Kwantificering van de selectiviteit van visuele kenmerken van de optokinetische reflex bij muizen

Summary

Hier beschrijven we een standaardprotocol voor het kwantificeren van de optokinetische reflex. Het combineert virtuele drumstimulatie en video-oculografie en maakt zo een nauwkeurige evaluatie mogelijk van de eigenschapsselectiviteit van het gedrag en de adaptieve plasticiteit ervan.

Abstract

De optokinetische reflex (OKR) is een essentiële aangeboren oogbeweging die wordt geactiveerd door de globale beweging van de visuele omgeving en dient om netvliesbeelden te stabiliseren. Vanwege het belang en de robuustheid ervan is de OKR gebruikt om visueel-motorisch leren te bestuderen en om de visuele functies van muizen met verschillende genetische achtergronden, leeftijden en medicamenteuze behandelingen te evalueren. Hier introduceren we een procedure voor het evalueren van OKR-reacties van muizen met een hoofdfixatie met hoge nauwkeurigheid. Hoofdfixatie kan de bijdrage van vestibulaire stimulatie aan oogbewegingen uitsluiten, waardoor het mogelijk wordt om oogbewegingen te meten die alleen door visuele beweging worden veroorzaakt. De OKR wordt uitgelokt door een virtueel drumsysteem, waarbij een verticaal rooster dat op drie computermonitoren wordt gepresenteerd, horizontaal oscillerend of unidirectioneel met een constante snelheid afdrijft. Met dit virtual reality-systeem kunnen we systematisch visuele parameters zoals ruimtelijke frequentie, temporele/oscillatiefrequentie, contrast, luminantie en de richting van roosters wijzigen, en afstemmingscurven van selectiviteit van visuele kenmerken kwantificeren. High-speed infrarood video-oculografie zorgt voor een nauwkeurige meting van het traject van oogbewegingen. De ogen van individuele muizen zijn gekalibreerd om mogelijkheden te bieden om de OKR's te vergelijken tussen dieren van verschillende leeftijden, geslachten en genetische achtergronden. De kwantitatieve kracht van deze techniek stelt het in staat om veranderingen in de OKR te detecteren wanneer dit gedrag zich plastisch aanpast als gevolg van veroudering, zintuiglijke ervaring of motorisch leren; Het maakt deze techniek dus een waardevolle aanvulling op het repertoire van instrumenten die worden gebruikt om de plasticiteit van ooggedrag te onderzoeken.

Introduction

Als reactie op visuele stimuli in de omgeving bewegen onze ogen om onze blik te verschuiven, netvliesbeelden te stabiliseren, bewegende doelen te volgen of de foveae van twee ogen uit te lijnen met doelen die zich op verschillende afstanden van de waarnemer bevinden, die van vitaal belang zijn voor een goed zicht ^1,2. Oculomotorisch gedrag is op grote schaal gebruikt als aantrekkelijke modellen van sensomotorische integratie om de neurale circuits in gezondheid en ziekte te begrijpen, althans gedeeltelijk vanwege de eenvoud van het oculomotorische systeem³. Bestuurd door drie paar extraoculaire spieren, draait het oog in de kas voornamelijk rond drie overeenkomstige assen: elevatie en depressie langs de transversale as, adductie en abductie langs de verticale as, en intorsie en extorsie langs de anteroposterieure as ^1,2. Zo'n eenvoudig systeem stelt onderzoekers in staat om het oculomotorische gedrag van muizen gemakkelijk en nauwkeurig te evalueren in een laboratoriumomgeving.

Een belangrijk oculomotorisch gedrag is de optokinetische reflex (OKR). Deze onwillekeurige oogbeweging wordt veroorzaakt door langzame driften of verschuivingen van beelden op het netvlies en dient om netvliesbeelden te stabiliseren terwijl het hoofd van een dier of zijn omgeving beweegt ^2,4. De OKR, als gedragsparadigma, is om verschillende redenen interessant voor onderzoekers. Ten eerste kan het betrouwbaar worden gestimuleerd en nauwkeurig worden gekwantificeerd ^5,6. Ten tweede zijn de procedures voor het kwantificeren van dit gedrag relatief eenvoudig en gestandaardiseerd en kunnen ze worden toegepast om de visuele functies van een groot cohort dieren te evalueren⁷. Ten derde is dit aangeboren gedrag zeer plastisch ^5,8,9. De amplitude kan worden versterkt wanneer herhaalde retinale slips gedurende lange tijd optreden ^5,8,9, of wanneer de vestibulaire oculaire reflex (VOR) van zijn werkpartner, een ander mechanisme voor het stabiliseren van netvliesbeelden veroorzaakt door vestibulaire input^2, is aangetast⁵. Deze experimentele paradigma's van OKR-potentiëring stellen onderzoekers in staat om de circuitbasis te onthullen die ten grondslag ligt aan oculomotorisch leren.

In eerdere studies zijn voornamelijk twee niet-invasieve methoden gebruikt om de OKR te evalueren: (1) video-oculografie in combinatie met een fysieke trommel 7,10,11,12,13 of (2) willekeurige bepaling van hoofddraaien in combinatie met een virtuele trommel^6,14,15,16. Hoewel hun toepassingen vruchtbare ontdekkingen hebben opgeleverd bij het begrijpen van de moleculaire en circuitmechanismen van oculomotorische plasticiteit, hebben deze twee methoden elk enkele nadelen die hun vermogen beperken om de eigenschappen van de OKR kwantitatief te onderzoeken. Ten eerste maken fysieke trommels, met gedrukte patronen van zwarte en witte strepen of stippen, het niet mogelijk om gemakkelijk en snel visuele patronen te veranderen, wat de meting van de afhankelijkheid van de OKR van bepaalde visuele kenmerken, zoals ruimtelijke frequentie, richting en contrast van bewegende roosters, grotendeels beperkt ^8,17. In plaats daarvan kunnen tests van de selectiviteit van de OKR voor deze visuele kenmerken baat hebben bij geautomatiseerde visuele stimulatie, waarbij visuele kenmerken gemakkelijk van proef tot proef kunnen worden gewijzigd. Op deze manier kunnen onderzoekers systematisch het OKR-gedrag in de multidimensionale visuele parameterruimte onderzoeken. Bovendien rapporteert de tweede methode van de OKR-test alleen de drempels van visuele parameters die waarneembare OKR's veroorzaken, maar niet de amplitudes van oog- of hoofdbewegingen 6,14,15,16. Het gebrek aan kwantitatief vermogen verhindert dus het analyseren van de vorm van afstemmingscurven en de geprefereerde visuele kenmerken, of het detecteren van subtiele verschillen tussen individuele muizen in normale en pathologische omstandigheden. Om de bovenstaande beperkingen te overwinnen, waren video-oculografie en geautomatiseerde virtuele visuele stimulatie gecombineerd om het OKR-gedrag in recente studies te testen 5,17,18,19,20. Deze eerder gepubliceerde studies boden echter niet genoeg technische details of stapsgewijze instructies, en daarom is het voor onderzoekers nog steeds een uitdaging om zo'n OKR-test voor hun eigen onderzoek op te zetten.

Hier presenteren we een protocol om de selectiviteit van visuele kenmerken van OKR-gedrag onder fotopische of scotopische omstandigheden nauwkeurig te kwantificeren met de combinatie van video-oculografie en geautomatiseerde virtuele visuele stimulatie. Muizen zijn met hun hoofd gefixeerd om de oogbewegingen te vermijden die worden opgeroepen door vestibulaire stimulatie. Een hogesnelheidscamera wordt gebruikt om de oculaire bewegingen vast te leggen van muizen die bewegende roosters met veranderende visuele parameters bekijken. De fysieke grootte van de oogbollen van individuele muizen wordt gekalibreerd om de nauwkeurigheid van het afleiden van de hoek van oogbewegingen te garanderen²¹. Deze kwantitatieve methode maakt het mogelijk om OKR-gedrag tussen dieren van verschillende leeftijden of genetische achtergronden te vergelijken, of om de verandering ervan te volgen die wordt veroorzaakt door farmacologische behandelingen of visueel-motorisch leren.

Protocol

Alle experimentele procedures die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Biological Sciences Local Animal Care Committee, in overeenstemming met de richtlijnen die zijn opgesteld door de University of Toronto Animal Care Committee en de Canadian Council on Animal Care.

1. Implantatie van een hoofdstang bovenop de schedel

OPMERKING: Om de bijdrage van VOR-gedrag aan de oogbewegingen te voorkomen, wordt de kop van de muis geïmmobiliseerd tijdens de OKR-test. Daarom wordt een hoofdstang operatief bovenop de schedel geïmplanteerd.

1. Verdoof een muis (vrouwtje van 2-5 maanden oud en mannetje C57BL/6) door een mengsel van 4% isofluraan (v/v) en_O2 in een gaskamer. Breng de muis over naar een op maat gemaakt operatieplatform en verlaag de concentratie isofluraan tot 1,5%-2%. Bewaak de diepte van de anesthesie door de teenknijpreactie en de ademhalingsfrequentie tijdens de operatie te controleren.
2. Plaats een verwarmingskussen onder het lichaam van het dier om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Breng een laagje oogzalf aan op beide ogen om ze te beschermen tegen uitdrogen. Bedek de ogen met aluminiumfolie om ze te beschermen tegen lichtverlichting.
3. Injecteer carprofen subcutaan in een dosis van 20 mg/kg om de pijn te verminderen. Nadat u de vacht nat hebt gemaakt met chloorhexidinegluconaathuidreiniger, scheert u de vacht bovenop de schedel. Desinfecteer de blootgestelde hoofdhuid tweemaal met 70% isopropylalcohol en chloorhexidinealcohol.
4. Injecteer bupivacaïne (8 mg/kg) subcutaan op de plaats van de incisie en verwijder vervolgens de hoofdhuid (~1^cm2) met een schaar om het dorsale oppervlak van de schedel bloot te leggen, inclusief het achterste voorhoofdsbeen, het pariëtale bot en het interpariëtale bot.
5. Breng enkele druppels van 1% lidocaïne en 1:100.000 epinefrine aan op de blootgestelde schedel om lokale pijn en bloedingen te verminderen. Schraap de schedel met een Meyhoefer-curette om de fascia te verwijderen en reinig deze met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
   OPMERKING: De temporalis-spier wordt gescheiden van de schedel om het oppervlak te vergroten voor een hoofdstang om te bevestigen.
6. Droog de schedel door voorzichtig perslucht naar het schedeloppervlak te blazen totdat het vocht is verdwenen en het bot witachtig wordt. Breng een dunne laag secondelijm aan op het blootgestelde oppervlak van de schedel, inclusief de rand van de gesneden hoofdhuid, gevolgd door een laag acrylhars.
   OPMERKING: Het oppervlak van de schedel moet vrij zijn van bloed of water voordat secondelijm wordt aangebracht.
7. Plaats een roestvrijstalen hoofdbalk (zie figuur 1A) langs de middellijn bovenop de schedel. Breng meer acrylhars aan, beginnend vanaf de rand van de hoofdstang totdat de basis van de hoofdbalk volledig is ingebed in de acrylhars. Breng twee of drie keer acrylhars aan om de dikte op te bouwen.
8. Wacht ongeveer 15 minuten tot de acrylhars hard wordt. Injecteer subcutaan 1 ml ringerlactaatoplossing. Breng de muis vervolgens terug naar een kooi die op een verwarmingskussen is geplaatst totdat het dier volledig mobiel is.
9. Laat de muis minimaal 5 dagen na de operatie herstellen in de thuiskooi. Zodra het dier in goede conditie is, fixeert u zijn kop met de hoofdbeugel in de OKR-opstelling gedurende 15-30 minuten om vertrouwd te raken met de kopfixatie en de experimentele omgeving. Herhaal de kennismaking eenmaal per dag gedurende ten minste 3 dagen.

2. Installatie van de virtuele trommel en video-oculografie

1. Monteer drie monitoren orthogonaal ten opzichte van elkaar om een vierkante behuizing te vormen die ~270° van het azimut en 63° van de elevatie in de visuele ruimte beslaat (Figuur 1B links).
2. Met een discrete grafische kaart kunt u de drie monitoren samenvoegen tot een eenvoudig display om synchronisatie tussen alle monitoren te garanderen.
3. Kalibreer de luminantie van monitoren zoals hieronder beschreven.
   1. Zet de computer aan waarop de monitoren zijn aangesloten en wacht 15 minuten. De warming-up is essentieel om een stabiele luminantie te hebben.
   2. Verander de helderheidsinstelling op de monitor systematisch van 0 tot 100 in stappen van 25.
   3. Meet voor elke helderheidswaarde de luminantie van de monitoren onder verschillende pixelwaarden (0-255, stappen van 15) met een luminantiemeter.
   4. Pas de relatie tussen luminantie en helderheid voor pixelwaarde 255 aan met lineaire regressie en schat de helderheidswaarde die aanleiding geeft tot 160 cd/^m2.
   5. Schat voor elke pixelwaarde die wordt gebruikt in de luminantiemeting (stap 2.3.3) de luminantie voor de helderheidswaarde die is afgeleid in stap 2.3.4 op basis van lineaire regressie. Gebruik de vermogensfunctie lum = A * pixel γ om de relatie tussen de nieuwe set luminantiewaarden (onder de in 2.3.4 afgeleide helderheidswaarde) en de bijbehorende pixelwaarden aan te passen om de gammafactor ^γen de coëfficiënt A af te leiden. Deze zullen worden gebruikt om sinusvormige roosters met de gewenste luminantiewaarden te genereren.
   6. Stel de helderheid van alle drie de monitoren in op de waarden die zijn afgeleid in stap 2.3.4 om ervoor te zorgen dat hun luminantiewaarden hetzelfde zijn voor dezelfde pixelwaarde.
4. Genereer een virtuele trommel, die wordt gebruikt om OKR-gedrag te stimuleren, met de visuele stimulatietoolkit, zoals hieronder beschreven.
   1. Presenteer een verticaal sinusvormig rooster op de monitoren en pas de periode (afstand tussen strepen) langs het azimut aan om ervoor te zorgen dat de projectie van het rooster op het oog een constante ruimtelijke frequentie heeft (trommelrooster; Figuur 1B midden en rechts).
   2. Zorg ervoor dat het dier met de kop in het midden van de omheining is bevestigd, zodat het ziet dat het rooster een constante ruimtelijke frequentie heeft over het oppervlak van de virtuele trommel.
   3. Wijzig de parameters van bewegend rooster, zoals de oscillerende amplitude, ruimtelijke frequentie, temporele/oscillatiefrequentie, richting, contrast, enz., in de visuele stimulatiecodes. Gebruik twee soorten visuele bewegingen: (1) het rooster drijft met de klok mee of tegen de klok in op een oscillerende manier volgens een sinusvormige functie:
      
      Hier is Amp de amplitude van de drumbaan, f is de oscillatiefrequentie en t is de tijd (oscillatieamplitude: 5°; roosterruimtefrequentie: 0,04-0,45 cpd; oscillatiefrequentie: 0,1-0,8 Hz, overeenkomend met een pieksnelheid van de stimulus van 3,14-25,12 °/s [drumsnelheid = Amp x 2π x f x cos (2π x f x t); contrast: 80%-100%; gemiddelde luminantie: 35-45 cd/m²; (2) het rooster drijft unidirectioneel met een constante snelheid:
      
      (Ruimtelijke frequentie: 0,04-0,64 cpd; temporele frequentie: 0,25-1 Hz; drumsnelheid = temporele frequentie/ruimtelijke frequentie.)
5. Stel de video-oculografie in zoals hieronder beschreven.
   1. Om blokkering van het gezichtsveld van het dier te voorkomen, plaatst u een infrarood (IR) spiegel op 60° van de middellijn om een beeld van het rechteroog te vormen.
   2. Plaats een IR-camera aan de rechterkant achter de muis (Figuur 1C links) om een beeld van het rechteroog vast te leggen.
   3. Monteer de high-speed IR-camera op een camera-arm waarmee de camera ± 10° rond het beeld van het rechteroog kan draaien (Figuur 1C rechts).
   4. Gebruik een fotodiode die op een van de monitoren is bevestigd om een elektrisch signaal te leveren om de timing van video-oculografie en visuele stimulatie te synchroniseren.
   5. Plaats vier IR-lichtgevende diodes (LED's) ondersteund door zwanenhalsarmen rond het rechteroog om IR-verlichting van het oog te bieden.
   6. Plaats twee IR-LED's op de camera om referenties voor hoornvliesreflectie (CR) te geven: de ene is boven de camera bevestigd (X-CR), terwijl de andere zich aan de linkerkant van de camera bevindt (Y-CR; Figuur 1D).
   7. Meet de optische vergroting van het video-oculografiesysteem met een kalibratieglaasje.
      OPMERKING: De referentie-CR's worden gebruikt om de translatiebewegingen van de ogen op te heffen wanneer de ooghoek wordt berekend op basis van de roterende oogbewegingen.
6. Bevestig de kop van het dier in het midden van de omheining gevormd door de monitoren, zoals hieronder beschreven.
   1. Bevestig de kop van het dier met de kopplaat in het midden van de rig en maak hem naar voren gericht. Pas de kanteling van het hoofd zo aan dat het linker- en rechteroog waterpas staan en de neus- en temporale ooghoeken horizontaal zijn uitgelijnd (Figuur 1E).
   2. Beweeg de kop van het dier horizontaal door middel van grove afstelling door het kopfixatieapparaat en fijnafstelling door een 2D-translatiefase, en verticaal door het kopfixatieapparaat en een paal/paalhouderpaar, totdat het rechteroog van het dier verschijnt in de live video van de camera. Leg vóór de kalibratie en meting van de oogbewegingen het beeld van het rechteroog van het dier dat door de hete spiegel wordt weerkaatst, over het draaipunt van de camera-arm (zie details in stap 3.4 hieronder).
7. Bouw een aangepaste behuizing rond de OKR-installatie om het licht in de kamer te blokkeren (Figuur 1F).

3. Kalibratie van oogbewegingen

OPMERKING: Rotatiebewegingen van de ogen worden berekend op basis van bewegingen van de pupil en de straal van de oogbaan van de pupilbewegingen (R_p, de afstand van het midden van de pupil tot het midden van de oogbol). Voor elke individuele muis wordt deze straal experimenteel gemeten²¹.

1. Bevestig de kop van het dier in het midden van de leefruimte die wordt gevormd door de drie monitoren, zoals beschreven in stap 2.6.1.
2. Zet de camera aan en pas de vier LED's rond het rechteroog aan om een uniforme IR-verlichting te bereiken.
3. Pas onder visuele begeleiding de positie van het rechteroog aan totdat het in het midden van de video verschijnt, zoals beschreven in stap 2.6.2.
4. Lijn het virtuele beeld van het rechteroog uit met het draaipunt van de camera-arm, zoals hieronder beschreven.
   1. Draai de camera-arm handmatig naar het uiterste uiteinde links (-10°). Verplaats de positie van het rechteroog van het dier handmatig op het horizontale vlak loodrecht op de optische as met fijnafstelling van de 2D-translatiefase (Figuur 1C, groene pijl), totdat de X-CR zich in het horizontale midden van het beeld bevindt.
   2. Draai de camera-arm handmatig naar het andere uiteinde (+10°). Als de X-CR wegloopt van het midden van het beeld, beweegt u het rechteroog langs de optische as met fijnafstelling totdat de X-CR in het midden komt (Figuur 1C, blauwe pijl).
   3. Herhaal stap 3.4.1-3.4.2 een paar keer totdat de X-CR in het midden blijft wanneer de camera-arm naar links en rechts zwaait. Als het rechteroog in het midden van één herhaling beweegt, start u het aanpassingsproces opnieuw.
5. Meet de verticale afstand tussen de Y-CR en X-CR na het vergrendelen van de camera-arm in de centrale positie. Zet de Y-CR LED aan en neem zijn positie op de video op, en schakel vervolgens over naar de X-CR LED en neem zijn positie op.
   NOTITIE: De verticale afstand tussen de Y-CR en X-CR wordt gebruikt om de positie van de Y-CR af te leiden tijdens het meten van oogbewegingen waarbij alleen de X-CR LED is ingeschakeld.
6. Meet de straal van de pupilrotatie R_p, zoals hieronder beschreven.
   1. Draai de camera-arm naar het linkeruiteinde (-10°) en noteer de posities van de pupil (P_p1) en X-CR (P_CR1) op de video.
   2. Draai vervolgens de camera-arm naar rechts (+10°) en noteer de posities van de pupil (P_p2) en X-CR (P_CR2) op de video. Herhaal deze stap meerdere keren.
      OPMERKING: Het rechteroog van het dier moet tijdens elke herhaling stil blijven staan, zodat de hoeveelheid pupilbewegingen in de film nauwkeurig de mate van zwaaien met de camera-arm weergeeft.
   3. Bereken op basis van de hierboven vermelde waarden de straal van de pupilrotatie R_p (figuur 2A) met de volgende formule:
      
      OPMERKING: De afstand tussen de reflectie van het hoornvlies en het pupilcentrum in de fysieke ruimte wordt berekend op basis van hun afstand in de film:
      P_CR - P_p = aantal pixels in de film x pixelgrootte van de camerachip x vergroting
7. Ontwikkel de relatie tussen R_p en pupildiameter, zoals hieronder beschreven. R_p verandert wanneer de pupil verwijdt of vernauwt; proximaal, de waarde is omgekeerd evenredig met de pupilgrootte (Figuur 2B boven).
   1. Verander de luminantie van de monitoren systematisch van 0 tot 160 cd/^m2 om de pupilgrootte te regelen.
   2. Herhaal stap 3.6 8-10 keer voor elke luminantiewaarde en noteer de diameter van de pupil.
   3. Pas lineaire regressie toe op de relatie tussen R_p en pupildiameter op basis van de hierboven gemeten waarden om de helling en het snijpunt af te leiden (Figuur 2B onderaan).
      OPMERKING: De uitschieters die worden veroorzaakt door incidentele oogbewegingen worden vóór de lineaire aanpassing verwijderd. Voor herhaalde metingen in meerdere sessies hoeft de kalibratie slechts één keer te worden uitgevoerd voor één dier, tenzij het oog tijdens het experiment groter wordt.

4. Registreer oogbewegingen van de OKR

1. Bevestig een muis met het hoofd in de rig volgens de stappen 3.1-3.4. Sla deze stap over als de opname direct na de kalibratie plaatsvindt. Vergrendel de camera-arm in de centrale positie.
2. Stel de monitoren en het dier in voor scotopische OKR zoals hieronder beschreven. Sla deze stap over voor fotopische OKR.
   1. Bedek het scherm van elke monitor met een aangepast filter, dat is gemaakt van vijf lagen ND-film (Neutral Density) met een neutrale dichtheid. Zorg ervoor dat er geen licht naar buiten lekt door de opening tussen het filter en de monitor.
   2. Doe het licht in de kamer uit. De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van een IR-bril.
   3. Breng een druppel pilocarpine-oplossing (2% in zoutoplossing) aan op het rechteroog en wacht 15 minuten. Zorg ervoor dat de druppel op het oog blijft en niet door de muis wordt weggeveegd. Als de oplossing door het dier wordt weggeveegd, breng dan nog een druppel pilocarpine-oplossing aan. Hierdoor krimpt de pupil tot de juiste grootte voor eye-tracking onder de scotopische toestand.
      OPMERKING: Onder scotopische toestand verwijdt de pupil zich aanzienlijk, zodat de rand gedeeltelijk achter het ooglid wordt verborgen. Dit beïnvloedt de nauwkeurigheid van het schatten van het pupilcentrum door middel van video-oculografie. Farmacologisch krimpen van de pupil van het rechteroog vermindert de visuele input, en dus worden de visuele stimuli aan het linkeroog gepresenteerd.
   4. Spoel het rechteroog met zoutoplossing om de pilocarpine-oplossing grondig weg te spoelen. Trek het gordijn naar beneden om de behuizing volledig af te sluiten, waardoor strooilicht het scotopische zicht niet verstoort.
   5. Geef het dier 5 minuten de tijd om zich volledig aan te passen aan de scotopische omgeving voordat u met de OKR-test begint.
3. Voer de visuele stimulatiesoftware en de eye-trackingsoftware uit. Zorg er voor fotopische OKR-metingen voor dat het trommelrooster horizontaal oscilleert met een sinusvormig traject; voor scotopische OKR-metingen, zorg ervoor dat het trommelrooster met een constante snelheid van links naar rechts drijft, wat de temporo-nasale richting is ten opzichte van het linkeroog.
   OPMERKING: Wanneer de pupil van het rechteroog, maar niet van het linkeroog, wordt gekrompen door pilocarpine onder de scotopische toestand, is de OKR die wordt opgewekt door oscillerende trommelstimulatie zeer asymmetrisch. Voor een scotopische OKR-meting wordt dus het linkeroog gestimuleerd terwijl de beweging van het rechteroog wordt gevolgd.
4. De eye-trackingsoftware meet automatisch de pupilgrootte, CR-positie en pupilpositie voor elk frame en berekent de ooghoek op basis van de volgende formule (Figuur 2C):
   
   Hier is P CR de_CR-positie, P p de pupilpositie en R_p de straal van pupilrotatie. De afstand tussen de reflectie van het hoornvlies en het pupilcentrum in de fysieke ruimte wordt berekend op basis van hun afstand in de film:
   P_CR - P_p = aantal pixels in de film x pixelgrootte van de camerachip x vergroting
   R_p van de corresponderende pupilgrootte wordt afgeleid op basis van het lineaire regressiemodel in stap 3.7.3 (Figuur 2B onderaan).

5. Analyse van oogbewegingen van de OKR met de ooganalysesoftware

1. Verwerk de oogsporen met behulp van een mediaanfilter (filtervenster = 0,05 s) om hoogfrequente ruis te verwijderen (figuur 3A midden).
2. Verwijder de saccades of nystagmus zoals hieronder beschreven.
   1. Schat de oogsnelheid door de eerste orde afgeleide van oogbewegingen te berekenen (Figuur 3A onderaan). Identificeer de saccades of nystagmus door een snelheidsdrempel van 50 °/s toe te passen (Figuur 3A onderaan).
   2. Vervang de saccades of nystagmus door de oogposities tijdens deze snelle oogbewegingen te extrapoleren uit het segment vóór de saccades of nystagmus op basis van lineaire regressie (Figuur 3B).
3. Bereken de amplitude van OKR-oogbewegingen door middel van een snelle Fouriertransformatie (Goertzel-algoritme) als het trommelrooster oscilleert (Figuur 3C), of bereken de gemiddelde snelheid van oogbewegingen tijdens de visuele stimulatie als het trommelrooster met een constante snelheid in één richting beweegt (Figuur 3B onderaan).
   OPMERKING: De amplitude van oscillerende oogbewegingen afgeleid van Fouriertransformatie is vergelijkbaar met de amplitude die wordt afgeleid van de aanpassing van het oogtraject met een sinusvormige functie (Figuur 3D).
4. Bereken de OKR-winst. Voor oscillerende trommelbeweging wordt OKR-versterking gedefinieerd als de verhouding tussen de amplitude van oogbewegingen en de amplitude van trommelbewegingen (figuur 3C rechts). Voor unidirectionele trommelbeweging wordt OKR-versterking gedefinieerd als de verhouding tussen de oogsnelheid en de roostersnelheid van de trommel (Figuur 3B onderaan).

Results

Met de hierboven beschreven procedure evalueerden we de afhankelijkheid van de OKR van verschillende visuele kenmerken. De hier getoonde voorbeeldsporen zijn afgeleid met behulp van de analysecodes in Aanvullend coderingsbestand 1, en het onbewerkte voorbeeldbestand met sporen is te vinden in Aanvullend coderingsbestand 2. Wanneer het trommelrooster in een sinusvormige baan (0,4 Hz) dreef, volgde het oog van het dier automatisch de beweging van het rooster op een vergelijkbare oscilleren...

Discussion

De hier gepresenteerde methode van de OKR-gedragstest biedt verschillende voordelen. Ten eerste lost computergegenereerde visuele stimulatie de intrinsieke problemen van fysieke drums op. Rekening houdend met het probleem dat fysieke drums het systematische onderzoek van ruimtelijke frequentie-, richtings- of contrastafstemming^{niet ondersteunen 8}, maakt de virtuele drum het mogelijk om deze visuele parameters per proef te wijzigen, waardoor een systematische en kwantitatieve analyse van de kenmerk...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2D translational stage	Thorlabs	XYT1
Acrylic resin	Lang Dental	B1356	Voor het bevestigen van de hoofdplaat op de schedel en om de schedel te beschermen
Bupivacaine	STERIMAX	ST-BX223	Bupivacaine Injectie BP 0,5%. Lokale anesthesie
Carprofen	RIMADYL	8507-14-1	Analgesie
Geperste lucht	Dust-Off
Oogzalf	Alcon	Systane	Voor het behoud van de vochtigheid van de ogen
Grafische kaart	NVIDIA	Geforce GTX 1650 of Quadro P620.	Voor het genereren van een enkel scherm tussen drie monitoren
Verwarmingskussen	Kent Scientific	HTP-1500	Voor het handhaven van de lichaamstemperatuur
High-speed infrarood (IR) camera	Teledyne Dalsa	G3-GM12-M0640	Voor het opnemen van oogrotatie
IR LED	Digikey	PDI-E803-ND	Voor CR-referentie en de verlichting van het oog
IR spiegel	Edmund optics	64-471	Voor het weerspiegelen van het beeld van het oog
Isofluraan	FRESENIUS KABI	CP0406V2
Labview	National Instruments	versie 2014	oogbewegingen volgen
Lactaat Ringer	BAXTER	JB2324	Water- en energievoorziening
Lidocaine en epinefrine mix	Dentsply Sirona	82215-1	XYLOCAINE. Lokale anesthesie
Luminancimeter	Konica Minolta	LS-150	voor de kalibratie van monitoren
Matlab	MathWorks	versie xxx	analyse van oogbewegingen
Meyhoefer Curette	World Precision Instruments	501773	Voor het schrappen van de schedel en het verwijderen van fascia
Kalibratieschuurblad voor microscoop	Amscope	MR095	om de vergroting van video-oculografie te meten
Monitoren	Acer	B247W	Visuele stimulatie
Neutraal dichtheidsfilter	Lee filters	299	om scotopische visuele stimulatie te genereren
Nachtzichtbril	Alpha optics	AO-3277	voor scotopische OKR
Fotodiode	Digikey	TSL254-R-LF-ND	om visuele stimulatie en video-oculografie te synchroniseren
Pilocarpine hydrochloride	Sigma-Aldrich	P6503
Post	Thorlabs	TR1.5
Posthouder	Thorlabs	PH1
PsychoPy	open source software	versie xxx	visuele stimulatie toolkit
Schaar	RWD	S12003-09	Voor huidverwijdering
Superlijm	Krazy Glue		Type: Multifunctioneel. Voor het bevestigen van de hoofdplaat op de schedel