Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een periprothetisch gewrichtsinfectiemodel van Candida albicans bij muizen

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65263

⸱

2 februari 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

In dit artikel

Samenvatting

Periprothetische gewrichtsinfectie (PJI) veroorzaakt door gevaarlijke ziekteverwekkers komt vaak voor in de klinische orthopedie. Bestaande diermodellen kunnen de werkelijke situatie van PJI niet nauwkeurig simuleren. Hier hebben we een Candida albicans biofilm-geassocieerd PJI-muismodel opgezet om nieuwe therapieën voor PJI te onderzoeken en te ontwikkelen.

Samenvatting

Periprothetische gewrichtsinfectie (PJI) is een van de meest voorkomende infecties veroorzaakt door Candida albicans (C. albicans), die chirurgen en wetenschappers steeds meer zorgen baart. Over het algemeen worden op de plaats van de infectie biofilms gevormd die C. albicans kunnen beschermen tegen antibiotica en immuunklaring. Chirurgie waarbij het geïnfecteerde implantaat wordt verwijderd, debridement, antimicrobiële behandeling en herimplantatie is de gouden standaard voor de behandeling van PJI. Het opzetten van PJI-modellen voor dieren is dus van groot belang voor het onderzoek naar en de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen of therapieën voor PJI. In deze studie werd een gladde draad van nikkel-titaniumlegering, een veelgebruikt implantaat in orthopedische klinieken, ingebracht in het femurgewricht van een C57BL/6-muis voordat de C. albicans werden geïnoculeerd in de gewrichtsholte langs de draad. Na 14 dagen werden rijpe en dikke biofilms waargenomen op het oppervlak van implantaten onder een scanning elektronische microscoop (SEM). Een significant verminderde bottrabecula werd gevonden in de H&E-kleuring van de geïnfecteerde gewrichtsmonsters. Samenvattend werd een PJI-muismodel vastgesteld met de voordelen van eenvoudige bediening, hoog succespercentage, hoge herhaalbaarheid en hoge klinische correlatie. Verwacht wordt dat dit een belangrijk model zal zijn voor klinische studies van C. albicans biofilm-gerelateerde PJI-preventie.

Inleiding

Candida albicans (C. albicans) verblijven commentaal in veel delen van het menselijk lichaam1, wat ook de meest voorkomende opportunistische ziekteverwekker is die levensbedreigende invasieve schimmelinfecties veroorzaakt, vooral bij immuungecompromitteerde patiënten 2,3. C. albicans kan transformeren tussen gist- en myceliumtoestanden als een polymorfe schimmel. De myceliumtoestand vertoont een hogere virulentie, sterkere hechting en invasie van cellen en weefsels 4,5. Bovendien kan C. albicans biofilms vormen op de oppervlakken van biomedische materialen zoals kunstgebitten, katheters en stents 1,6,7. De dichte driedimensionale structuur van biofilms beperkt de infiltratie van antischimmelmiddelen, brengt resistente genen tot expressie en reguleert het metabolisme van schimmelcellen om de klaring van het immuunsysteem te weerstaan 6,7. Daarom zijn biofilm-gerelateerde infecties behoorlijk uitdagend in klinieken8.

Staphylococcus aureus, coagulase-negatieve stafylokokken en enterobacter zijn de belangrijkste ziekteverwekkers die PJI9 veroorzaken. Hoewel de incidentie van schimmel-PJI relatief laag is (ongeveer 1%)10, zijn de behandelingskosten van schimmel-PJI hoger11, is de behandelingscyclus langer11 en is het slagingspercentage van de behandeling lager10 dan bacteriële PJI. In de afgelopen jaren is de incidentie van schimmel PJI jaar na jaar toegenomen10. Candida PJI is goed voor 77%-84% van de schimmel PJI 10,12, en C. albicans komt het meest voor bij Candida (54%). Daarom moet schimmel PJI worden bestudeerd.

Momenteel wordt PJI behandeld via revisiechirurgie door (1) het geïnfecteerde implantaat te verwijderen, (2) debridement, (3) antimicrobiële behandeling en (4) herimplantatie. Na grondig debridement wordt een antibioticum met botcement geplaatst en wordt de patiënt gedurende meer dan 6 weken systemisch behandeld met antibiotica om de infectie effectief onder controle te houden voordat een nieuw implantaat wordt geplaatst13. Deze methode kan ziekteverwekkers in weefsels echter niet volledig elimineren, en terugkerende infecties die worden behandeld met langdurige antimicrobiële therapie zullen zich zeer waarschijnlijk ontwikkelen in resistente stammen 14,15,16.

Het opzetten van diermodellen van PJI is belangrijk voor het onderzoek en de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen of therapieën voor PJI. Bij de ontwikkeling van PJI worden grote dode ruimtes rond de prothese gevormd, wat leidt tot de vorming van hematomen, die de bloedtoevoer van de omliggende weefsels verder blokkeren en het effect van antibiotica belemmeren11,15. Vanwege de moeilijkheid om de omgeving van de prothese na te bootsen, kunnen traditionele diermodellen de werkelijke situatie van PJI17,18 niet nauwkeurig simuleren.

In dit artikel werd een C. albicans biofilm-geassocieerd PJI-model bij muizen geconstrueerd met behulp van een klinisch veel gebruikte titanium-nikkeldraad om gewrichtsimplantaten te simuleren19,20. Dit PJI-model vertoont de voordelen van eenvoudige bediening, hoog slagingspercentage, hoge herhaalbaarheid en hoge klinische correlatie. Verwacht wordt dat het een belangrijk model zal zijn voor het bestuderen van de preventie en behandeling van C. albicans biofilm-gerelateerde PJI.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De dieren zijn gekocht van de Xi'an Jiaotong Universiteit. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Ethical Committee van de Xi'an Jiaotong University (goedkeuringsnummer: SCXK [Shaanxi] 2021-103). De muizen werden een week gehouden met 5 muizen per kooi. Ze kregen vrije toegang tot voedsel en water. De dieren werden vóór het onderzoek op kamertemperatuur (RT; 24 °C ± 1 °C) en de licht/donkercyclus (12 uur/12 uur) gehouden.

1. Buffer en voorbereiding van apparatuur

  1. C. albicans celkweek
    1. Inoculeer een monoklonale kolonie van C. albicans (SC5314) uit een gistextract pepton dextrose (YPD) plaatmedium met een inoculatielus in 5 ml YPD vloeibaar medium (YPD + 50 μg/ml carbenicilline).
    2. Schud de cellen van C. albicans vervolgens gedurende een nacht met een snelheid van 220 omw/min bij 30 °C.
    3. Centrifugeer de suspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten bij RT. Resuspendeer de C. albicans-cellen in normale zoutoplossing en verdun de celconcentratie tot 1 x 106 cellen/ml door de troebelheid visueel aan te passen zodat deze gelijk is aan die van 0,5 McFarland.
  2. Bereiding van normale zoutoplossing
    1. Weeg 0,9 g natriumchloride af en los op in 100 ml gedeïoniseerd water om 0,9% normale zoutoplossing te bereiden.
  3. Voorbereiding van chirurgische instrumenten
    1. Autoclaaf (121 °C, 30 min) de chirurgische instrumenten (schaar, pincet, hemostatische pincet, naaldhouders, hechtnaalden) en titanium-nikkellegeringsdraad (ongeveer 0,5 mm in diameter) voor gebruik.

2. Muis PJI-model vestiging

  1. Verdeel willekeurig 30 C57BL/6-muizen (mannetje, 15-20 g) in 3 groepen (10 muizen/groep), namelijk de controlegroep, de blanco implantaatgroep (implantatie van titanium-nikkeldraad zonder C . albicans-infectie ) en de PJI-groep (implantatie van titanium-nikkeldraad met C. albicans-infectie ).
  2. Verdoof de muizen met 1-4% isofluraaninhalatie voordat het haar op de linker achterpoot wordt verwijderd en gedesinfecteerd met jodium. Het verlies van de oprichtreflex en het uitblijven van een reactie op de teenstimulatie bevestigt de diepte van de anesthesie. Breng tijdens het verdoven oogzalf aan op beide ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen en om warmte aan te vullen tijdens de operatie en het herstel.
  3. Voor de muizen in de controlegroep, geef geen behandeling. Geef ze gratis toegang tot water en voedsel.
  4. Maak voor de muizen in de blanco implantaatgroep en de PJI-groep een longitudinale incisie van 5 mm op de knie van elke linker achterpoot met een #10-mes of een steriel scheermes om gewrichten bloot te leggen.
  5. Maak een gat van 5 mm lengte in het femorale intramedullaire kanaal door een steriele injectiespuit (26 G) naald in te brengen.
  6. Steek een gladde draad van een nikkel-titaniumlegering (0.5 mm in diameter, 5 mm in lengte) in het gat voordat u deze met een schaar knipt (Figuur 1).
  7. Voeg voor de muizen in de blanco implantaatgroep druppelsgewijs 2 μL YPD-medium toe langs de draad van de nikkel-titaniumlegering voordat u de wond laag voor laag sluit met een nylon hechtdraad (0,15 mm diameter).
  8. Voor de muizen in de PJI-groep, inoculeer 2 μL C. albicans-cellen (1 × 106 cellen/ml) druppel voor druppel in de gewrichtsruimte van muizen langs de draad van nikkel-titaniumlegering voordat u de wond laag voor laag sluit met een nylon hechtdraad.
  9. Huisvest de muizen met gratis toegang tot water en voedsel gedurende 14 dagen. Dien meloxicam toe door middel van subcutane injectie (4 mg/kg) om de 24 uur gedurende maximaal 3 dagen.
  10. Verdoof de muizen na 14 dagen met 3% isofluraan voordat u de muizen euthanaseert door cervicale dislocatie.

3. Evaluatie van het PJI-model

  1. Evaluatie van infecties in belangrijke organen
    1. Verzamel de nieren, lever en milt van de muizen na euthanasie.
    2. Voeg in elk orgaan 500 μL steriele normale zoutoplossing toe en maal de weefsels op een homogenisator bij 4 °C.
    3. Voeg 100 μl van het in stap 3.1.2 bereide homogenaat toe aan een YPD-plaat en verdeel het gelijkmatig met een gebogen staaf.
    4. Plaats de YPD-platen omgekeerd in een incubator van 37 °C gedurende 48 uur.
    5. Observeer en tel het aantal kolonies visueel.
  2. Observatie van C. albicans en biofilms op de implantaten
    1. Knip voorzichtig de huid over het gewricht van de muizen met een schaar voordat u het implantaat met een pincet verzamelt.
    2. Houd de implantaten gedurende 48 uur ondergedompeld in een 2,5% glutaaraldehyde-oplossing voor fixatie bij 4 °C.
    3. Spoel de implantaten driemaal met steriele PBS voordat u ze gedurende 3 uur onderdompelt in een 1% osmiumzuuroplossing.
    4. Spoel de implantaten drie keer met steriele PBS voordat u ze gedurende 15 minuten onderdompelt in 50%, 70%, 80%, 90% en 100% ethanoloplossingen voor uitdroging.
    5. Houd de implantaten driemaal 30 minuten ondergedompeld in tert-butanol voordat u de implantaten vriesdroogt.
    6. Bevestig de implantaatmonsters in de monsterfase, sputter het implantaat met goud (10 nm-coating) en observeer het onder een elektronische scanningmicroscoop (SEM) onder een hoog vacuüm en 1,5 kV.
  3. Pathologische analyse van de dijbeenweefsels
    1. Verzamel de femurweefsels met een schaar na het euthanaseren van de muizen.
    2. Dompel de dijbeenweefsels onder in 4% paraformaldehyde-oplossing voor fixatie bij 4 °C gedurende 48 uur.
    3. Plaats de dijbeenweefsels gedurende 1 week in 10% formaline.
    4. Droog de dijbeenweefsels uit door ze gedurende respectievelijk 15 minuten onder te dompelen in 50%, 70%, 80%, 90% en 100% ethanoloplossingen.
    5. Bedin de gedehydrateerde dijbeenweefsels in paraffine voordat de weefsels met behulp van een microtoom in monsters van 4 μm worden verdeeld.
    6. Kleur de dijbeensecties met hematoxyline en eosine door een standaardprotocol te volgen vóór pathologische analyse21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het overbrengen van de monsters op een plaatmedium en het tellen van kolonies na een nachtelijke incubatie wordt vaak gebruikt om de lokale pathogene belasting in de buurt van de laesie te beoordelen22,23. In onze studie was de microbiële kweek van lever-, nier- en miltmonsters negatief, wat aangeeft dat het model in deze studie alleen leidde tot lokale infectie in plaats van systemische infectie bij de muizen23.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De infectie veroorzaakt door de besmetting van chirurgische instrumenten of de chirurgische omgeving tijdens de operatie is de belangrijkste reden voor de meeste implantaatinfecties 24,25,26,27. Daarom werd in deze studie een C. albicans biofilm-gerelateerd PJI-model van muizen geconstrueerd. Vergeleken met het traditionele PJI-model waarin steriele roestvrijstalen deeltjes gesuspendee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen hebben beïnvloed.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar voor de financiële steun van de Natural Science Foundation van de provincie Shaanxi (subsidienummer 2021SF-118) en de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 81973409, 82204631).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
4 °C refrigeratorElectrolux (China) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Analytical balancesShimadzuATX124
Autoclaves SterilizerSANYOMLS-3750
CarbenicillinAmrescoC0885
Eclipse Ci Nikon upright optical microscope NikonEclipse Ts2-FL
GlucoseMacklin D823520
Inoculation ringThermo Scientific251586
IsofluraneRWD20210103
NaClXi'an Jingxi Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd20180108
ParaformaldehydeBeyotime BiotechnologyP0099
PeptoneBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
RWD R550 multi-channel small animal anesthesia machine RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Temperature incubatorShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Ultrapure water water generatorHeal ForceNW20VF
Ultrasound machineDo-ChromDS10260D
Yeast extractThermo Scientific OxoidLP0021B

Referenties

  1. Mayer, F. L., Wilson, D., Hube, B. Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence. 4 (2), 119-128 (2013).
  2. Fan, F., et al. Candida albicans biofilms: antifungal resistance, immune evasion, and emerging therapeutic strategies. International Journal of Antimicrobial Agents. 60 (5-6), 106673(2022).
  3. Tong, Y., Tang, J. Candida albicans infection and intestinal immunity. Microbiological Research. 198, 27-35 (2017).
  4. Kanaguchi, N., et al. Effects of salivary protein flow and indigenous microorganisms on initial colonization of Candida albicans in an in vivo model. Bmc Oral Health. 12, 36(2012).
  5. Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).
  6. Douglas, L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends in Microbiology. 11 (1), 30-36 (2003).
  7. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans biofilms and human disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
  8. Mack, D., et al. Biofilm formation in medical device-related infection. The International Journal of Artificial Organs. 29 (4), 343-359 (2006).
  9. Miller, R., et al. Periprosthetic joint infection: A review of antibiotic treatment. JBJS Reviews. 8 (7), e1900224(2020).
  10. Brown, T. S., et al. Periprosthetic joint infection with fungal pathogens. The Journal of Arthroplasty. 33 (8), 2605-2612 (2018).
  11. Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 255-267 (2004).
  12. Schoof, B., et al. Fungal periprosthetic joint infection of the hip: a systematic review. Orthopedic Reviews (Pavia). 7 (1), 5748(2015).
  13. Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
  14. Tande, A. J., Patel, R. Prosthetic joint infection. Clinical Microbiology Reviews. 27 (2), 302-345 (2014).
  15. Stocks, G., Janssen, H. F. Infection in patients after implantation of an orthopedic device. ASAIO Journal. 46 (6), S41-S46 (2000).
  16. Shahi, A., Tan, T. L., Chen, A. F., Maltenfort, M. G., Parvizi, J. In-hospital mortality in patients with periprosthetic joint infection. The Journal of Arthroplasty. 32 (3), 948-952 (2017).
  17. Carli, A. V., Ross, F. P., Bhimani, S. J., Nodzo, S. R., Bostrom, M. P. Developing a clinically representative model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 98 (19), 1666-1676 (2016).
  18. Stavrakis, A. I., Niska, J. A., Loftin, A. H., Billi, F., Bernthal, N. M. Understanding infection: A primer on animal models of periprosthetic joint infection. The Scientific World Journal. 2013, 925906(2013).
  19. Qiao, B., Lv, T. Electrochemical investigation of interaction of candida albicans with titanium-nickel implant in human saliva. International Journal of Electrochemical Science. 17 (2), 22028(2022).
  20. Oh, Y. R., Ku, H. M., Kim, D., Shin, S. J., Jung, I. Y. Efficacy of a Nickel-titanium ultrasonic instrument for biofilm removal in a simulated complex root canal. Materials. 13 (21), 4914(2020).
  21. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue Processing and Hematoxylin and Eosin Staining. Histopathology: Methods and Protocols. Christina E, D. ay , Springer, New York. 31-43 (2014).
  22. Sinclair, K. D., et al. Model development for determining the efficacy of a combination coating for the prevention of perioperative device related infections: A pilot study. Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 101 (7), 1143-1153 (2013).
  23. Mo, F., et al. In vitro and in vivo effects of the combination of myricetin and miconazole nitrate incorporated to thermosensitive hydrogels, on C. albicans biofilms. Phytomedicine. 71, 153223(2020).
  24. Zahar, A., Sarungi, M. Diagnosis and management of the infected total knee replacement: a practical surgical guide. Journal of Experimental Orthopaedics. 8 (1), 14(2021).
  25. Parvizi, J., Jacovides, C., Zmistowski, B., Jung, K. A. Definition of periprosthetic joint infection: Is there a consensus. Clinical Orthopaedics and Related Research. 469 (11), 3022-3030 (2011).
  26. Karczewski, D., et al. Candida periprosthetic joint infections - risk factors and outcome between albicans and non-albicans strains. International Orthopaedics. 46 (3), 449-456 (2022).
  27. Cobo, F., Rodriguez-Granger, J., Sampedro, A., Aliaga-Martinez, L., Navarro-Mari, J. M. Candida prosthetic joint infection. A review of treatment methods. Journal of Bone and Joint Infection. 2 (2), 114-121 (2017).
  28. Cobrado, L., Silva-Dias, A., Azevedo, M. M., Pina-Vaz, C., Rodrigues, A. G. In vivo antibiofilm effect of cerium, chitosan and hamamelitannin against usual agents of catheter-related bloodstream infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 68 (1), 126-130 (2013).
  29. Vila, T., et al. Therapeutic implications of C. albicans-S. aureus mixed biofilm in a murine subcutaneous catheter model of polymicrobial infection. Virulence. 12 (1), 835-851 (2021).
  30. Nishitani, K., et al. Quantifying the natural history of biofilm formation in vivo during the establishment of chronic implant-associated Staphylococcus aureus osteomyelitis in mice to identify critical pathogen and host factors. Journal of Orthopaedic Research. 33 (9), 1311-1319 (2015).
  31. Ormsby, R. T., et al. Evidence for osteocyte-media ted bone-matrix degradation associated with periprosthetic joint infection (PJI). European Cells & Materials. 42, 264-280 (2021).
  32. Garlito-Díaz, H., et al. A new antifungal-loaded sol-gel can prevent candida albicans prosthetic joint infection. Antibiotics (Basel). 10 (6), 711(2021).
  33. Harro, J. M., et al. Development of a novel and rapid antibody-based diagnostic for chronic staphylococcus aureus infections based on biofilm antigens. Journal of Clinical Microbiology. 58 (5), e01414-e01419 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Periprothetische gewrichtsinfectiemuis-PJI-modelbiofilmvormingnikkel-titaniumimplantaatdierinfectiemodelgewrichtsimplantaatinfectieantimicrobiële behandelingscanningelektronenmicroscopieverlies van bottrabekels
Een periprothetisch gewrichtsinfectiemodel van Candida albicans bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.