Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels

8.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65272

⸱

18 augustus 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) worden in verband gebracht met verschillende ziekten en immunofluorescentie wordt vaak gebruikt voor hun visualisatie. Er zijn echter verschillende kleuringsprotocollen en in veel gevallen wordt slechts één type weefsel onderzocht. Hier stellen we een algemeen toepasbaar protocol op voor het kleuren van NET in muizen en menselijk weefsel.

Samenvatting

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) worden vrijgegeven door neutrofielen als reactie op bacteriële infectie of traumatische weefselschade, maar spelen ook een rol bij auto-immuunziekten en steriele ontstekingen. Het zijn webachtige structuren die zijn samengesteld uit dubbelstrengs DNA-filamenten, histonen en antimicrobiële eiwitten. Eenmaal vrijgegeven, kunnen NET's extracellulaire ziekteverwekkers in bloed en weefsel vangen en doden. Bovendien nemen NET's deel aan homeostatische regulatie door de adhesie en coagulatie van bloedplaatjes te stimuleren. De ontregelde productie van NET is echter ook in verband gebracht met verschillende ziekten, waaronder sepsis of auto-immuunziekten, waardoor ze een veelbelovend doelwit zijn voor therapeutische interventie. Afgezien van elektronenmicroscopie is het visualiseren van NET's met behulp van immunofluorescentiebeeldvorming momenteel een van de weinige bekende methoden om NET-interacties in weefsel aan te tonen. Daarom zijn er verschillende kleuringsmethoden gebruikt om NET te visualiseren. In de literatuur worden verschillende kleuringsprotocollen beschreven en we hebben vier belangrijke componenten geïdentificeerd die een hoge variabiliteit tussen protocollen vertonen: (1) de gebruikte soorten antilichamen, (2) het gebruik van autofluorescentieverminderende middelen, (3) antigeenextractiemethoden en (4) permeabilisatie. Daarom werden in vitro immunofluorescentiekleuringsprotocollen in dit werk systemisch aangepast en verbeterd om ze toepasbaar te maken voor verschillende soorten (muis, mens) en weefsels (huid, darm, long, lever, hart, tussenwervelschijf). Na fixatie en paraffine-inbedding werden 3 μm dikke secties op objectglaasjes gemonteerd. Deze monsters werden gekleurd met primaire antilichamen voor myeloperoxidase (MPO), gecitrullineerd histon H3 (H3cit) en neutrofiele elastase (NE) volgens een gewijzigd kleuringsprotocol. De objectglaasjes werden gekleurd met secundaire antilichamen en onderzocht met behulp van een breedveldfluorescentiemicroscoop. De resultaten werden geanalyseerd volgens een evaluatieblad en de verschillen werden semi-kwantitatief geregistreerd.

Hier presenteren we een geoptimaliseerd NET-kleuringsprotocol dat geschikt is voor verschillende weefsels. We gebruikten een nieuw primair antilichaam om H3cit te kleuren en verminderden niet-specifieke kleuring met een autofluorescentieverlagend middel. Bovendien hebben we aangetoond dat NET-kleuring een constante hoge temperatuur en een zorgvuldige behandeling van monsters vereist.

Inleiding

Neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) werden voor het eerst gevisualiseerd door Brinkmann et al. als een route van cellulaire dood die verschilt van apoptose en necrose in 20041. In deze route geven neutrofielen hun gedecondenseerde chromatine af in de extracellulaire ruimte om grote webachtige structuren te vormen die bedekt zijn met antimicrobiële eiwitten die voorheen in de korrels of cytosolen waren opgeslagen. Deze antimicrobiële eiwitten omvatten neutrofiele elastase (NE), myeloperoxidase (MPO) en gecitrullineerd histon H3 (H3cit), die vaak worden gebruikt voor indirecte immunofluorescentiedetectie van NET's2. Deze methode identificeert niet alleen de kwantitatieve aanwezigheid van deze eiwitten; het heeft inderdaad het voordeel dat het specifiek NET-achtige structuren detecteert. In de NET's co-lokaliseren de genoemde eiwitten samen met extracellulair DNA, wat kan worden gedetecteerd door een overlapping van de fluorescentiesignalen van elk gekleurd eiwit en het extracellulaire DNA. In tegenstelling tot de overlappende signalen als gevolg van extracellulaire co-lokalisatie van DNA en eiwitten in NET's, vertonen intacte neutrofielen geen co-lokalisatie. Hier worden de NET-componenten meestal apart opgeslagen in de korrels, kernen en cytosol3.

Sinds hun eerste ontdekking is aangetoond dat NET een centrale rol spelen bij tal van ziekten, met name die waarbij ontstekingen betrokken zijn. NET's vertonen antimicrobiële functies tijdens infectie door extracellulaire pathogenen in bloed en weefsel op te vangen en te doden 4,5. NET is echter ook in verband gebracht met auto-immuunziekten en hyperinflammatoire reacties, zoals systemische lupus erythematosus, reumatische artritis en allergisch astma 6,7,8. NET bevorderen vaso-occlusie en ontsteking bij atherosclerose, bloedplaatjeshechting en er wordt gespeculeerd dat ze een rol spelen bij uitgezaaide kanker 9,10,11. Desalniettemin wordt aangenomen dat ze ontstekingsremmende eigenschappen hebben door de pro-inflammatoire cytokineniveaus te verlagen12. Terwijl NET steeds meer belangstelling krijgt in een breder onderzoeksgebied, is een robuuste NET-detectiemethode van fundamenteel belang voor toekomstig onderzoek.

Hoewel de visualisatie van NET's in verschillende weefsels met behulp van immunofluorescentiebeeldvorming complex is en maatwerk vereist, afgezien van elektronenmicroscopie, is het momenteel een van de meest gerenommeerde methoden voor het visualiseren van de interacties tussen NET's en cellen en wordt het voornamelijk gebruikt in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefsels (FFPE)13,14. Het vergelijken van NET-beeldvorming is echter moeilijk, omdat verschillende laboratoria hun eigen aangepaste protocollen gebruiken. Deze protocollen verschillen in het gebruik van antilichamen, antigeenextractie of permeabilisatiemethode en zijn vaak geoptimaliseerd voor een specifiek type weefsel 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Nadat Brinkmann et al. de eerste methodische studie publiceerden met behulp van immunofluorescerende visualisatie van NET's in FFPE-weefsel, wilden we dit protocol optimaliseren voor een grotere verscheidenheid aan weefsels en soorten15. Om een breed toepasbaar immunofluorescentieprotocol vast te stellen, hebben we bovendien verschillende aangepaste protocollen getest uit onderzoeken die immunofluorescentiemethoden in FFPE-weefsel gebruikten om NET's te detecteren 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. Verder hebben we een nieuw H3cit-antilichaam geprobeerd voor meer specifieke extracellulaire kleuring28. Onze hypothese is dat door het systematisch aanpassen van de huidige kleuringsprotocollen aan verschillende soorten en weefsels, in vitro beeldvorming kan worden verbeterd, wat resulteert in een betere weergave van de interactie tussen neutrofielen en NET's, zowel lokaal als systemisch.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie omvatte muizenweefsels die waren afgeleid van experimenten die waren goedgekeurd door de Hamburgse Staatsadministratie voor Dieronderzoek, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz, Hamburg, Duitsland (73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). De gebruikte weefsels waren muizenlong en dikke darm van een septisch model en verbrande huid. We gebruikten mannelijke en vrouwelijke muizen van 8 weken oud. Voor alle experimenten werd de Europese Richtlijn 2010/63/EU betreffende de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden gevolgd. De geanonimiseerde menselijke monsters omvatten weefsels van neonatale enterocolitis, verbrande huid, galwegatresie, spondylodiscitis en myocardium. Volgens de Medical Research Ethics Committee van Hamburg was voor de monsters geen geïnformeerde toestemming nodig, maar de studie werd goedgekeurd door de commissie (WF-026/21).

1. Sample fixatie

  1. Gebruik het volgende protocol dat is afgeleid van Abu Abed en Brinkmann voor monsterfixatie, dehydratie, paraffine-inbedding, secties en montage 3,15.
    1. Bereid 4% formaldehyde-oplossing door 40 g paraformaldehyde (PFA) op te lossen in 800 ml Tris-gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (TBS).
    2. Roer het mengsel op 60 °C onder een zuurkast tot de PFA is opgelost. Breng de oplossing op kamertemperatuur (RT) en pas het volume met TBS aan tot 1.000 ml.
    3. Stel de pH in op 7,4. Bewaren bij 4 °C gedurende 2-3 weken of bij -20 °C gedurende maximaal 1 jaar.
  2. Voor monsterfixatie plaatst u vers weefsel in de TBS-buffer en ontleedt u het in stukken kleiner dan 20 mm x 30 mm x 3 mm. Dompel de weefselsecties gedurende 12-24 uur onder in 4% paraformaldehyde-oplossing.
    OPMERKING: Het oorspronkelijke protocol gebruikte een 2% PFA-oplossing en een fixatietijd van 8-20 uur. Bij deze methode waren sommige weefselcoupes na 20 uur nog niet volledig gefixeerd, waardoor de PFA-concentratie werd verhoogd tot 4% PFA.
  3. Breng de monsters over in gelabelde weefselverwerkingscassettes. Gebruik oplosmiddelbestendige stiften of potloden voor het etiketteren.
  4. Start de uitdroging van het monster door de cassettes gedurende 1 uur onder te dompelen in 70% ethanol. Dompel vervolgens onder in 80% ethanol, 90% ethanol, 96% ethanol en twee keer in 100% ethanol, waarbij elke stap 1 uur duurt.
  5. Dompel tweemaal onder in 100% xyleen (dimethylbenzeen) en vervolgens tweemaal in paraffine van 60 °C gedurende telkens 1 uur.
  6. Gebruik inbeddingsmallen voor de montage en laat de paraffine stollen voordat u de mal verwijdert.
  7. Gebruik een microtoom voor het snijden van weefselsecties van 3 μm dik.
  8. Gebruik een pincet om de gesneden delen in een waterbad van 37 °C te leggen en laat ze op het oppervlak drijven om de weefselsneden uit te rekken.
  9. Plaats de secties op zelfklevende glasplaatjes (materiaaltabel) en laat ze een nacht drogen in een warmtekamer van 40 °C.

2. Monster rehydratatie

  1. Voor deparaffinisatie stapelt u de objectglaasjes in een glaasjesrek en dompelt u ze twee keer gedurende 5 minuten onder in het xyleenvervangingsmedium limoneen (materiaaltabel) en één keer gedurende 5 minuten in een 1:1 limoneen/ethanolmengsel.
    LET OP: Limoneen is ontvlambaar bij 50 °C en kan allergische reacties veroorzaken. Gebruik onder een zuurkast met oogbescherming en handschoenen. Blijf uit de buurt van open vuur.
  2. Rehydrateer de monsters in een aflopende ethanolreeks door het glaasjesrek twee keer onder te dompelen in 100% ethanol en één keer in 96% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol en 70% ethanol gedurende elk 5 minuten.
  3. Dompel het glaasjesrek 5 minuten onder in gedeïoniseerd water (DI-water) om eventuele resterende ethanol te verwijderen.

3. Autofluorescentieblokkering en antigeenterugwinning

  1. Bereid pH 6 citraat target retrieval solution (TRS) (Tabel met materialen) volgens het gegevensblad. Deze TRS wordt 10 keer geconcentreerd. Verdun daarom 1:10 met DI water. Verwarm voor in een plastic kleurpot op 96 °C.
    OPMERKING: TRS verbreekt de methyleenbruggen die tijdens de monsterfixatie zijn gevormd om de antigeenepitopen bloot te leggen. Hierdoor kunnen de primaire antilichamen hun doelantigeen binden. Bewaar geconcentreerde TRS gedurende 8 maanden bij 2-8 °C. Bereid altijd verse TRS.
  2. Haal de glaasjes uit het glaasjesrek en plaats ze in een natte kamer. Pipetteer één tot twee druppels autofluorescentiereducerend middel (Materiaaltabel) op elk monster. Incubeer gedurende 5 min.
    OPMERKING: Het autofluorescentiereducerende middel blokkeert de inherente weefselautofluorescentie veroorzaakt door endogene fluoroforen en fixeermiddelen. Bewaar het autofluorescentiereducerende middel maximaal 1 jaar bij RT.
    OPMERKING: Werk alleen met kleine delen van weefsels om uitdroging van de monsters of overschrijding van de incubatietijd te voorkomen.
  3. Stapel de objectglaasjes terug in het glaasjesrek en spoel ze gedurende 1 minuut in 60% ethanol met een opwaartse en neerwaartse beweging totdat al het ongebruikte autofluorescentiereducerende reagens is afgewassen.
  4. Dompel het glaasjesrek 5 minuten onder in DI-water.
  5. Voor het ophalen van antigeen brengt u de objectglaasjes over in een kleurpot met de voorverwarmde TRS. Incubeer gedurende 10 minuten bij 96 °C in een waterbad.
    OPMERKING: Het waterbad van 96 °C kan worden vervangen door een magnetron of stoomkoker als de TRS is voorverwarmd tot 96 °C en een incubatietijd van 10 minuten bij 96 °C is gegarandeerd.
  6. Haal de kleurpot eruit en laat deze ongeveer 60-90 minuten langzaam afkoelen tot RT.
    OPMERKING: Het protocol kan hier maximaal 4 uur worden gepauzeerd, waarbij de dia's in de TRS blijven.
  7. Verwijder de TRS, maar bewaar de glaasjes in de pot. Spoel tweemaal met Tris-gebufferde zoutoplossing met 0.05% Tween (TBST, pH 7.4) gedurende 3 minuten om eventuele overgebleven TRS-resten weg te spoelen.
  8. Voor permeabilisatie bereidt u 0,2% Triton in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, en vult u dit in de kleurpot om de monsters gedurende 10 minuten te permeabiliseren.
    OPMERKING: Permeabilisatie verbetert de binding van de primaire antilichamen met de intracellulaire doeleiwitten in de vaste monsters.
  9. Spoel de glaasjes opnieuw twee keer in TBST gedurende 3 minuten per keer.
  10. Bereid de natte kamer voor en leg dia's neer. Veeg overtollig water van de dia's met papieren zakdoekjes. Omcirkel elk monster met een hydrofobe barrièrepen om te voorkomen dat de antilichaamoplossing wegloopt.
    NOTITIE: Laat de monsters niet uitdrogen. Het is het beste om met kleine secties te werken.

4. Blokkeren van niet-specifieke antilichaambinding

  1. Neem een kant-en-klare blokkeringsoplossing met ezelserum (materiaaltabel) en pipetteer één druppel op elk monster. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    OPMERKING: Deze blokkeringsstap minimaliseert de binding van het secundaire antilichaam aan niet-specifieke bindingsplaatsen op het monster. Na het blokkeren van deze niet-specifieke epitopen en het aanbrengen van het primaire antilichaam, zal het secundaire antilichaam zich binden aan het primaire antilichaam en geen interactie hebben met het oppervlak van het weefsel. Dit kant-en-klare blokkerende reagens wordt 6 maanden bewaard bij 2-8 °C.
  2. Verwijder overtollige blokkeervloeistof van objectglaasjes door met de rand van de glaasjes tegen een hard oppervlak te tikken. Spoel ze niet af.

5. Primair antilichaam

  1. Verdun primaire antilichamen in de antilichaamverdunningsbuffer (Tabel met materialen). Gebruik ongeveer 100 μl van de uiteindelijke oplossing voor elk monster. Voor het NE- en H3cit (R8)-antilichaam en de isocontrole verdunnen tot een concentratie van 5 μg/ml. Gebruik voor MPO en bijbehorende isocontrole 10 μg/ml. Maak één buisje klaar voor elk primair antilichaam en één voor elk isocontrole-antilichaam.
    OPMERKING: H3cit (R8)/MPO of NE/MPO en hun isocontrols kunnen worden gecombineerd voor NET-kleuring. Voor de combinatie van H3cit (R8)/MPO, verdunnen tot een eindconcentratie van 5 μg/ml voor H3cit (R8) en 10 μg/ml voor MPO tot een eindvolume van 100 μl per monster. Voor NE/MPO, verdunnen tot een eindconcentratie van 5 μg/ml voor NE en 10 μg/ml voor MPO tot een eindvolume van 100 μl per monster. Gebruik voor isocontrole dezelfde concentratie als voor elk corresponderend antilichaam. Gebruik altijd een nieuwe pipetpunt voor elk gebruikt antilichaam. Primaire antilichamen kunnen gedurende 1-2 weken bij 4 °C en maximaal 1 jaar bij −20 °C of -80 °C worden bewaard.
  2. Gebruik met twee monsters op één objectglaasje één voor de isocontrole-antilichamen en één voor de MPO/H3cit- of MPO/NE-antilichaamverdunning. Gebruik ongeveer 100 μL voor elk monster en verdeel de antilichaamoplossing gelijkmatig.
    NOTITIE: Laat monsters niet uitdrogen. Zorg ervoor dat u de isocontrole en primaire antilichamen niet door elkaar haalt.
  3. Bewaar een nacht in een natte kamer bij 4 °C.
  4. Tik de volgende dag de overtollige primaire antilichaamoplossing van de objectglaasjes en stapel de objectglaasjes in een cuvet. Spoel drie keer gedurende 5 minuten elke keer met TBST om de resterende primaire antilichaamoplossing af te wassen.

6. Secundair antilichaam

  1. Bereid de secundaire antilichaamoplossing voor. Gebruik twee verschillende fluorescerende secundaire antilichamen: ezel-anti-geit voor MPO en ezel-anti-konijn voor H3cit-kleuring. Verdun elk tot een concentratie van 7,5 μg/ml met antilichaamverdunningsbuffer (materiaaltabel).
    OPMERKING: Gebruik voor dubbele kleuring twee fluorescerende antilichamen met verschillende excitatiegebieden en minimale spectrale overlapping. Combineer beide secundaire antilichamen en verdun tot een eindconcentratie van 7,5 μg/ml voor elk antilichaam voor een eindvolume van 100 μl per monster. Bescherm de antilichamen tegen licht. De secundaire antilichamen kunnen worden bewaard bij 2-8 °C gedurende 6-8 weken of bij -80 °C gedurende maximaal 1 jaar.
  2. Bewaar de objectglaasjes in de natte kamer en voeg 100 μL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan elk monster. Laat ze 30 minuten incuberen bij RT en beschermd tegen licht.
  3. Tik de overtollige secundaire antilichaamoplossing af en stapel de objectglaasjes in het objectglaasjesrek. Dompel drie keer gedurende 5 minuten onder in een kleurpot gevuld met PBS om eventuele resterende ongebonden antilichamen af te wassen.
  4. Bereid DAPI-oplossing (4',6-diamidino-2-fenylindol) (materiaaltabel) en verdun met DI-water tot een concentratie van 1 μg/ml. Dompel het glaasjesrek onder in een kleurpot met DAPI-oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij RT in het donker.
    OPMERKING: DAPI wordt gebruikt als fluorescerende kleuring voor dubbelstrengs DNA. De bereide DAPI-oplossing kan meerdere keren worden gebruikt. Bewaar de bereide DAPI-oplossing bij RT. Het DAPI-concentraat kan maximaal 1 jaar worden bewaard bij -20 °C.
  5. Dompel het glaasjesrek 5 minuten onder in een kleurpot met PBS om de overtollige DAPI-oplossing af te wassen.

7. Montage en opslag van de monsters, microscopische analyse

  1. Monteer de monsters met dekglaasjes en montagemedium (Materiaaltabel).
    NOTITIE: Gebruik slechts kleine hoeveelheden montagemedium en veeg het overtollige medium weg met natte tissues. Draag handschoenen en veeg niet per ongeluk een medium van de dekglaasjes of glaasjes. Voorkom luchtbelvorming en gebruik wattenstaafjes om zachtjes op de dekglaasjes te drukken om eventuele luchtbellen van de glaasjes te verwijderen.
  2. Gebruik voor beeldvorming een breedveldmicroscoop of een confocale microscoop.
    OPMERKING: Maak eerst een foto van de isocontrol. Verlaag de belichtingstijd voor de fluorescentiefilters (behalve het blauwe filter voor DAPI) totdat er bijna geen signaal meer kan worden gedetecteerd. Gebruik vervolgens deze instelling om de bijbehorende monsters te onderzoeken. Zoek naar gebieden waar een fluorescerend signaal kan worden gedetecteerd in elk afzonderlijk monster met behulp van het fluorescentiekanaal. Na het maken van een afbeelding van het gebied, genereert het programma een samengesteld beeld van alle kanalen en toont het de verschillende fluorescentiesignalen als een overlapping van verschillende kleuren. Het beeld kan vervolgens verder worden geanalyseerd voor co-lokalisatie met beeldvormingssoftware zoals ImageJ.
  3. Bewaar de objectglaasjes maximaal 6 maanden bij 4 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voordat we begonnen met onze protocoloptimalisatie, identificeerden we de belangrijkste stappen voor succesvolle kleuring door op PubMed te zoeken naar onderzoeken die FFPE-weefsel gebruikten voor de immunokleuring van NET's en hun protocollen te vergelijken. De meest veelbelovende protocolverschillen werden geïdentificeerd als de belangrijkste stappen voor de protocoloptimalisatie, terwijl stappen die grotendeels met elkaar overeenkwamen niet werden gewijzigd (tabel 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk wilden we de bestaande protocollen voor het in beeld brengen van NET aanpassen en optimaliseren voor meer weefseltypes, te beginnen met het eigenlijke kleuringsproces. De eerste cruciale stap voor deze methode is de selectie van de meest geschikte antilichamen. Voor NE hebben we een NE-antilichaam van een muizengastheer op menselijk weefsel geprobeerd, dat geen betrouwbare kleuring vertoonde in vergelijking met NE van een konijnengastheer. Bovendien stelden Thålin et al. H3cit (R8) voor als een specifieker an...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek is opgezet door de Duitse Onderzoeksvereniging (BO5534). We danken Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Dr. Annika Heuer en PD Dr. Ingo Königs voor het beschikbaar stellen van monsters. Daarnaast bedanken de auteurs het team van de UKE Microscopy Imaging Facility (Core facility, UKE Medical School) voor de ondersteuning bij de immunofluorescentiemicroscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
      Verdunning
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µgabcamAb 68672 1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µgabcamAb 51031:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µgabcamAb 259891:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µgabcamAb 908101:50
Axiovision Microscopy Software Zeiss4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50mlGeneTex GTX30972
DekglasjesMarienfeld0101202
Dako Target Retrieval Solution Citraat pH6 (x10)DakoS2369
DAPI 25 mgRoth6335.11:25000
DCS antibody dilution 500 mLDCS diagnosticsDCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3JacksonImmunoResearch705-165-1471:200
Donkey anti rabbit AF647JacksonImmunoResearch711-605-1521:200
Donkey anti rabbit Cy3JacksonImmunoResearch711-165-1521:200
Fluoromount-G Mounting MediumInvitrogen00-4958-02
Glazen ladeRothH552.1
Human/Mouse MPO AntibodyR&D SystemsAF 3667 1:20
Hydrofobe PenKISKERMKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mgabcamAb 374151:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 mlMaxvisionMB-L
Microscoop cameraZeissAxioCamHR3
MicrogolfovenBoschHMT84M421
Mouse IgG1 negative controlDakoX0931 Aglient1:50 and 1:5
Normal Goat IgG ControlR&D SystemsAB-108-C 1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x)Sigma-AldrichP-3813
PMP staining vatRoth2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µgabcamAb 2194061:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µgabcamAb 1727301:300
ROTI HistolRoth 6640
SuperFrost Plus slidesR. Langenbrinck03-0060
TBS Tris buffered saline (x10)Sigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP9416
WaterbadMemmert830476
Waterbad rijstkokerreishungerRCP-30
NasskammerWeckert Labortechnik600016
Zeiss Widefield microscopeZeissAxiovert 200M

Referenties

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639(2009).
  3. Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115(2019).
  4. Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders - Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
  5. Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
  6. Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
  7. Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
  8. Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
  9. Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
  10. Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
  11. Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
  12. Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
  13. Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159(2021).
  14. de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713(2016).
  15. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).
  16. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
  17. Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
  18. Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
  19. O'Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
  20. Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
  21. Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824(2020).
  22. Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
  23. Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7(2021).
  24. Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
  25. Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
  26. Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834(2020).
  27. Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
  28. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  29. Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
  30. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  31. Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38(2022).
  32. Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
  33. Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097(2021).
  34. Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296(2017).
  35. Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 9/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

Trefwoorden

Antigeenherstelweefselkleuringreductie van autofluorescentiegecitrullineerd histon H3myeloperoxidase antilichaamneutrofiele elastasewidefield fluorescentiemicroscopiein paraffine ingebed weefsel
Immunofluorescentiebeeldvorming van neutrofiele extracellulaire vallen in menselijke en muizenweefsels
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.