut, gebruiken onderzoekers meestal parameters zoals de leeftijd van de plant of de grootte van de opkomende bladeren als voorspellers voor de stadia en maten van de bladprimordia 9,16. In maïs wordt de chronologische leeftijd van de plant bepaald door het aantal dagen na het planten of ontkiemen (DAP/DAG)17,18. Het vegetatieve stadium (V-stadium) wordt bepaald door het bovenste blad met een zichtbare kraag, een bleke lijn aan de abaxiale zijde tussen het blad en de schede die overeenkomt met de positie van de ligule en oorschelpen, een paar wigvormige gebieden aan de basis van het blad (figuur 1A,B)17,19 . Tussen 20 en 25 DAG gaat de SAM over in een bloeiwijze meristeem en stopt met het produceren van nieuwe bladeren20. De groeisnelheden van maïsblad primordia kunnen variëren afhankelijk van de omgeving en het genotype van de plant. Om deze reden kunnen de leeftijd van de plant en de grootte van de opkomende bladeren de grootte van bladprimordia niet nauwkeurig voorspellen; Het gebruik van deze parameters kan echter helpen bij het voorspellen van het bereik van primordia-stadia en -groottes voor experimentele doeleinden.

Transversale sectieanalyse is een populaire methode voor het onderzoeken van bladanatomie en ontwikkeling in maïs en andere grassen, omdat het de bemonstering van meerdere plastochronen in een enkele sectie over de scheut21,22,23 mogelijk maakt. Deze methode is ook handig voor cellulaire beeldvorming van verse monsters, omdat de omliggende bladeren dienen als een steiger die de bladprimordia op zijn plaats houdt tijdens het doorsneden en monteren24. Een nadeel van deze methode is echter dat het een uitdaging kan zijn om het doelplastochron en het gebied in het primordium nauwkeurig te lokaliseren bij het snijden van een intacte scheut. Omdat de bladgroei varieert tussen plastochronen en langs de proximaal-distale as2,5, kan onnauwkeurige bemonstering bovendien leiden tot een onjuiste interpretatie van het ontwikkelingsstadium en het gebied van het primordium in een bepaalde sectie. Daarom is het ontwikkelen van een methode voor nauwkeurige transversale doorsnedebemonstering van cruciaal belang om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van anatomische en ontwikkelingsanalyses van grasbladprimordia te waarborgen.

Analyse van de hele bladmontage maakt het uitgebreide en integratieve onderzoek mogelijk van weefsel- en cellulaire processen die plaatsvinden op de schaal van het hele orgaan, zoals proliferatieve groei25 en aderpatronen26,27,28. De methode biedt een paradermale overzicht van het blad, waardoor verschillende processen en patronen kunnen worden ontdekt die anders moeilijk te detecteren zouden zijn met behulp van transversale sectieanalyse24,27. Anders dan in Arabidopsis, waar er al gevestigde methoden zijn voor het in beeld brengen van hele bladbevestigingen29,30, is er momenteel geen standaardmethode voor het in beeld brengen van uitgerolde hele bladbevestigingen in grassen. Een eerder protocol voor het uitrollen van geïsoleerde maïsbladprimordia betrof ongebruikelijke materialen en was niet geschikt voor cellulaire beeldvorming31. Geavanceerde beeldvormingstechnieken, zoals computertomografie (CT) en magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), kunnen 3D-anatomische informatie verkrijgen zonder de primordia 11,32,33 te isoleren en uit te rollen, maar ze zijn duur en vereisen gespecialiseerde apparatuur. Het ontwikkelen van een techniek om de beperkingen te overwinnen die worden opgelegd door de gewalste en conische morfologie van bladprimordia in maïs en andere grassen, zou het onderzoek naar hun anatomische en ontwikkelingskenmerken bevorderen.

Hier presenteren we methoden voor het voorbereiden van dwarsdoorsneden en ontrolde hele bergen van maïsblad primordia voor fluorescentie en confocale beeldvorming. We gebruikten deze methoden om het adergetal te kwantificeren en de ruimtelijk-temporele hormoonverdeling in maïsblad primordia in kaart te brengen met fluorescerende eiwitten (FP's)24. De eerste methode omvat het verwijderen van het bovenste deel van oudere bladeren van maïszaailingen met een draadstripper (figuur 1E). Door de punt van het primordium (P5-P7) bloot te leggen, wordt het mogelijk om de lengte ervan te bepalen zonder de oudere omliggende bladeren volledig te hoeven verwijderen, waardoor eenvoudig en nauwkeurig snijden mogelijk is. De tweede methode omvat het uitrollen en monteren van primordia van hele bladeren (P3-P7) met heldere, dubbelzijdige nanotape (figuur 1F). Deze methoden zijn geschikt voor het visualiseren van verschillende FP's24, maar moeten worden geoptimaliseerd voor het gebruik van fluorescerende kleurstoffen en zuiverende reagentia. Daarnaast schetsen we enkele procedures voor het afvlakken van z-stacks, het naaien van afbeeldingen en het samenvoegen van kanalen in ImageJ / FIJI34, die van toepassing zijn op de afbeeldingen die door de twee methoden worden geproduceerd. Deze methoden zijn nuttig voor routinematige fluorescentie of confocale beeldvorming van maïsbladeren, maar ze kunnen ook worden aangepast voor andere modelgrassoorten, zoals rijst, Setaria en Brachypodium.

figure-introduction-1
Figuur 1: Organisatie en morfologie van maïsblad primordia en overzicht van de methoden . (A) Schematische weergave van een maïszaailing. Maïs heeft een distichous phyllotaxy, waarbij het nieuwe blad op de tegenovergestelde positie van het vorige blad begint. Het bladnummer geeft de chronologische volgorde aan waarin de bladeren uit de kieming zijn voortgekomen (d.w.z. eerste blad, L1; tweede blad, L2; derde blad, L3; enz.). Elk blad heeft een distale blade en een basale schede afgebakend door een kraag die overeenkomt met de ligule en de oorschelp. Het bovenste blad met de kraag zichtbaar duidt op het vegetatieve stadium. De zaailing in dit voorbeeld bevindt zich in het V2-stadium, waarbij de L2-kraag (pijlpunt) zichtbaar is. Het schaarpictogram geeft de locatie aan bij de mesocotyl (me) waar de zaailing moet worden geknipt om te worden verzameld. (B) Schematische weergave van de ontleedde scheut met geïsoleerde L1 tot L4, met de bladprimordia L5 tot L9 weergegeven als een vergrote afbeelding in (C). Het plastochrongetal geeft de positie van het primordium ten opzichte van de SAM aan, waarbij het jongste blad primordium (P1) het dichtst bij de SAM ligt en het oudere blad primordia (P2, P3, P4, enzovoort) achtereenvolgens verder weg2. (D) Schematische weergave van de morfologie van primordia van maïsbladeren van P1 tot en met P5. (E) Schematisch overzicht van de methode voor de dwarsdoorsnedeanalyse van de primordia van maïsblad. (1) Knip de oudere bladeren af met een draadstripper. (2) Meet het primordium en snijd de scheut. (3) Monteer de sectie op een dia voor beeldvorming en verwerking (4, 5). F) Schematisch overzicht van de methode voor de analyse van het maïsblad primordia. (1) Verwijder de omliggende bladeren om het primordium te extraheren. (2) Knip en rol het primordium plat op de nanotape. (3) Monteer het monster voor beeldvorming en verwerking (4, 5). Afkortingen: L = blad; bl = blad; sh = schede; co = kraag; me = mesocotyl; V = vegetatief; P = plastochron; SAM = schiet apicale meristeem. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Fasering van de ontwikkeling van maïsbladeren en ontwerp van het experiment

  1. Het kweken van de planten en het ensceneren van bladontwikkeling
    1. Bepaal de leeftijd en het ontwikkelingsstadium van de planten die voor het experiment moeten worden gebruikt en voer een gedetailleerde stadiëring van de bladontwikkeling uit.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de stadiëring uit te voeren op planten met dezelfde genetische achtergrond als de gemuteerde of transgene lijnen die in de experimenten zullen worden gebruikt. De SAM stopt met het produceren van nieuwe bladeren tussen 20 en 25 DAG, afhankelijk van de genetische achtergrond en groeiomstandigheden. Om deze reden zijn de hier beschreven methoden ideaal voor maïszaailingen van 7-14 DAG.
    2. Kweek de maïsplanten in een kas of groeikamer volgens een geschikt plantverzorgingsprotocol35.
    3. Verzamel de planten op de gewenste leeftijd of V-fase met een klein mes of schaar door te knippen bij de mesocotyl, de stengel onder het grondoppervlak (figuur 1A). Steek het snijgereedschap voorzichtig in de grond naast de zaailing en schuif het in een hoek van 45° naar de basis om de mesocotyl te snijden.
    4. Til de zaailing uit de grond en stof alle resterende vuil of bodemdeeltjes weg die zich aan de plant kunnen hechten. Verwijder de coleoptile, de beschermende schede die de opkomende scheut in jonge zaailingen bedekt, met de hand.
    5. Noteer voor elke plant het V-stadium, het aantal bladeren en de lengte van het laatste blad dat uit de krans komt. Maak foto's van de planten voor toekomstig gebruik.
    6. Verwijder de oudere bladeren één voor één. Om dit te doen, houdt u de plant bij de overblijfselen van de mesocotyl of stengel en snijdt u elk blad uit de basis van de schede en ontvouwt u de schede voorzichtig op een cirkelende manier met een tandheelkundige sonde (figuur 1B).
      OPMERKING: Zie stap 2.1 voor een snelle methode voor het verwijderen van de omliggende bladeren.
    7. Ontleed onder een stereomicroscoop bij ongeveer 2x vergroting voorzichtig de rest van de scheuttop op vochtige doekjes om te voorkomen dat het monster uitdroogt. Snijd en ontvouw voorzichtig elk blad primordium met een tandheelkundige sonde met een gebogen naald of een paar fijne tangen totdat de SAM, P1 en P2 zichtbaar zijn (figuur 1D). Noteer het uiterlijk en de meting van elk plastochron.
      OPMERKING: Zie een voorbeeld van bladontwikkelingsstadiëring in maïszaailingen in Aanvullend Dossier 1.
  2. Het experiment plannen
    OPMERKING: Het zorgvuldig plannen van het experiment kan de efficiëntie verbeteren. Bij transversale sectieanalyse kan het bepalen van de geschatte locatie om te snijden bij het in beeld brengen van specifieke plastochronen of regio's bijvoorbeeld de dissectietijd verkorten. Figuur 2 toont een voorbeeld van gestandaardiseerde bemonstering. Bovendien kan het optimaliseren van de beeldvormingsparameters op basis van de eigenschappen van de FP's of fluorescerende sondes de efficiëntie van de experimenten verbeteren.
    1. Gebruik de stadiëringsinformatie als een gids om het experiment te richten op specifieke plastochronen, primordiumregio's en weefsels. Gebruik de FP's of andere fluorescerende sondes van belang om secties 2 en / of 3 hieronder op een paar monsters te volgen.
      OPMERKING: Zie de beschikbare maïs FP-markeringslijn 36-42 zaadvoorraden op https://www.maizegdb.org/data_center/stock.
    2. Bepaal de optimale beeldacquisitieparameters voor elke FP-reporter of sonde, inclusief de juiste detector of filter, excitatie- en emissiegolflengten, pinhole-grootte en andere instellingen. Sla de instellingen op om de werkomstandigheden voor elk van de experimenten te reproduceren.
      OPMERKING: Zie Linh en Scarpella30 voor enkele technische richtlijnen voor confocale laserscanmicroscopie van zich ontwikkelende bladeren.
    3. Plan de beeldtijd op basis van de halfwaardetijd en andere eigenschappen van de FP-reporter43.
      OPMERKING: De tijd tussen dissectie en beeldvorming moet ook worden overwogen bij het plannen van een experiment, omdat verse plantenmonsters tijdens deze periode worden onderworpen aan uitdroging en cellulaire veranderingen.

figure-protocol-1
Figuur 2: Bemonsteringsschema voor de analyse van dwarsdoorsneden van primordia van maïsbladeren. (A, links) Proximale scheut van een 7 DAG maïszaailing, met een blootgesteld vierde blad (L4) op P7. De gebroken lijnen geven de zeven bemonsteringspunten langs het primordium aan, van 0,5 mm tot 10 mm. (A, rechts) Schematische weergave van de bladprimordia, met de geprojecteerde grootte en positie van elke plastochron: P7 (wit); P6 (magenta); P5 (blauw); P4 (groen); en P3 tot de SAM (geel). (B-H) Fluorescentiebeelden van dwarsdoorsneden die de in A aangegeven bemonsteringspunten van 10 mm (B) tot 0,5 mm (H) weergeven. De primordia zijn pseudogekleurd volgens het plastochron kleurenschema in (A). De secties werden in beeld gebracht met een epifluorescentiemicroscoop met behulp van een longpass-emissie UV-filter voor autofluorescentie. Schaalbalk = 200 μm (B-H). Deze figuur is aangepast en gereproduceerd met toestemming van Robil en McSteen24. Afkortingen: DAG = dagen na ontkieming; P = plastochron; SAM = schiet apicale meristeem; † = bladschede of eigenlijke voorligule; * = schiet apicale meristeem; ** = stengel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Beeldvorming van dwarsdoorsneden van primordia van maïsbladeren

  1. Het strippen van oudere omringende bladeren en het meten van het blad primordium
    1. Verzamel de zaailing door deze voorzichtig bij het mesocotyl onder het grondoppervlak te knippen met een klein mes of een schaar, zoals beschreven in de stappen 1.1.3-1.1.4 (figuur 1A).
    2. Bepaal de juiste maat van het te gebruiken draadstrippergat en waar de snede langs de scheut zal worden gemaakt. Zorg ervoor dat het gat groot genoeg is om in het doelprimordium te passen.
    3. Begin met snijden in het meer distale deel van de scheut en werk geleidelijk naar de basis toe totdat de punt van het primordium bloot komt te liggen.
    4. Om de snede te maken, houdt u de draadstripper vast met de kaken naar de scheut gericht. Plaats de scheut in het geselecteerde gat en knijp de strippergrepen samen om door de bladkrans te snijden.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat u per ongeluk het doel primordium snijdt, lijnt u het midden van de scheut voorzichtig uit met het gat in de draadstripper. Voor grotere planten wordt aanbevolen om handmatig enkele van de omliggende bladeren met de hand te verwijderen voordat u de stripper gebruikt.
      LET OP: Draadstrippers hebben scherpe kaken die snijwonden of andere verwondingen kunnen veroorzaken als ze niet zorgvuldig worden gebruikt.
    5. Terwijl u de handgrepen samen blijft knijpen, schuift u de stripper weg van de scheut om het bovenste deel van de bladeren bij te snijden. Zorg ervoor dat het doelgebied in het primordium omhuld blijft door de omringende bladeren (aanvullende figuur S1C,D).
      OPMERKING: Na het trimmen van de bovenste bladeren, blijft de scheut achter met een blootgestelde primordiumpunt (P5, P6 of P7, afhankelijk van de positie van de snede en de grootte van het gebruikte draadstrippergat; Figuur 1E). Dit primordium zal dienen als referentie voor het schatten van de grootte en het stadium van jongere primordia. P6 is de meest praktische referentie om te gebruiken in maïszaailingen vanwege het groottebereik en de pinachtige morfologie.
    6. Gebruik een liniaal om de lengte te meten van de punt van het primordium tot de basis van de scheut. Noteer de meting.
      OPMERKING: De lengte van het primordium zal enigszins worden overschat omdat er een paar millimeter stengel aan de basis van de primordia zit (figuur 2A).
  2. Sectie uit de vrije hand en beeldvorming van het blad primordium
    1. Houd onder een stereomicroscoop met een vergroting van ongeveer 0,8x de scheut stabiel op een glad oppervlak, zoals een glazen snijplank of ander krasbestendig materiaal. Gebruik een scheermesje of scalpel om dunne delen (0,25-0,8 mm) van de scheut op de gewenste punten langs de lengte van het primordium te snijden.
    2. Maak een eerste snede iets boven het doelgebied om het distale deel van de scheut weg te gooien en verkrijg vervolgens dunne secties rond het doelgebied. Om schone sneden te maken, houdt u het mes loodrecht op de scheut en schuift u het met een vloeiende, gelijkmatige beweging naar binnen.
      OPMERKING: Er kan een paar millimeter sectieruimte zijn voor grotere primordia (P6 of P7). Voor kleinere primordia (P5 en eerder) kan 1 mm echter een aanzienlijk verschil maken in de bemonstering, omdat deze primordia binnen de eerste paar millimeter van de basis van de scheut worden opgestapeld (zie figuur 2A, F-H). Het wordt aanbevolen om een tweesnijdend scheermesje te gebruiken voor fijnere secties.
      LET OP: Wees voorzichtig bij het gebruik van scheermesjes en scalpels om onbedoelde snijwonden of verwondingen te voorkomen.
    3. Vervang het scheermesje regelmatig, omdat de bladmantels het mesje gemakkelijk dof kunnen maken. Bedek de scheut met vochtige doekjes na elke sectieronde om te voorkomen dat het monster uitdroogt.
    4. Monteer het bladgedeelte op een schone glasplaat (75 mm x 25 mm), gebruik een pipet om een druppel water (of 50% glycerol) rechtstreeks op de sectie aan te brengen en plaats een afdekplaat (22 mm x 22 mm) bovenop.
    5. Als u een fluorescerende kleurstof gebruikt, breng dan de kleurstofoplossing aan op de sectie, plaats er een afdekplaat op en incuber deze indien nodig.
      OPMERKING: Afhankelijk van het type kleurstof kunnen aanvullende stappen voor het verwerken van de bladsecties nodig zijn voordat u doorgaat naar de volgende stap. Deze referenties44,45,46,47 geven algemene details en toepassingen van fluorescerende kleurstoffen in beeldvorming van plantencellen. Een kernkleuring fluorescerende kleurstof, 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU), is effectief gebruikt op dwarsdoorsneden van maïsblad primordia48. Plasmamembraankleurstoffen, zoals Fei Mao 4-64 (FM 4-64) en propidiumjodide, leveren daarentegen geen bevredigende resultaten op (figuur 3A-D).
    6. Plaats de dia op het podium van een epifluorescentie of confocale laserscanmicroscoop en pas de focus en instellingen indien nodig aan om de fluorofoor30 te visualiseren. Zie tabel 1 voor de instellingen voor verlichting en beeldacquisitie die worden gebruikt voor geselecteerde maïs FP-reporterlijnen.
      OPMERKING: Dikke secties kunnen hoge niveaus van achtergrondautofluorescentie produceren. Overweeg enkele beeldvormings- en monstervoorbereidingsstrategieën die kunnen helpen dit probleem te verminderen30,49 (zie tabel 2).
      LET OP: Wees voorzichtig en draag een beschermende bril bij het werken met krachtige lichtbronnen en lasers om het risico op oogbeschadiging te verminderen.
    7. Beeld door het bladgedeelte met verschillende vergrotingen en detectiekanalen (inclusief de heldere veldverlichting)30. Gebruik 4x vergroting om de volledige dwarsdoorsnede in beeld te brengen en 20x of 40x vergroting om specifieke weefsels in beeld te brengen. Verkort de belichtingstijd bij hogere vergrotingen voor epifluorescentiebeeldvorming om de monsters te beschermen tegen snelle fotobleking (zie tabel 1).
    8. Leg afbeeldingen vast van de hele sectie of specifieke interessegebieden (ROI's). Verkrijg indien nodig een z-stack, een reeks afbeeldingen die zijn vastgelegd op verschillende brandpuntsdiepten30.
    9. Om een z-stack te verkrijgen, bepaalt u eerst de bovenste en onderste posities in het monster en vervolgens het aantal optische secties dat tussen deze posities moet worden vastgelegd. Minder optische secties resulteren in een grotere z-stapgrootte, wat de afstand tussen elke sectie is. Afhankelijk van de eigenschappen van de FP en de gebruikte vergroting, legt u drie tot 25 optische secties vast met z-stapgroottes tussen 1 en 12 μm voor het afbeelden van dwarsdoorsneden van maïsbladprimordia.
      OPMERKING: Om de z-stack af te vlakken, gebruikt u een geschikte volumeweergavetechniek50 die kan worden bereikt via de microscoopsoftware of met behulp van ImageJ/FIJI34 (zie stappen 4.1 en 4.2).
    10. Sla alle afbeeldingsbestanden en de bijbehorende metagegevens op, indien beschikbaar.

Tabel 1: Verlichtings- en beeldacquisitie-instellingen die worden gebruikt voor fluorescentie en confocale beeldvorming van geselecteerde maïs FP-verslaggevers. Afkortingen: FP = fluorescerend eiwit; TRITC = tetramethylrhodamine; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; WLL = witlichtlaser; Ar-ion = argon ion laser; HyD = hybride detector; AU = Luchtige eenheid; Hz = Hertz, scanlijn per seconde. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Beeldvorming van uitgerolde hele bergen van maïsblad primordia

  1. Het ontleden van de primordia en het voorbereiden van de glasplaat met nanotape
    1. Verzamel de zaailing door deze voorzichtig af te snijden bij het mesocotyl onder het grondoppervlak met een klein mes of een schaar, zoals beschreven in de stappen 1.1.3-1.1.4 (figuur 1A).
    2. Bereid de glasplaat (75 mm x 25 mm) voor met de heldere, dubbelzijdige nanotape (aanvullende figuur S1H) voordat u de plant ontleedt. Knip een rechthoekig stuk nanotape en plak het in het midden van een schone glazen dia. Verwijder de beschermende plastic folie aan de bovenzijde van de tape niet.
      OPMERKING: Bepaal de grootte van de te gebruiken tape op basis van de grootte van de te gebruiken monsters (zie voorbeelden van te grote monsters in aanvullende figuur S1I,J). De nanotape is verkrijgbaar in acryl- of polyurethaangelmateriaal. Beide typen zijn effectief voor fluorescentie en confocale beeldvorming24. Om verkleuring van de tape te voorkomen, beschermt u deze tegen langdurige blootstelling aan licht door deze in een donkere container te bewaren.
    3. Begin met het ontleden van de scheut door het bovenste deel van de oudere bladeren te verwijderen met een draadstripper, zoals beschreven in stap 2.1.
    4. Houd de scheut bij de mesocotyl en verwijder voorzichtig de omliggende bladeren met een tandensonde om de primordia te extraheren. Om dit te doen, verwijdert u de bladeren van de basis van de scheut en ontvouwt u ze één voor één totdat het primordium van belang wordt blootgesteld.
    5. U kunt ook de draadstripper gebruiken om de bladprimordia direct te extraheren door een snede te maken in het basale gebied van de scheut (aanvullende figuur S1E-G).
      OPMERKING: Deze methode brengt een hoger risico met zich mee om de primordia te breken.
  2. Montage en beeldvorming van het primordium.
    1. Verwijder de beschermfolie van de tape. Leg het blootgestelde primordium op de tape. Gebruik een scheermesje om het primordium aan de basis te snijden en gooi de basale stengel en het hypocotyl weg (figuur 1F).
    2. Rol het primordium uit met behulp van een tandheelkundige sonde met een gebogen naald (puntdiameter van 0,25-0,6 mm). Gebruik een microprobe (tipdiameter van 0,15-0,2 mm) voor primordia kleiner dan 3 mm (P3 tot vroege P4).
    3. Plaats de punt van de naald evenwijdig aan het oppervlak en ontvouw de buitenste basale rand en druk deze voorzichtig tegen de tape.
    4. Voor een soepeler uitrollen smeer u het binnenoppervlak (adaxiaal) van het blad door de punt van de naald in 100% glycerol te dopen.
    5. Terwijl de buitenste rand aan de tape kleeft, lijnt u de naaldpunt evenwijdig aan de lange as van het blad uit. Schuif de naald voorzichtig zijwaarts om het blad los te rollen en plat te maken op de tape (figuur 1F).
      OPMERKING: Het breken of beschadigen van het blad tijdens het uitrollen komt vaak voor, vooral bij grotere primordia met een robuuste middenrib (zie figuur 3E-G). Het krachtig uitrollen van het blad kan het oppervlak kneuzen en artefacten produceren tijdens het maken van afbeeldingen (figuur 3H). Zie tabel 2 en de bespreking voor aanbevolen oplossingen voor deze problemen.
    6. Breng een druppel water aan op het uitgerolde primordium. Plaats onmiddellijk een coverslip bovenop de waterdruppel en het primordium. Druk de randen van de coverslip voorzichtig naar beneden zodat ze aan de tape hechten.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om grote rechthoekige afdekplaten (50 mm x 24 mm of 60 mm x 24 mm) te gebruiken met extra gebieden voor hechting aan de tape. Minimaliseer de vorming van luchtbellen, die het blad kunnen vervormen en ongelijke lichtbreking kunnen veroorzaken (zie figuur 3I-K). Zorg ervoor dat de coverslip volledig aan de tape hecht, omdat de marges van het gemonteerde primordium terug kunnen rollen onder een losjes aangehechte coverslip (zie figuur 3L).
    7. Plaats de dia op het podium van een epifluorescentie (zie aanvullende figuur S1K) of confocale laserscanmicroscoop en pas de focus en instellingen indien nodig aan om de fluorofoor30 te visualiseren. Zie tabel 1 voor de verlichtings- en beeldacquisitie-instellingen die worden gebruikt voor de geselecteerde maïs FP-reporterlijnen.
    8. Beeld het hele blad of een specifieke ROI in beeld via verschillende detectiekanalen30. Om het hele blad in beeld te brengen, legt u handmatig mozaïekafbeeldingen van het blad vast of gebruikt u de tegelbewerking van de microscoop bij lage vergroting (4x of 10x).
      OPMERKING: Zelfs bij de laagste vergroting kan primordia van maïsbladeren te groot zijn om in beeld te brengen met een epifluorescentie- of confocale laserscanmicroscoop, wat resulteert in langere beeldvormingstijden die kunnen resulteren in fotobleaching (zie figuur 3M) of verhoogde achtergrondautofluorescentie. Daarom wordt aanbevolen om een fluorescentiestereomicroscoop te gebruiken voor het afbeelden van monsters van hele bladeren groter dan 5 mm.
    9. Voor confocale beeldvorming is het verkrijgen van z-stacks nodig die de dikte van het blad omvatten (zie stap 2.2.9).
    10. Sla alle afbeeldingsbestanden en de bijbehorende metagegevens op, indien beschikbaar.

Tabel 2: Oplossen van veelvoorkomende problemen bij het in beeld brengen van dwarsdoorsneden en hele bergen van maïsbladprimordia. Klik hier om deze tabel te downloaden.

figure-protocol-2
Figuur 3: Suboptimale dwarsdoorsnede en gehele montagebereiding van maïsbladprimordia. (A-D) Representatieve confocale beelden van dwarsdoorsneden van bladprimordia met een plasmamembraanmarker, PIP2-1-CFP (A), en een plasmamembraanbindende fluorescerende kleurstof, FM 4-64 (B), met overeenkomstige heldere veldbeelden (C,D). In vergelijking met PIP2-1-CFP geeft FM 4-64 een suboptimale visualisatie van celcontouren weer. (E-M) Representatieve fluorescentiebeelden van hele bergen bladprimordia die de aanwezigheid van scheuren (E-G), gekneusde oppervlakken† (H), luchtbellen* (I-K), teruggedraaide marges (L) en gebleekte gebieden (M) laten zien. De bladprimordia drukken DII-Venus (E-G), GAR2-YFP (H-J), mDII-Venus (K), PIN1a-YFP (L) en DR5-RFP (M) uit. Schaalbalk = 200 μm (A-D); 500 μm (E-M). Figuur 3A is aangepast en gereproduceerd met toestemming van Robil en McSteen24, terwijl Figuur 5B-M ongepubliceerde gegevens van de auteurs zijn. Afkortingen: P = plastochron; YFP = geel fluorescerend eiwit; RFP = rood fluorescerend eiwit; GVB = cyaan fluorescerend eiwit; PIP2-1-CFP = p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP; DII-Venus = pZmUbi:DII:YFP-NLS; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; BF = helder-veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. De afbeeldingen verwerken met ImageJ/FIJI

  1. Z-stacks afvlakken met behulp van maximale intensiteitsprojectie (MIP)
    1. Start ImageJ/FIJI en open de stapel afbeeldingen, of maak een nieuwe stapel van meerdere afzonderlijke afbeeldingen door Afbeelding | Stapels | Afbeeldingen om te stapelen vanuit het menu.
    2. Selecteer de afbeeldingsstapel. Selecteer in het menu Afbeelding | Stapels | Z-Project.... Kies in het dialoogvenster Z-Project de optie Maximale intensiteit in het vervolgkeuzemenu Projectietype. Klik op OK om de maximale intensiteit z-projectie te maken.
      OPMERKING: De afgevlakte afbeelding is een 2D-projectie van de pixels met de hoogste intensiteit over de z-stacks50. Deze methode is geschikt voor het visualiseren van de fluorofoor, maar niet voor de anatomische kenmerken in heldere veldbeelden van dikke dwarsdoorsneden en hele bladbevestigingen.
    3. Sla de afbeelding op als TIFF (Tagged Image File Format) door Bestand | Opslaan als | Tiff. Voer een naam in voor het bestand en klik op Opslaan.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om TIFF te gebruiken voor het opslaan van fluorescentie- en confocale afbeeldingen, omdat de kwaliteit en details behouden blijven wanneer de afbeelding wordt opgeslagen.
  2. Z-stacks afvlakken met de Extended Depth of Field (EDF) plugin51
    1. Installeer de EDF plugin52. Download het Extended_Depth_Field.jar bestand (versie 17.05.2021) van http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ en plaats het in de map "plugins" van ImageJ/FIJI.
    2. Start ImageJ/FIJI en open de stapel afbeeldingen, of maak een nieuwe stapel van meerdere afzonderlijke afbeeldingen door Afbeelding | Stapels | Afbeeldingen om te stapelen vanuit het menu.
    3. Selecteer de afbeeldingsstapel. Selecteer in het menu Plug-ins | Uitgebreide scherptediepte | EDF Easy Mode. Gebruik in het dialoogvenster Uitgebreide scherptediepte de schuifregelaars onder Snelheid/ kwaliteit om de gewenste kwaliteit en verwerkingssnelheid in te stellen en de reg Hoogtekaart om het niveau van vloeiendheid voor de topografie in te stellen. Klik op Uitvoeren om de gereconstrueerde afbeelding te maken.
      OPMERKING: EDF combineert de stapel tot een scherp, samengesteld 2D-beeld door de beste focus51 te projecteren. Deze techniek is nuttig voor het overwinnen van de beperkte scherptediepte en is geschikt voor het reconstrueren van heldere veldbeelden van dikke dwarsdoorsneden of hele bladbevestigingen. Wees voorzichtig bij het toepassen van dit filter om de fluorofoor te visualiseren, omdat EDF, in tegenstelling tot MIP, het contrast van de afbeelding aanpast, waardoor de pixelintensiteit wordt beïnvloed.
    4. Sla de afbeelding op als tiff-bestand door Bestand | Opslaan als | Tiff. Voer een naam in voor het bestand en klik op Opslaan.
  3. Afbeeldingen aan elkaar naaien met behulp van de Grid/Collection Stitching plugin53
    1. Sla de verzameling afbeeldingen of afbeeldingsstapels op die in één map moeten worden samengevoegd.
    2. Start ImageJ/FIJI en selecteer Plugins | Stitching Raster/Collectie Stitching uit het menu. Kies in het dialoogvenster Raster/verzameling naaien de optie Onbekende positie in het vervolgkeuzemenu Type en vervolgens Alle bestanden in map in de volgorde. Klik op OK.
    3. Geef in het dialoogvenster Raster stiksels: onbekende positie, Alle bestanden in map, de locatie van de afbeeldingen op door het mappad in het tekstveld Map te typen of te plakken of door op Bladeren... te klikken om de map te zoeken. Klik op OK om het naaiproces te starten.
      OPMERKING: De optie Onbekende positie in de plug-in Grid/Collection Stitching reconstrueert een samengestelde afbeelding uit een reeks aaneengesloten afbeeldingen door hun overlappende gebieden te analyseren. Daarom is deze optie handig voor het naaien van mozaïeken van afbeeldingen van dwarsdoorsneden of bevestigingen van hele bladeren die niet zijn verkregen met behulp van een tegelscanbewerking.
    4. Wanneer het stiksel klaar is, verschijnt er een nieuw venster met de gestikte afbeelding. Sla de afbeelding op als tiff-bestand door Bestand | Opslaan als | Tiff. Voer een naam in voor het bestand en klik op Opslaan.
      OPMERKING: Het naaien van grote montages van 2D- en 3D-afbeeldingen kan ook worden bereikt met behulp van beeldreconstructieopdrachten in de microscoopsoftware of via de Bio-Formats Import Options in ImageJ / FIJI.
  4. Meerdere kanalen combineren met de opdracht Kanalen samenvoegen
    1. Start ImageJ/FIJI en open de afbeeldingen of afbeeldingsstapels die u wilt samenvoegen.
      OPMERKING: Afbeeldingsstapels kunnen eerst worden afgevlakt met behulp van stap 4.1 of 4.2. MIP wordt over het algemeen aanbevolen voor het afvlakken van fluorofoorkanalen, terwijl EDF beter geschikt is voor het afvlakken van kanalen met een helder veld of andere kanalen met verschillende scherptediepte.
    2. De helderheid en het contrast van de afbeeldingen aanpassen met Afbeelding | Aanpassen | Helderheid/contrast. Gebruik de schuifregelaars of invoervelden om de parameters aan te passen en klik vervolgens op Toepassen. U kunt ook een lineaire histogram-rekmethode gebruiken door Proces | Verbeter het contrast.... Stel het percentage verzadigde pixels in, selecteer Normaliseren en klik op OK.
      OPMERKING: Bij het kwantificeren of vergelijken van de signaalintensiteit van fluorofoor tussen afbeeldingen, is het over het algemeen het beste om de helderheid of het contrast niet aan te passen, omdat dit de relatieve pixelintensiteiten in het beeld kan veranderen, wat de metingen en vergelijkingen kan beïnvloeden.
    3. Als u onderscheid wilt maken tussen kanalen, past u pseudokleuren toe op specifieke afbeeldingen met behulp van een opzoektabel (LUT). Selecteer hiervoor de afbeelding en selecteer vervolgens in het menu ImageJ/FIJI de optie Afbeelding, klik op Opzoektabellen en kies de juiste LUT in de vervolgkeuzelijst.
    4. Selecteer in het menu Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen. Gebruik voor elk kanaal (C1, C2, C3...) de vervolgkeuzelijst om de afbeelding te selecteren die aan dat kanaal moet worden toegewezen. Klik op OK om de kanalen samen te voegen.
    5. Sla de nieuwe afbeelding op als TIFF door Bestand | Opslaan als | Tiff. Voer een naam in voor het bestand en klik op Opslaan.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwarsdoorsnedeanalyse van primordia van maïsbladeren
We gebruikten protocolsectie 2 om het aderaantal te kwantificeren en hormoonresponspatronen in dwarsdoorsneden van maïsblad primordia te karakteriseren met FP's (figuur 4)24. Om de rol van het plantenhormoon auxine in bladgroei en adervorming te beoordelen, kwantificeerden we het aantal nerven in de bladprimordia van een auxine-deficiënte maïsmutant, verdwijnende kwast254. In vroege plastochronen vertonen zich ontwikkelende aders een duidelijke cellularisatie in de mediane cellaag van het maïsblad primordium21,22. Het identificeren en tellen van aderen met behulp van conventionele histologische technieken22 kan echter arbeidsintensief en tijdrovend zijn. Om de aderen te kwantificeren, gebruikten we dus de maïs auxine efflux eiwitmarker p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP hierna), die zich ontwikkelende aderen en procambiale strengen (PCS'en; Figuur 4A). Met behulp van protocolsectie 2 konden we de transversale sectiebemonstering standaardiseren door de primordia voorafgaand aan de sectie te meten (figuur 4B, C). We ontdekten een trend waarbij vt2 een breder primordium en meer nerven heeft dan normaal (figuur 4D,E)24, wat consistent is met gegevens van volledig geëxpandeerde bladeren55, wat aangeeft dat het defect in vt2 vroeg in de bladontwikkeling begon. Met behulp van protocolsectie 2 konden we ook systematisch de expressiepatronen van hormoonrespons FP-reporters in de bladprimordia onderzoeken (zie voorbeelden van de afbeeldingen in figuur 4F-I). Door middel van een gestandaardiseerd transversaal bemonsteringsschema brachten we de verdeling van auxine-, cytokinine- (CK) en gibberellinezuur (GA) -responsen in kaart over verschillende plastochronen en regio's van bladprimordia, en ontdekten we nieuwe responspatronen waarvan we veronderstellen dat ze implicaties hebben voor bladgroei en adervorming24. Daarom tonen deze representatieve resultaten het nut aan van protocolsectie 2 voor transversale sectieanalyse van maïsbladprimordia.

figure-results-1
Figuur 4: Representatieve resultaten voor transversale analyse van maïsbladprimordia. (A-E) Kwantificering van het aantal aders en de primordiumbreedte in bladprimordia van normale en verdwijnende kwast2 met de auxine-effluxeiwitmarker PIN1a-YFP. (A) Representatieve fluorescentiebeelden van dwarsdoorsneden van P5 tot P7 die PIN1a-YFP tot expressie brengen in zich ontwikkelende aderen en procambiale strengen. De dwarsdoorsneden werden in beeld gebracht met een epifluorescentiemicroscoop met behulp van een FITC-filter (495-519 nm excitatie). Het aantal aders en de primordiumbreedte werden gekwantificeerd met behulp van de meerpunts- en vrijehandslijngereedschappen in respectievelijk FIJI / ImageJ. (B) Een maïszaailing waarvan de bovenste bladkransen met een draadstripper worden verwijderd om de punt van het vierde blad (L4) bloot te leggen. De beugel overspant de geprojecteerde primordiumlengte, waarbij de stippellijn de middelste lengte aangeeft. (C) Schematisch diagram van verschillende primordiumvormen van P5 tot P7, dat illustreert hoe het adergetal en de primordiumbreedte op de middelste lengte (horizontale stippellijn) kunnen variëren afhankelijk van het ontwikkelingsstadium van het primordium. (D,E) Meting van primordiumbreedte (D) en adergetal (E) in het middenlengtegedeelte van de L4 van normaal en vt2. De trendlijn vertegenwoordigt 10 mm voortschrijdende gemiddelden van metingen ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). (F-I) Representatieve confocale beelden van dwarsdoorsneden van blad primordia die combinaties van PIN1a-YFP, auxine response reporter, DR5-RFP, cytokinin response reporter, TCS-Tomato, gibberellinezuur-responsieve marker, GAR2-YFP en mDII-Venus, een gemuteerde versie van de auxine signaling input reporter DII-Venus. De FP-kanalen worden in elke afbeelding over het helderveldkanaal geplaatst. Schaalbalk = 200 μm (A); 10 mm (B); 100 μm (F-I). Deze figuur is aangepast en gereproduceerd met toestemming van Robil en McSteen24. Afkortingen: DAG = dagen na ontkieming; P = plastochron; vt2 = verdwijnende kwast2; PCS = procambiale streng; YFP = geel fluorescerend eiwit; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; RFP = rood fluorescerend eiwit; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomaat = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Analyse van de primordia van maïsbladeren
We volgden protocolsectie 3 om FP-expressie te visualiseren en te analyseren in hele bladbevestigingen van primordia van maïsbladeren (figuur 5). Door aderpatronen te visualiseren met PIN1a-YFP, ontdekten we dat de vorming van aderen optreedt in het hele primordium tijdens vroege plastochrons, maar dit proces wordt beperkt in de proximale regio's later in de ontwikkeling (figuur 5A)24. In aanvulling op de transversale sectieanalyses hebben de analyses van de hele bladmontage weefsel- en stadiumspecifieke patronen van hormoonrespons tijdens adervorming aan het licht gebracht24. Een voorbeeld is het expressiepatroon van de CK-responsreporter TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), ten opzichte van de PIN1a-YFP-expressie (Figuur 5B)24. Door protocolsectie 3 te volgen, konden we zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyses van FP-expressie in de bladprimordia uitvoeren (figuur 5D-F; ongepubliceerde gegevens). We onderzochten de expressiepatronen van een auxineresponsreporter, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), en een GA-responsieve marker, p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), in hele-bladbevestigingen van enkele en dubbele mutanten van vt2 en dwergplant3 (d3), een GA-deficiënte mutant56 (Figuur 5D). We vergeleken ook de relatieve niveaus van celproliferatie tussen normale en vt2-bladprimordiamet behulp van p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP 42 (Cyclin-D2B-YFP), wat een marker is voor de G1/S-overgang in de celcyclus 57 (figuur 5E,F). Hoewel er geen significant verschil was tussen normaal en vt2, was cycline-D2B-YFP-expressie consistent met het bekende celproliferatieprofiel van vroege plastochronen31. We concluderen dat protocolsectie 3 een effectieve methode is voor het analyseren van hele bergen van maïsbladprimordia, die moeilijk in beeld te brengen zijn vanwege hun gerolde morfologie.

figure-results-2
Figuur 5: Representatieve resultaten voor de analyse van maïsbladprimordia. (A) Representatieve fluorescentiebeelden van bladprimordia van 7 DAG-maïszaailingen die zich ontwikkelende aders en procambiale strengen laten zien, zoals gemarkeerd door de auxine-effluxeiwitmarker PIN1a-YFP. P3-P6 primordia werden uit de basis weggesneden, uitgerold en afgeplat met de adaxiale kant naar boven. Inzetstukken tonen close-ups van P3 en P4. In P5 en P6 bakenen stippellijnen het distale uiteinde van de proliferatieve zones af, waar de meeste procambiale strengen zich nog steeds ontwikkelen en uitbreiden. (B,C) Representatieve confocale beelden die de expressie van PIN1a-YFP en cytokinine response reporter, TCS-Tomato, in het proximale marginale gebied van een P5 primordium tonen. (D) Representatieve fluorescentiebeelden van P4 primordia met de expressie van auxineresponsreporter, DR5-RFP en gibberellinezuur-responsieve marker, GAR2-YFP in normale en enkele en dubbele mutanten van verdwijnende kwast2 en dwergplant3. (E) Representatieve confocale beelden van P3 en/of P4 die de expressie tonen van Cyclin-D2B-YFP, een reporter voor de G1/S-overgang in de celcyclus. (F) Relatieve hoeveelheden celproliferatie in P3/P4-blad primordia van normaal en vt2, gekwantificeerd door de geïntegreerde dichtheid van het Cyclin-D2B-YFP-signaal over het gebied van het primordium te meten met behulp van ImageJ/FIJI. De staven vertegenwoordigen de gemiddelde metingen ± standaardfout van het gemiddelde. Schaalbalk = 500 μm (A,D,E); 200 μm (B); 100 μm (C). Figuur 4A-C is aangepast en gereproduceerd met toestemming van Robil en McSteen24, terwijl Figuur 4D-F ongepubliceerde gegevens van de auteurs is. Afkortingen: DAG = dagen na ontkieming; P = plastochron; vt2 = verdwijnende kwast2; d3 = dwergplant3; YFP = geel fluorescerend eiwit; RFP = rood fluorescerend eiwit; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomaat = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP; ns = geen significant verschil; au = willekeurige eenheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend dossier 1: Voorbeelden van bladontwikkelingsstadiëring in maïszaailingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Plantenmonsters en materialen die in de protocollen worden gebruikt. (A,B) Een maïszaailing 7-8 DAG met de bovenste bladkrans verwijderd met behulp van een draadstripper. (B) De inzet toont een close-up van de opname met het blootgestelde P6-primordium. (C-G) Scheuten van maïszaailingen waarvan de bovenste kransen zijn verwijderd voor analyse van de dwarsdoorsnede (C,D) en de omliggende bladeren volledig zijn verwijderd voor analyse van de gehele montage (E-G). (H) Een rol polyurethaangel heldere dubbelzijdige nanotape. (I,J) P6-blad primordium (I) en proximaal gebied van P8-blad (J) uitgerold en gemonteerd op glasglaasjes met de nanotape. (K) Een glasplaat met een uitgerold blad primordium gemonteerd op het stadium van een epifluorescentiemicroscoop. Afkorting: DAG = dagen na ontkieming. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren twee methoden voor het bereiden van maïsblad primordia voor cellulaire beeldvorming. De eerste methode (protocolsectie 2) maakt het mogelijk het primordium te meten voor transversale sectieanalyse, terwijl de tweede methode (protocolsectie 3) het uitrollen en afvlakken van het primordium mogelijk maakt voor analyse van de gehele mount. Deze methoden vergemakkelijken de cellulaire beeldvorming van FP's in maïsblad primordia24 (zoals weergegeven in figuur 4 en figuur 5) en bieden eenvoudige oplossingen voor de uitdagingen van het in beeld brengen van ontwikkelende maïsbladeren. Protocol sectie 2 vermindert de dissectietijd en verbetert de bemonsteringsnauwkeurigheid door de primordia voorafgaand aan de sectie te meten in plaats van alleen te vertrouwen op stadiëringsparameters 9,16. Met in de handel verkrijgbare nanotape lost protocolsectie 3 het al lang bestaande probleem op van het in beeld brengen van primordia van hele bladeren in maïs. Dit protocol verbetert de vorige methode, die dialysebuizen31 gebruikte, en is een veel goedkoper alternatief voor CT en MRI 11,32,33. Als het echter gaat om het visualiseren van anatomische eigenschappen van bladeren en het produceren van optimale resultaten, hebben beide protocollen enkele beperkingen, die worden beschreven in tabel 2 en hieronder in meer detail worden besproken.

In protocolsectie 2 ondervonden we problemen met het visualiseren van celcontouren in dikke dwarsdoorsneden van de bladprimordia, en tegenkleuring met celwand- of plasmamembraanbindende fluorescerende kleurstoffen leverde geen bevredigende resultaten op. FM 4-64 produceerde bijvoorbeeld suboptimale resultaten in vergelijking met de plasmamembraan FP-marker, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; Figuur 3A-D). Om deze beperking te overwinnen, raden we aan om een vibratoom te gebruiken om dunnere weefselsecties (~ 0,1 mm) 58 te produceren die een levendige helderveldbeeldvorming van celcontouren mogelijk maken of het contrastainingprotocoloptimaliseren 47,59.

In protocolsectie 3 is de belangrijkste beperking de moeilijkheid om het blad te monteren zonder scheuren, beschadiging of luchtbellen, zoals beschreven in protocolstappen 3.2.5-3.2.6 (figuur 3E-K). Omdat het maïsblad bilateraal symmetrisch is, kan een halfbladige montage in plaats van een hele bladbevestiging voldoende zijn voor visualisatie9. Om dit te doen, kan het primordium met een scheermesje langs de lengteas worden gesneden nadat het tot aan de middenrib is uitgerold, waardoor slechts de helft van het blad kan worden gemonteerd. Een andere beperking van protocolsectie 3 is dat de dikte van het blad de optische resolutie van het fluorofoorsignaal tijdens diepe beeldvorming kan beperken. Om dit probleem aan te pakken, is het mogelijk om een weefselreinigingstechniekte gebruiken 60. We ontdekten echter dat ClearSee61, een veelgebruikt opruimreagens voor het afbeelden van plantenweefsels, niet compatibel is met het protocol omdat het ervoor zorgt dat het monster en de coverslip loskomen van de nanotape. Een mogelijke oplossing voor dit probleem zou kunnen zijn om een semipermeabel membraan31 over het bladmonster aan te brengen, waardoor het kan worden behandeld met de clearingoplossing terwijl het op zijn plaats wordt gehouden door de nanotape. Een dergelijke methode waarmee vloeibare oplossingen op het uitgerolde blad kunnen worden aangebracht, zou ook kunnen worden gebruikt voor whole-mount RNA in situ hybridisatie en immunolocalisatietechnieken, die eerder zijn geoptimaliseerd voor het ontwikkelen van maïsbloeiwijzen, maar niet voor primordia62,63 van het hele blad.

We beschreven protocollen voor maïs, die zelfs in het zaailingstadium grote bladprimordia heeft. Andere grassoorten met veel kleinere bladprimordia, zoals rijst, gerst, tarwe, Setaria en Brachypodium 16,23,64,65,66, kunnen het gebruik van extra precisiegereedschappen vereisen om deze protocollen effectief toe te passen. Bovendien waren deze protocollen niet bedoeld voor beeldvorming van levende cellen, die real-time dynamische processen van weefselvorming en cellulaire reacties vastlegt. Naarmate fluorescerende sondes, beeldvormingstechnologieën en computermogelijkheden zich echter blijven ontwikkelen in live cell imaging voor planten67, zou toekomstig onderzoek kunnen voortbouwen op deze protocollen om live cell imaging-strategieën te ontwikkelen die zijn afgestemd op de unieke kenmerken van grasbladprimordia.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag de Maize Genetics Cooperation, het Maize Cell Genomics Project, Dave Jackson (Cold Spring Harbor Laboratory, NY), Anne W. Sylvester (Marine Biological Laboratory, University of Chicago, IL), Andrea Gallavotti (Rutgers University, NJ) en Carolyn G. Rasmussen (University of California, Riverside) bedanken voor het leveren van de mutante en transgene bestanden, evenals Robert F. Baker en Alexander Jurkevich van de Advanced Light Microscopy Core aan de University of Missouri-Columbia voor hun hulp bij confocale microscopie. JMR werd ondersteund door de J. William Fulbright Fellowship, The Diane P. and Robert E. Sharp Fund en het Plant Genome Research Program (IOS-1546873) van de National Science Foundation tot PM. CDTC, CMRV, EDCDP en RJRR worden ondersteund door het Ateneo College Scholarship Program. CDTC, EDCDP en RJRR worden ondersteund door de DOST-SEI S&T Undergraduate Scholarship. DODL wordt ondersteund door Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR wordt ondersteund door Aiducation International-Pathways to Higher Education Scholarship. Dit werk werd ondersteund door de School of Science and Engineering en de Rizal Library, Ateneo de Manila University.

Materials

```html

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acrylic Gel Clear Double Sided Nano Tape 16.5 ft x 1.2 in, 2 mm dikEZlifego Store (Amazon)B07YB1ZXG61 rol
Bellucci Pick Gebogen micro sonde 16.8 cm, 6.6 inBausch & LombN1692 91 stuk
Clayman guide microsonde Sinskey haak gebogen as, 11.6 cm, 4.6 inStorz Opthalmic InstrumentsE05421 stuk
Tandartssonde, Gebogen Naald, 14 cm (5.5 in)Ted Pella135531 stuk
DOWELL 10-22 AWG draadstripperDowell Store (Amazon)10-22 AWG1 stuk
Feather dubbelzijdige koolstofstaalmesjesTed Pella121-9pakket/10; voor fijne secties
Matglas microscoopglaasjes, 75 mm x 25 mm x 1-1.2 mmTed Pella260442pakket/144
GEM Enkelzijdige, Roestvrijstalen ongecoate mesjesTed Pella121-1doos/200; voor algemeen snijden/seceeren
GlycerolThermo ScientificPI179041 liter
ImageJ/FIJI met EDF plugin (versie 17.05.2021) en Grid/Collection Stitching pluginNational Institutes of Health (NIH) USAversie 2.9.0/1.54sDe EDF plugin is ontwikkeld door Alex Prudencio, Jesse Berent, en Daniel Sage voor de Biomedical Imaging Group, École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). De grid/collection stitching software is ontwikkeld door Stephan Preibisch voor het Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG).
Kimwipes Ex-L Klein 111.76 mm x 213.36 mmKimtech Science34155doos/280 vel
Microdekglasjes, 22 mm x 22 mm x 0.13 - 0.16 mm dikTed Pella2601401 ounce
PU Gel Clear Double Sided Nano Tape 29.5 ft x 1.18 in, 1 mm dikYecaye Store (Amazon)L354 W1.182 rollen
Superslip dekglasjes, 24 mm x 50 mm x 0.13 - 0.16 mm dikTed Pella2601661 ounce
Superslip dekglasjes, 24 mm x 60 mm x 0.13 - 0.16 mm dikTed Pella2601681 ounce
Gehard glazen snijplankHacaroa (Amazon)B09XMXBT5S4 stuk
```

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McSteen, P., Kellogg, E. A. Molecular, cellular, and developmental foundations of grass diversity. Science. 377 (6606), 599-602 (2022).
  2. Wang, P., Vlad, D., Langdale, J. A. Finding the genes to build C4 rice. Current Opinion in Plant Biology. 31, 44-50 (2016).
  3. Wang, P., et al. Candidate regulators of early leaf development in maize perturb hormone signalling and secondary cell wall formation when constitutively expressed in rice. Scientific Reports. 7 (1), 4535(2017).
  4. Perico, C., Tan, S., Langdale, J. A. Developmental regulation of leaf venation patterns: Monocot versus eudicots and the role of auxin. New Phytologist. 234 (3), 783-803 (2022).
  5. Wang, P., Kelly, S., Fouracre, J. P., Langdale, J. A. Genome-wide transcript analysis of early maize leaf development reveals gene cohorts associated with the differentiation of C4 Kranz anatomy. The Plant Journal. 75 (4), 656-670 (2013).
  6. Liu, W. Y., et al. Regulators of early maize leaf development inferred from transcriptomes of laser capture microdissection (LCM)-isolated embryonic leaf cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (35), e2208795119(2022).
  7. Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (10), 3979-3984 (2013).
  8. Strable, J., Nelissen, H. The dynamics of maize leaf development: Patterned to grow while growing a pattern. Current Opinion in Plant Biology. 63, 102038(2021).
  9. Reynolds, J. O., Eisses, J. F., Sylvester, A. W. Balancing division and expansion during maize leaf morphogenesis: Analysis of the mutant, warty-1. Development. 125 (2), 259-268 (1998).
  10. Richardson, A. E., et al. Evolution of the grass leaf by primordium extension and petiole-lamina remodeling. Science. 374 (6573), 1377-1381 (2021).
  11. Johnston, R., Leiboff, S., Scanlon, M. J. Ontogeny of the sheathing leaf base in maize (Zea mays). New Phytologist. 205 (1), 306-315 (2015).
  12. Sharman, B. C. Developmental anatomy of the shoot of Zea mays L. Annals of Botany. 6 (22), 245-282 (1942).
  13. Johnston, R., et al. Transcriptomic analyses indicate that maize ligule development recapitulates gene expression patterns that occur during lateral organ initiation. The Plant Cell. 26 (12), 4718-4732 (2014).
  14. Sharman, B. C. Leaf and bud initiation in the Gramineae. Botanical Gazette. 106 (3), 269-289 (1945).
  15. Nelissen, H., et al. A local maximum in gibberellin levels regulates maize leaf growth by spatial control of cell division. Current Biology. 22 (13), 1183-1187 (2012).
  16. Itoh, J., et al. Rice plant development: From zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
  17. Ritchie, S. W., Hanway, J. J., Benson, G. O. How a corn plant develops. Iowa State University of Science and Technology. , (1986).
  18. Freeling, M., Walbot, V. The Maize Handbook. , Springer Science & Business Media. (2013).
  19. Freeling, M., Hake, S. Developmental genetics of mutants that specify knotted leaves in maize. Genetics. 111 (3), 617-634 (1985).
  20. Durbak, A. R., et al. Transport of boron by the tassel-less1 aquaporin is critical for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 26 (7), 2978-2995 (2014).
  21. Langdale, J. A., Lane, B., Freeling, M., Nelson, T. Cell lineage analysis of maize bundle sheath and mesophyll cells. Developmental Biology. 133 (1), 128-139 (1989).
  22. Bosabalidis, A. M., Evert, R. F., Russin, W. A. Ontogeny of the vascular bundles and contiguous tissues in the maize leaf blade. American Journal of Botany. 81 (6), 745-752 (1994).
  23. Junqueira, N. E. G., et al. Anatomy and ultrastructure of embryonic leaves of the C4 species Setaria viridis. Annals of Botany. 121 (6), 1163-1172 (2018).
  24. Robil, J. M., McSteen, P. Hormonal control of medial-lateral growth and vein formation in the maize leaf. New Phytologist. 238 (1), 125-141 (2023).
  25. Donnelly, P. M., Bonetta, D., Tsukaya, H., Dengler, R. E., Dengler, N. G. Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Developmental Biology. 215 (2), 407-419 (1999).
  26. Govindaraju, P., Verna, C., Zhu, T., Scarpella, E. Vein patterning by tissue-specific auxin transport. Development. 147 (13), (2020).
  27. Linh, N. M., Scarpella, E. Leaf vein patterning is regulated by the aperture of plasmodesmata intercellular channels. PLoS Biology. 20 (9), e3001781(2022).
  28. Verna, C., Ravichandran, S. J., Sawchuk, M. G., Linh, N. M., Scarpella, E. Coordination of tissue cell polarity by auxin transport and signaling. eLife. 8, e51061(2019).
  29. Sawchuk, M. G., Head, P., Donner, T. J., Scarpella, E. Time-lapse imaging of Arabidopsis leaf development shows dynamic patterns of procambium formation. New Phytologist. 176 (3), 560-571 (2007).
  30. Linh, N. M., Scarpella, E. Confocal imaging of developing leaves. Current Protocols. 2 (1), e349(2022).
  31. Poethig, R. S., Szymkowiak, E. J. Clonal analysis of leaf development in maize. Maydica. 40, 67-76 (1995).
  32. Sprangers, K., Thys, S., van Dusschoten, D., Beemster, G. T. S. Gibberellin enhances the anisotropy of cell expansion in the growth zone of the maize leaf. Frontiers in Plant Science. 11, 1163(2020).
  33. Tsuda, K., et al. KNOTTED1 cofactors, BLH12 and BLH14, regulate internode patterning and vein anastomosis in maize. The Plant Cell. 29 (5), 1105-1118 (2017).
  34. Schindelin, J., et al. FIJI: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  35. Plant Care Protocols - Maize. The Donald Danforth Plant Science Center's Plant Growth Facility. , Available from: https://www.danforthcenter.org/our-work/core-facilities/plant-growth/ (2019).
  36. Mir, R., et al. A DII domain-based auxin reporter uncovers low auxin signaling during telophase and early G1. Plant Physiology. 173 (1), 863-871 (2017).
  37. DeBlasio, S. L., Sylvester, A. W., Jackson, D. Illuminating plant biology: Using fluorescent proteins for high-throughput analysis of protein localization and function in plants. Briefings in Functional Genomics. 9 (2), 129-138 (2010).
  38. Wu, Q., Luo, A., Zadrozny, T., Sylvester, A., Jackson, D. Fluorescent protein marker lines in maize: Generation and applications. The International Journal of Developmental Biology. 57 (6-8), 535-543 (2013).
  39. Mohanty, A., et al. Advancing cell biology and functional genomics in maize using fluorescent protein-tagged lines. Plant Physiology. 149 (2), 601-605 (2009).
  40. Baker, R. F., et al. Sucrose transporter ZmSut1 expression and localization uncover new insights into sucrose phloem loading. Plant Physiology. 172 (3), 1876-1898 (2016).
  41. Gallavotti, A., Yang, Y., Schmidt, R. J., Jackson, D. The relationship between auxin transport and maize branching. Plant Physiology. 147 (4), 1913-1923 (2008).
  42. Krishnakumar, V., et al. A maize database resource that captures tissue-specific and subcellular-localized gene expression, via fluorescent tags and confocal imaging (Maize Cell Genomics Database). Plant and Cell Physiology. 56 (1), 12(2015).
  43. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: A cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
  44. Geng, Y., Zhou, Y. Confocal live imaging of shoot apical meristems from different plant species. Journal of Visualized Experiments. (145), e59369(2019).
  45. Stanislas, T., Hamant, O., Traas, J. In-vivo analysis of morphogenesis in plants. Methods in Cell Biology. 139, Elsevier. 203-223 (2017).
  46. Fodor, E., Ayaydin, F. Fluorescent probes and live imaging of plant cells. Advances in Plant Ecophysiology Techniques. , Springer. 241-251 (2018).
  47. Grandjean, O., et al. In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis. The Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).
  48. Conklin, P. A., Johnston, R., Conlon, B. R., Shimizu, R., Scanlon, M. J. Plant homeodomain proteins provide a mechanism for how leaves grow wide. Development. 147 (20), (2020).
  49. Shaw, S. L. Imaging the live plant cell. The Plant Journal. 45 (4), 573-598 (2006).
  50. Klaus, A. V., Schawaroch, V., Frischmann, K. J. Confocal imaging and three-dimensional visualization of thick autofluorescent specimens. Methods in Molecular Biology. 1075, 213-225 (2014).
  51. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Extended depth-of-focus for multi-channel microscopy images: a complex wavelet approach. 2004 2nd IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: Nano to Macro (IEEE Cat No. 04EX821). IEEE. , 660-663 (2004).
  52. Extended Depth of Field. EPFL Biomedical Imaging Group. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2022).
  53. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  54. Phillips, K. A., et al. vanishing tassel2 encodes a grass-specific tryptophan aminotransferase required for vegetative and reproductive development in maize. The Plant Cell. 23 (2), 550-566 (2011).
  55. Robil, J. M., et al. GrasVIQ: An image analysis framework for automatically quantifying vein number and morphology in grass leaves. The Plant Journal. 107 (2), 629-648 (2021).
  56. Helliwell, C. A., Chandler, P. M., Poole, A., Dennis, E. S., Peacock, W. J. The CYP88A cytochrome P450, ent-kaurenoic acid oxidase, catalyzes three steps of the gibberellin biosynthesis pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 2065-2070 (2001).
  57. Gutierrez, R., Quiroz-Figueroa, F., Vazquez-Ramos, J. M. Maize cyclin D2 expression, associated kinase activity and effect of phytohormones during germination. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 166-173 (2005).
  58. Atkinson, J. A., Wells, D. M. An updated protocol for high throughput plant tissue sectioning. Frontiers in Plant Science. 8, 1721(2017).
  59. Lux, A., Morita, S., Abe, J., Ito, K. An improved method for clearing and staining free-hand sections and whole-mount samples. Annals of Botany. 96 (6), 989-996 (2005).
  60. Heriche, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: Advances and promising clearing practices. Trends in Plant Science. 27 (6), 601-615 (2022).
  61. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: A rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142 (23), 4168-4179 (2015).
  62. Chuck, G., Muszynski, M., Kellogg, E., Hake, S., Schmidt, R. J. The control of spikelet meristem identity by the branched silkless1 gene in maize. Science. 298 (5596), 1238-1241 (2002).
  63. Tran, T. M., et al. An optimized whole-mount immunofluorescence method for shoot apices. Current Protocols. 1 (4), e101(2021).
  64. O'Connor, D. L. PINs Lost and PINs Gained: Auxin-Transport Mediated Patterning in the Grasses. University of California, Berkeley. , Doctoral Dissertation (2012).
  65. Sharman, B. C., Hitch, P. A. Initiation of procambial strands in leaf primordia of bread wheat, Triticum aestivum L. Annals of Botany. 31 (2), 229-243 (1967).
  66. Serra, L., Tan, S., Robinson, S., Langdale, J. A. Flip-flap: A simple dual-view imaging method for 3D reconstruction of thick plant samples. Plants. 11 (4), 506(2022).
  67. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Maize Leaf PrimordiaTransverse SectionsWhole MountsFluorescence ImagingConfocal ImagingLeaf DevelopmentPrimordium UnrollingFluorescent Protein ReportersGrass Leaf MorphologyTissue Sectioning

Related Articles