Analyse van transgenerationele epigenetische overerving in C. elegans met behulp van een fluorescerende reporter en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)

Summary

Dit protocol beschrijft een RNA-interferentie en ChIP-test om de epigenetische overerving van RNAi-geïnduceerde uitschakeling en geassocieerde chromatinemodificaties in C. elegans te bestuderen.

Abstract

Transgenerationele epigenetische overerving (TEI) maakt de overdracht van informatie door de kiembaan mogelijk zonder de genoomsequentie te veranderen, door factoren zoals niet-coderende RNA's en chromatinemodificaties. Het fenomeen van RNA-interferentie (RNAi) overerving in de nematode Caenorhabditis elegans is een effectief model om TEI te onderzoeken dat profiteert van de korte levenscyclus, zelfvoortplanting en transparantie van dit modelorganisme. Bij RNAi-overerving leidt blootstelling van dieren aan RNAi tot gen-uitschakeling en veranderde chromatinesignaturen op de doellocus die meerdere generaties aanhouden in afwezigheid van de initiële trigger. Dit protocol beschrijft de analyse van RNAi-overerving in C. elegans met behulp van een kiembaan-expressie nucleair groen fluorescerend eiwit (GFP) reporter. Reporter silencing wordt geïnitieerd door de dieren bacteriën te voeren die dubbelstrengs RNA tot expressie brengen dat gericht is op GFP. Bij elke generatie worden dieren gepasseerd om een gesynchroniseerde ontwikkeling te behouden, en de uitschakeling van reportergenen wordt bepaald door microscopie. Bij geselecteerde generaties worden populaties verzameld en verwerkt voor chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)-kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) om histonmodificatieverrijking op de GFP-reporterlocus te meten. Dit protocol voor het bestuderen van RNAi-overerving kan eenvoudig worden aangepast en gecombineerd met andere analyses om TEI-factoren in kleine RNA- en chromatineroutes verder te onderzoeken.

Introduction

Epigenetische overerving maakt de overdracht van genregulerende informatie over generaties mogelijk en kan daarom de omgeving of ervaringen van ouders in staat stellen hun nageslacht te beïnvloeden. Bij C. elegans kan kiembaangenuitschakeling geïnitieerd door exogeen dubbelstrengs RNA (dsRNA) gedurende meerdere generaties worden overgeërfd in nakomelingen die niet zijn blootgesteld aan de oorspronkelijke trigger 1,2,3,4. Dit proces, RNA-interferentie (RNAi) overerving genoemd, is een van de vele verwante epigenetische uitschakelingsfenomenen in C. elegans, waaronder piRNA-geïnitieerde multigenerationele uitschakeling ^2,5, paramutatie/RNAe (RNA-geïnduceerde epigenetische uitschakeling)6,7,8, en multicopy array-geïnitieerde uitschakeling^9, die overlappende maar verschillende vereisten hebben voor kleine RNA- en chromatineregulatiemachines . In exogeen RNAi van C. elegans wordt dsRNA verwerkt tot kleine interfererende RNA's (siRNA's) die in een complex met primaire Argonaute-eiwitten werken om hun doel-mRNA te herkennen. Deze targeting leidt tot de amplificatie van secundaire siRNA's die associëren met secundaire Argonauten om doel-mRNA het zwijgen op te leggen via zowel cytoplasmatische als nucleaire uitschakelingsroutes. Voor kiembaan-tot expressie gebrachte RNAi-doelen richten de nucleaire secundaire Argonaute HRDE-1 en aanvullende nucleaire RNAi-factoren zich op ontluikende transcripten, wat resulteert in transcriptionele repressie en rekrutering van histonmethyltransferasen om onderdrukkende chromatinemarkeringen af te zetten, waaronder H3K9me3¹⁰. Histon H3K9me3 bevordert de totstandbrenging van erfelijke uitschakeling van kiembaan-tot expressie gebrachte groen fluorescerende proteïne (GFP) transgenen door RNAi-overerving^11,12.

Het doel van dit protocol is om een transgen te gebruiken dat een GFP-histonfusie-eiwit in de kiembaan tot expressie brengt als reporter voor RNAi-overerving en om veranderingen in histonmodificaties op de locus van het reportertransgen te testen met behulp van chromatine-immunoprecipitatie en kwantitatieve polymerasekettingreactie (ChIP-qPCR). Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde, op platen gebaseerde RNAi-voedingsbenadering om reporter silencing te initiëren. Het biedt ook een gedetailleerde tijdlijn voor het passeren van dieren tussen generaties door in utero embryo's van drachtige volwassenen te isoleren door middel van alkalische hypochlorietbehandeling ('bleken'). Methoden en representatieve gegevens voor het monitoren van de frequentie van GFP-uitschakeling in een subgroep van de populatie door middel van fluorescentiemicroscopie en voor histon H3K9me3 ChIP-qPCR worden ook beschreven. Op reporters gebaseerde RNAi-overervingstests bieden een zeer handelbaar systeem om de rol van genetische en omgevingsfactoren in epigenetische regulatie functioneel te ontleden 13,14, en genetische screenings met behulp van dergelijke reporters hebben zowel genen geïdentificeerd die nodig zijn voor ^2,3,15 als genen die ^16,17 de duur van transgenerationele epigenetische overerving negatief reguleren.

Protocol

OPMERKING: Een testtijdlijn is weergegeven in figuur 1.

1. Bereiding van RNAi-nematodengroeimedium (RNAi-NGM)-platen

1. Streep E. coli HT115(DE3) met GFP- of controle-RNAi-vectoren uit glycerolvoorraden uit op Luria-Bertani (LB)-agarplaten aangevuld met 100 μg/ml ampicilline. Incubeer de bacteriën een nacht bij 37 °C.
2. Bereid de volgende dag RNAi-NGM-platen (1,7% [w/v] agar, 0,3% [w/v] NaCl, 0,25% [w/v] pepton, 1 mM CaCl₂, 5 μg/ml cholesterol, 25 mM kaliumfosfaatbuffer [pH 6,0], 1 mM MgSO₄, 25 μg/ml carbenicilline en 5 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside [IPTG]) volgens het standaardprotocol¹⁸.
   1. Bereid voor elke stam in de test minimaal zes RNAi-NGM-platen voor die zijn ingezaaid met GFP-RNAi (twee platen voor elk van de drie biologische replicaten) en twee RNAi-NGM-platen die zijn ingezaaid met controle-RNAi (één biologisch replicaat).
   2. Tent de borden losjes met folie om ze tegen licht te beschermen en laat ze een nacht op kamertemperatuur drogen.
3. Bereid op dezelfde dag als het gieten van RNAi-NGM-platen 4 ml vloeibare culturen van RNAi-bacteriën.
   1. Onder steriele omstandigheden aliquot 4 ml LB-bouillon aangevuld met 10 μg/ml tetracycline en 100 μg/ml ampicilline in kweekbuisjes. Pluk enkele kolonies van de LB-agarplaten in elke buis en incubeer ze een nacht terwijl ze ongeveer 16 uur bij 37 °C schudden.
4. Zaad RNAi-bacteriën op de RNAi-NGM-platen.
   1. Meet na een nacht groei de optische dichtheid (OD₆₀₀) van culturen met behulp van een 1:5 verdunning van bacteriën met LB-bouillon.
   2. Verdun RNAi-bacteriën tot een relatieve OD 600 van 2 met LB-bouillon aangevuld met 10 μg/ml tetracycline en₁₀₀ μg/ml ampicilline.
   3. Voeg onder steriele omstandigheden 150 μL van de controle- of GFP-RNAi-bacteriën toe aan elke RNAi-NGM-plaat.
   4. Tent de borden met folie en laat de bacteriën voor gebruik minimaal 24 uur bij kamertemperatuur groeien.
      OPMERKING: Ongebruikte RNAi-NGM-platen kunnen maximaal 1 week omgekeerd bij 4 °C in een afgesloten container in het donker worden bewaard.

2. Opstart van de RNAi-overervingstest: bleken en plateren van embryo's voor de P0-generatie

OPMERKING: Voordat met de RNAi-overervingstest wordt begonnen, moeten wormen die de GFP-reporter mjIs134 [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]⁷ bevatten, gedurende ten minste twee generaties uitgehongerd worden gehouden bij 21 °C.

1. Kies 4 dagen (96 uur) voor de start van de RNAi-overervingstest (Figuur 1) drie of vier drachtige volwassenen op elke standaard NGM-plaat van 35 mm die is ingezaaid met OP50-1-bacteriën.
   OPMERKING: Drie NGM-platen per stam is voldoende. Voor stammen met een verminderde vruchtbaarheid kunnen meer dan vier dieren per plaat nodig zijn.
2. Zorg er na 4 dagen voor dat de volwassen populatie is begonnen met het leggen van embryo's op de plaat. Spoel de wormen van de platen in buisjes van 1,5 ml met 800 μL M9-buffer aangevuld met Triton X-100 (TX-100) (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na₂HPO 4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO ₄, 0,01% (v/v) TX-100). Herhaal de wasbeurt en het zwembad in dezelfde buis.
3. Isoleer de embryo's van de populatie door ze als volgt te bleken.
   1. Bereid een bleekoplossing met bleekmiddel (6% natriumhypochloriet) en 10 N NaOH in een volumeverhouding van 1,5:1. Bereid een voldoende hoeveelheid zodat voor elk monster 250 μl kan worden gebruikt.
   2. Centrifugeer de buisjes van 1,5 ml met de wormen op 1.000 x g gedurende 1,5-2 min.
   3. Zuig het supernatant op, zodat er 100 μL overblijft zonder de worm 'korrel' te verstoren. Als alternatief kunnen de buizen ongeveer 2 minuten worden gelaten om de wormen te laten bezinken voordat ze worden opgezogen.
   4. Voeg 650 μL ddH₂O toe aan elke buis om een eindvolume van 750 μL te verkrijgen.
      OPMERKING: De volgende stappen zijn tijdgevoelig.
   5. Voeg 250 μL bleekoplossing toe aan elk buisje en start een timer.
   6. Draai de buizen elke 1-2 minuten grondig. Controleer na 5 minuten de wormen onder de stereoscoop om de afbraak van volwassenen te volgen.
   7. Ga door met vortexen totdat de wormen volledig zijn opgelost en er alleen embryo's overblijven. Centrifugeer de buisjes onmiddellijk op 1.000 x g gedurende 1,5 min.
      OPMERKING: Het bleken is over het algemeen binnen 6-7 minuten voltooid, maar moet worden gecontroleerd onder een stereoscoop met een vergroting die voldoende is om de vrijgelaten embryo's te observeren (40x). Laat de wormen niet voor langere tijd in bleekmiddel liggen, omdat dit de embryo's in gevaar brengt.
   8. Zuig na het centrifugeren het supernatans op en laat ongeveer 50-100 μl over. Voeg 1 ml M9-buffer toe met TX-100 om te wassen en meng door middel van vortexen. Centrifugeer opnieuw op 1.000 x g gedurende 1,5-2 minuten en was nog minstens twee keer.
   9. Zuig het supernatans uit de laatste wasbeurt op en laat ongeveer 100 μL in de buis. Mengen door vortexen. Pipetteer tweemaal 2 μl uit elke buis op een gelabeld objectglaasje. Tel de embryo's met behulp van een teller om de concentratie embryo's per microliter te schatten.
      OPMERKING: Dia's met meerdere matte putjes kunnen hier worden gebruikt om replica's van meerdere stammen te tellen. Telglaasjes kunnen gewassen en hergebruikt worden.
4. Om een semi-gesynchroniseerde populatiegroei op gang te brengen, mengt en pipet u een volume met 250 embryo's op elke RNAi-NGM-plaat. Gebruik twee platen voor elke replicatie. Laat de vloeistof intrekken.
5. Voor de P0-generatie die met RNAi wordt behandeld, incubeer bij 21 °C gedurende 4 dagen (96 uur) (van embryo's tot volwassenheid). Tijdstippen kunnen variëren afhankelijk van het genotype.

Figuur 1: Schema van de RNAi-overervingstest. Voorgestelde tijdlijn voor RNAi-NGM-plaatvoorbereiding en RNAi-overervingstestopstelling. Drachtige volwassenen worden op dag -4 geplukt op NGM-platen die zijn bezaaid met OP50-1. Na 4 dagen worden volwassen nakomelingen gebleekt en worden embryo's op RNAi-NGM-platen geplaatst. De P0-generatie wordt gedurende 4 dagen bij 21 °C blootgesteld aan RNAi. Zodra de wormen volwassen zijn, worden replicaten gepasseerd door te bleken en elke generatie gescoord op kiembaan-GFP-expressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Passeren en scoren van elke generatie voor kiembaan-GFP-expressie

OPMERKING: Om het scoren te vergemakkelijken, gebruikt u een vinylplaat om agarosepads te maken met lineaire ribbels om de wormen op één lijn te brengen. Deze methode is overgenomen van Rivera Gomez en Schvarzstein¹⁹.

1. Bereid 1% (m/v) agarose door agarose op te lossen in ddH₂O in een kleine kolf door verhitting in een magnetron. Voeg een roerstaaf toe en dek af met folie. Verwarm de agarose bij het omsmelten al roerend op een kookplaat van 200 °C. Eenmaal gesmolten, zet je het vuur lager tot 80 °C.
2. Was de wormen van de NGM-platen met 800 μL M9-buffer met TX-100 in een buis van 1,5 ml. Was de platen twee keer om alle drachtige volwassenen te verwijderen. Controleer de platen onder de stereoscoop om te bevestigen dat de dieren efficiënt zijn opgehaald.
3. Centrifugeer de buisjes op 1.000 x g gedurende 1,5-2 minuten of laat de wormen 2 minuten bezinken. Zuig het supernatans op en laat 100 μL over zonder de wormkorrel te verstoren.
4. Bereid agarosepads als volgt voor op het monteren van de wormen.
   1. Plaats een druppel gesmolten 1% (m/v) agarose op de vinylplaat (eerder beschreven¹⁹) met behulp van een glazen pasteurpipet (waarvan het smalle uiteinde is afgebroken).
   2. Richt een glasplaatje zo dat de lijnen op de plaat horizontaal of verticaal zijn en plaats het glaasje snel op de druppel agarose. Wacht ongeveer 30 seconden voordat u het glasplaatje van de plaat verwijdert.
      OPMERKING: Als u meerdere genotypen scoort, kan het nuttig zijn om een groter agarosekussen op één glaasje te maken en dit met een mesje doormidden te snijden.
5. Monteer de wormen op de agarosekussentjes.
   1. Voeg onder de stereoscoop ongeveer 5 μL 5 mM levamisol toe aan het agarosekussentje. De levamisolverdunning moet elke week vers worden gemaakt.
   2. Veeg voorzichtig met de buizen met wormen om te mengen en breng 5-10 μL wormen over op het agarosekussentje. Schat het aantal wormen met het oog terwijl ze worden toegevoegd, zodat er ongeveer 40 wormen per replica zijn.
   3. Zet de wormen in rijen op een rij met een wimperprikker om gemakkelijker te scoren. Voeg een glazen dekglaasje toe.
      NOTITIE: Dia's met dieren die op deze manier zijn gemonteerd, kunnen enkele uren meegaan voordat ze uitdrogen.
6. Isoleer de embryo's van de overige dieren met behulp van het bleekprotocol (zie stap 2.3) voordat u de objectglaasjes insnijdt. Plaat 250 embryo's op 35 mm NGM-platen gezaaid met OP50-1²⁰. Zodra de vloeistof is opgenomen, keert u de platen om en plaatst u ze terug in de incubator van 21 °C.
7. Gebruik een bloeiescentie stereoscoop met een GFP filterset. Tel en noteer het aantal GFP-positieve en GFP-negatieve wormen op de objectglaasjes voor elke replicatie met behulp van een teller.
   OPMERKING: GFP-positieve wormen hebben nucleaire GFP-expressie in hun kiembaan en embryo's in de baarmoeder. De kiembanen van GFP-negatieve wormen zullen niet fluoresceren, maar als de GFP in latere generaties weer AAN begint te gaan, kan de fluorescentie zwak zijn. Het kan nuttig zijn om extra niet-transgene wormstammen te monteren om rekening te houden met eventuele waargenomen autofluorescentie.
8. Passeer de populatie door te bleken, zoals hierboven beschreven, ongeveer om de 4 dagen (96 uur) bij 21 °C. Als alternatief kan het passeren voor het gemak worden gedaan volgens een afwisselend 3-daags/4-daags schema. Plaat een extra ~ 50 embryo's voor de kortere passerende generaties als afwisselend, omdat er na 72 uur een lagere opbrengst aan embryo's kan zijn.
   OPMERKING: Houd de doorgiftetijd van de P0-generatie consistent 4 dagen na het plateren van embryo's.

4. Diereninzameling voor ChIP

OPMERKING: Het aantal dieren en de timing zijn afhankelijk van de stam, het ontwikkelingsstadium, het epitoop en het aantal immunoprecipitatiedoelen (IP). Verzamel in het onderstaande voorbeeld dieren voor drie IP's: H3K9me3, histon H3 en IgG-controle. Het ChIP-protocol is overgenomen van Askjaer et ^al.21.

1. Voorafgaand aan het verzamelen van ChIP-monsters, breidt u de vorige generatie van de RNAi-overervingstest uit met nog eens drie NGM-platen (tot ten minste vier platen per replicaat). 4 dagen kweken bij 21 °C.
2. Bleken de drachtige volwassenen om de embryo's te isoleren (zie stap 2.3).
3. Plak voor elke stam ongeveer 3.500 embryo's op 14 platen (250 per plaat) en groei gedurende 3 dagen bij 21 °C tot het jongvolwassen stadium.
4. Was de dieren in buisjes van 1,5 ml met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die 0,01% (v/v) TX-100 (PBS/TX) bevatten. Centrifugeer op 1.000 x g gedurende 2 min. Aspireer de dieren van één stam op en voeg ze samen in één buis en was ze nog drie keer met ten minste 1 ml PBS/TX.
5. Aspireer tot 1.000 μL, keer om om te mengen en tel het aantal dieren in 3 μL driemaal (zie stap 2.3.9).
6. Bereken de concentratie van dieren en breng een volume dat overeenkomt met 3.000 dieren over naar een nieuwe buis voor formaldehyde-verknoping.
7. Zorg ervoor dat het totale volume minimaal 10 keer het volume van de wormkorrel is.

5. Formaldehyde verknoping

LET OP: Werk met formaldehyde in een zuurkast om blootstelling aan damp te voorkomen.

1. Voeg formaldehyde (1,8% eindconcentratie) toe aan het buisje met de wormen. Draai op kamertemperatuur gedurende 6 min.
2. Onmiddellijk invriezen in vloeibare stikstof. Bij deze stap kan het experiment worden gepauzeerd en kunnen de monsters bij -80 °C worden bewaard.
3. Ontdooi het verknoopte monster gedurende 3 minuten in een waterbad op kamertemperatuur en draai het gedurende 16 minuten bij kamertemperatuur.
4. Voeg 1,25 M glycine toe tot een eindconcentratie van 125 mM en draai gedurende 5 min.
   OPMERKING: Bewaar de monsters op ijs of bij 4 °C tot het magnetische parelsignaal en gebruik ijskoude buffers.
5. Centrifugeer het monster bij 1.000 x g gedurende 3 min. Was drie keer met 1 ml PBS/TX per keer. Tweemaal wassen met 1 ml resuspensiebuffer (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA], 0,01% TX-100, proteaseremmer [één tablet per 5 ml]).
6. Laat na de laatste wasbeurt voldoende buffer over om ervoor te zorgen dat het totale volume ten minste drie keer het pelletvolume en een minimum van ~100 μL is.

6. Sonificatie

OPMERKING: Sonicatieparameters zijn afhankelijk van het type en model van de sonicator en het stadium van het dier. Parameters zoals monstervolume en -concentratie, aan/uit-intervallen, aantal cycli en vermogensinstelling moeten empirisch worden geoptimaliseerd. Bewaak bijvoorbeeld gedurende een tijdsverloop van sonicatie de lysis van wormen met behulp van een eiwittest en bepaal wanneer de concentratie een plateau bereikt. Controleer bovendien wanneer de gemiddelde afschuifgrootte van het genomische DNA ongeveer 200-1.000 bp is door elektroforese van DNA, gezuiverd na crosslinking-omkering, op een 1,5% agarose/tris-acetaat-EDTA (TAE)-gel.

1. Meet het volume van de monsters uit de vorige stap. Meng en aliquot 90-120 μL tot een polystyreen sonicatiebuis.
2. Voeg een gelijk volume resuspensiebuffer toe met 2x detergentia (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 0,2% natriumdeoxycholaat, 0,7% sarkosyl).
3. Sonicaat in een waterbadsonicator op 50% vermogen gedurende 7 minuten (20 s aan/40 s uit) bij 4 °C. Meng voorzichtig door te pipetteren. Herhaal de sonicatie nog eens 7 minuten.
4. Breng het gesoniceerde lysaat over in een buis van 1,5 ml. Voeg 0,5 volume resuspensiebuffer zonder reinigingsmiddelen toe (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA) (voeg bijv. 100 μL buffer toe aan 200 μL monster).
5. Centrifugeer bij 13.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Houd het lysaat-supernatans en breng over naar een nieuwe buis.
6. Voer eventueel een eiwittest uit om de concentraties van elk lysaat te bepalen. Deze stap kan nuttig zijn voor grote monsterhoeveelheden of vergelijkingen tussen assays. Het standaardiseren van het aantal dieren zoals hierboven beschreven werkt echter goed voor de hier beschreven monsterhoeveelheden, omdat er een betere correlatie is met de opbrengst van chromatine/DNA zoals bepaald door qPCR.

7. Immunoprecipitatie

NOTITIE: Schaal de hoeveelheid antilichaam en magnetische korrels naar het volume en de concentratie van lysaat.

1. Verdeel het lysaatsupernatans in vier porties: drie gelijke volumes voor elk IP en 10% van het volume van één IP als input (bijv. 100 μL IP #1, 100 μL IP #2, 100 μL IP #3, 10 μL input). Breng het IP-lysaat over in een PCR-buis van 200 μl en bewaar het ingangslysaat bij -20 °C in een buis van 1,5 ml.
2. Voeg 0,5 μg anti-H3K9me3-antilichaam, antihiston H3-antilichaam of IgG toe aan het juiste IP-monster. Incubeer bij 4 °C gedurende de nacht met rotatie.
3. De volgende dag aliquot 9 μL proteïne G-gecoate magnetische kralen per IP in een enkele buis van 1,5 ml. Was de korrels twee keer met 1 ml FA-150 (150 mM NaCl, 50 mM HEPES-KOH [pH 7,5], 1 mM EDTA, 1% TX-100, 0,1% natriumdeoxycholaat).
4. Breng de magnetische kralen in FA-150 buffer opnieuw in resuspend tot het oorspronkelijke volume dat in stap 7.3 hierboven uit de voorraad is gehaald. Voeg 7,5 μL toe aan elk IP-adres. Incubeer bij 4 °C gedurende 2 uur met rotatie.

8. Wasbeurten en elutie

NOTITIE: Om ervoor te zorgen dat de magnetische kralen niet opdrogen, voegt u elke was- of elutiebuffer snel toe na het opzuigen van de vorige wasbeurt.

1. Gebruik elke keer 0,2-1 ml van de volgende bufferoplossingen om de kralen te wassen. Verzamel de kralen op een magnetische standaard om de wasbeurten op te zuigen. Incubeer elke wasbeurt op 4 °C gedurende 5 minuten met rotatie. Volg de volgorde zoals hieronder.
   1. Tweemaal wassen met FA-150.
   2. Eenmaal wassen met FA-1M (FA-150 met 1 M NaCl).
   3. Eenmaal wassen met FA-0.5M (FA-150 met 0.5 M NaCl). Overbrengen naar een nieuwe PCR-buis.
   4. Eenmaal wassen met TE-LiCl (250 mM LiCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% IGEPAL CA-630, 1% natriumdeoxycholaat).
   5. Tweemaal wassen met TE+ (50 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 0,005% IGEPAL CA-630).
      NOTITIE: Ga door met de monsterverwerking bij kamertemperatuur, tenzij anders aangegeven.
2. Zuig de laatste wasbuffer op. Resuspendeer de magnetische korrels met 50 μL ChIP-elutiebuffer (200 mM NaCl, 10 mM Tris-Cl [pH 8,0], 1 mM EDTA, 1% natriumdodecylsulfaat [SDS]) en breng over naar een buis van 1,5 ml.
3. Elute bij 65 °C gedurende 15 min in een thermomixer met mengen op 1.000 tpm gedurende 5 s per minuut.
4. Verzamel de kralen op een magnetische standaard en breng het supernatans over in een nieuwe buis.
5. Herhaal de elutie met nog eens 50 μL ChIP-elutiebuffer. Pool de supernatanten voor een totaal van 100 μL. Ga verder met omgekeerde crosslinking en DNA-elutie, zoals hieronder beschreven.

9. Omgekeerde crosslinking en DNA-elutie

1. Ontdooi het invoerlysaatmonster. Vul bij tot 100 μL met ChIP-elutiebuffer.
2. Voeg 16,5 μg RNase A toe aan elk IP- en invoermonster. Incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
3. Voeg 40 μg proteïnase K toe en incubeer gedurende 2 uur bij 55 °C. Incubeer vervolgens een nacht bij 65 °C.
4. Koel de monsters af tot kamertemperatuur en zuiver het DNA met een spin-column kit.

10. qPCR-reactie instellen en uitvoeren

OPMERKING: De parameters van de primer, de reactie-instelling en de thermocycler moeten worden aangepast om te voldoen aan de aanbevelingen van de fabrikant voor de gebruikte qPCR-reactiemix.

1. Bereid primersets voor die gericht zijn op de GFP RNAi-reporter en de positieve en negatieve verrijkingscontroleregio's van H3K9me3. De smelttemperatuur van de primer is 60 °C. Zie Tabel met materialen voor primersequenties.
2. Maak voor het invoer-DNA vier viervoudige seriële verdunningen (bijv. 1:5, 1:20, 1:80, 1:320).
   OPMERKING: Het IP-DNA kan direct of verdund (bijv. 1:2 of 1:3) worden gebruikt om meer reacties mogelijk te maken. De geschiktheid van de verdunning moet empirisch worden bepaald, aangezien de qPCR-prestaties kunnen worden beïnvloed.
3. Organiseer alle reacties die overeenkomen met één primerset op één PCR-plaat. Stel technische duplicaatreacties in voor elke DNA-verdunning van de invoer en elk IP-DNA-monster. Elke reactie van 10 μL bevat 1,5 μL input- of IP-DNA (of elutiebuffer als controle), qPCR-mastermix (1x eindconcentratie), voorwaartse primer en omgekeerde primer (400 nM eindconcentratie voor elke primer).
4. Voer op een real-time thermocycler het volgende programma uit: initiële denaturatie: 95 °C gedurende 4 minuten; amplificatie en fluorescentiedetectie: 40 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s met een plaataflezing; laatste verlenging: 60 °C gedurende 5 min; smeltcurve: van 60 °C tot 90 °C in stappen van 0,5 °C, 5 s per stap.

11. Bepaling van de versterkingsefficiëntie en verificatie van de productspecificiteit

1. Teken voor elke set input-DNA-verdunningen de vier datapunten met [log10(1/verdunning)] op de x-as en [Input Cq] op de y-as. Bepaal de helling van de lijn met de beste pasvorm.
2. Bereken de versterkingsefficiëntie. Ideale primersets moeten consequent een efficiëntie van 95%-100% weergeven.
   
3. Controleer of alle reacties één scherpe smeltcurvepiek hebben en of reacties met dezelfde primerset dezelfde smelttemperatuur hebben. Meerdere pieken of verschillende smelttemperaturen kunnen duiden op niet-specifieke versterking.
4. Voer eventueel reacties uit op een standaard 2% agarose/TAE-gel bij kamertemperatuur om de bandmaat van het product te controleren.

12. Berekening van het percentage Input

1. Bereken de ingangsverdunningsfactor. Aangezien 10% van het IP-lysaatvolume als input werd opgeslagen, is de verdunningsfactor voor de 1:5-verdunning van input-DNA 50.
2. Bepaal de IP-verdunningsfactor. Als het IP-DNA niet vóór qPCR wordt verdund, is de verdunningsfactor 1.
3. Bereken het Cq-verschil tussen het IP-adres en de input, gecorrigeerd voor verdunningsfactoren.
   
4. Bereken het invoerpercentage.
   

Results

Dieren die drager waren van het tot kiembaan tot expressie gebrachte GFP-histon H2B [mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR]⁷ reporter (Figuur 2A) werden blootgesteld aan GFP-RNAi of controle-RNAi door te voeren, en werden gepasseerd zoals beschreven in het protocol en figuur 1. Het nucleaire GFP-signaal in de kiembaan werd handmatig gescoord met behulp van een fluorescentie-ontleedmicroscoop voor een steekproef van de populatie bij elke generatie. Het uitschakelen van het transgen was volledig penetrant bij de gescoorde P0- en F1-dieren die werden behandeld met GFP-RNAi (figuur 2B). In de F2-generatie was het aandeel van de bevolking dat overerving van GFP-uitschakeling vertoonde ongeveer 50%. Bij de F5-generatie vertoonde de meerderheid van de populatie geen overerving van uitschakeling, en bij de F10-generatie werd geen overerving gedetecteerd, aangezien alle dieren GFP tot expressie brachten.

Om de verandering in histon H3K9me3-verrijking te bepalen die overeenkomt met RNAi-geïnduceerde uitschakeling, werd ChIP-qPCR uitgevoerd op dieren van de F1-generatie na behandeling met GFP-RNAi of controle-RNAi. Zoals verwacht vertoonde de met GFP RNAi behandelde populatie hogere histon H3K9me3-spiegels op het GFP-doel en in het stroomafwaartse gebied van 1,3 kb in vergelijking met met RNAi behandelde controledieren (Figuur 2C). De specificiteit van het histon H3K9me3 ChIP wordt ondersteund door de verrijking op een positieve controlelocus (clec-18) waarvan bekend is dat deze verrijkt is in dit merkteken, maar niet op een nabijgelegen negatieve controlelocus (hrp-2). Histon H3-verrijking en near-background verrijking in de IgG-controle-immunoprecipitaties werden ook gedetecteerd op alle qPCR-loci, zoals verwacht. Wanneer ChIP-verrijking bij de verslaggever wordt genormaliseerd naar de clec-18-positieve controlelocus, wordt een hogere histon H3K9me3-verrijking op GFP-RNAi getoond, terwijl histon H3-verrijking vergelijkbaar is tussen de controle- en GFP-RNAi-behandelingen (Figuur 2D). Aangezien GFP-RNAi naar verwachting geen invloed zal hebben op histon H3K9me3 of de totale histon H3-bezetting op de clec-18-locus, vermindert deze normalisatie technische variatie, zoals verschillen in ChIP-efficiëntie tussen de GFP-RNAi- en controle-RNAi-monsters . De vouwverandering van histon H3K9me3 en histon H3 niveaus tussen RNAi-behandelingen toont GFP-reporter-specifieke histon H3K9me3-verrijking, onafhankelijk van histonbezetting, na GFP RNAi-geïnduceerde uitschakeling (Figuur 2E).

Figuur 2: GFP RNAi-geïnduceerde uitschakeling komt overeen met verhoogde H3K9me3-verrijking op het RNAi-doelwit. (A) Diagram van de tot kiembaan tot expressie gebrachte GFP RNAi-reporter mjIs134[mex-5p::gfp-h2b::tbb-2 3'UTR] met qPCR-ampliconregio's gelabeld. (B) GFP-expressie gescoord over generaties na RNAi-behandelingen bij 21 °C. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van twee biologische replicaten. (C) ChIP-qPCR van H3K9me3, histon H3 en IgG-controle bij F1-jongvolwassenen van twee biologische replicaten. clec-18 en hrp-2 zijn respectievelijk de positieve en negatieve controleloci voor H3K9me3-verrijking. (D) H3K9me3 en histon H3-verrijking bij de GFP RNAi-reporter genormaliseerd naar de clec-18 positieve controlelocus. (E) Verandering in H3K9me3- en histon-H3-verrijking tussen GFP-RNAi- en controle-RNAi-behandelde dieren, met normalisatie naar clec-18. De stippellijn staat voor een vouwverandering van 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

In dit protocol wordt dsRNA geïntroduceerd door middel van voeding, wat een standaardmethode is geworden in C. elegans¹⁸. Voor RNAi-overervingstests biedt de voedingsbenadering een gemakkelijke methode om een grote P0-populatie te verkrijgen: 2,11,12,22,23,24,25. De timing en duur van de blootstelling aan RNAi beïnvloedt echter de werkzaamheid van transgene silencing²⁶, en de concentratie van RNAi-bacteriën beïnvloedt de persistentie van erfelijke RNAi-uitschakeling¹. Daarom zijn gestandaardiseerde RNAi-bacteriën en wormgroei belangrijk om een consistent niveau van GFP-uitschakeling en overervingsduur te verkrijgen. Hier worden embryo's op RNAi-platen geplaatst, zodat P0-dieren worden blootgesteld aan RNAi-bacteriën die uit het ei komen. Alternatieve benaderingen hebben gesynchroniseerde L1 ^24,27 of^{L4 25} stadium dieren op RNAi-NGM-platen geplaatst. Bovendien, aangezien hongersnood en andere spanningen van invloed zijn op het behoud van RNAi-overerving¹³, moeten platen worden gecontroleerd om overbevolking en uitputting van de voedselvoorraad te voorkomen. Als alternatief voor het initiëren van RNAi door voeding, induceerden sommige van de pionier C. elegans RNAi-overervingsstudies RNAi door middel van gonadeninjectie, wat een grotere controle van de dsRNA-concentratie ^1,28 biedt.

In dit protocol wordt elke generatie gepasseerd als een populatie met alkalische hypochlorietbehandeling, zoals eerder beschreven 16,22,23,24. Hypochlorietbehandeling zorgt ervoor dat de F1-generatie niet besmet raakt met RNAi-bacteriën uit de ouderlijke omgeving²² en voorkomt mogelijke ongewenste knelpunten in de populatie. Bulkpassing kan echter ook een beperking zijn, aangezien individuele dieren verschillende overervingspatronen kunnen hebben ^1,29. Een alternatieve methode om elke generatie vast te stellen is het selecteren van individuele dieren 1,2,9,11,25. Deze aanpak maakt het mogelijk om fenotypes binnen afstammingslijnen te volgen en genetische kruisingen op te nemen. Afstammingsanalyse kan ook voordelig zijn voor fenotypes met een lage penetrantie¹².

Fluorescerende eiwitexpressie is een krachtige en gemakkelijke uitlezing van RNAi-geïnduceerde uitschakeling 2,3,4,12,14,15,16,25,30. Zoals beschreven in dit protocol, kan GFP-expressie handmatig worden gescoord als AAN of UIT 11,12,15,16,25. Handmatig scoren kan verder worden verfijnd door kwalitatieve intensiteitsniveaus ^3,4,14 toe te kennen. Als alternatief kan geautomatiseerde intensiteitsscore van microscopiebeelden 11,12,14,25,27 of flowcytometriefluorescentiemeting van levende dieren² een kwantitatieve uitlezing met hoge doorvoer opleveren. Aangezien de expressie van de verslaggever echter beperkt is tot de kiembaan, is een voorbehoud bij geautomatiseerde benaderingen dat ze ook onderscheid moeten maken tussen dieren met gedempte GFP-expressie versus dieren zonder kiembaan, vooral als de studie mutanten bevat met een abnormale kiembaanontwikkeling. Als alternatief voor GFP-fluorescentie kan reverse transcriptie (RT)-qPCR worden gebruikt om RNAi-target pre-mRNA- en mRNA-niveaus 2,16,23,24 te kwantificeren. Deze aanpak zorgt voor een directere uitlezing van silencing, die zich richt op RNA, en is vooral nuttig voor andere RNAi-targets waar silencing geen zichtbaar fenotype oplevert. Een beperking van het gebruik van kunstmatige GFP-reporters is dat exogene en endogene sequenties differentieel worden gereguleerd in transgenerationeel^{RNAi 11}. Studies met endogene doelwitten, zoals het temperatuurgevoelige embryonale letale alleloma-1(zu405)1,11,16,25^, moeten daarom worden beschouwd als een aanvullende benadering van fluorescerende transgene reporters.

De analyse van ChIP in de context van RNAi-overervingstesten vereist een vergelijking tussen behandelingen en replicaten. Ten eerste, om rekening te houden met verschillen in uitgangsmateriaal tussen monsters, wordt het ChIP-signaal genormaliseerd naar het ingangssignaal op dezelfde locus als het 'percentage input'. Het parallel verwerken van een histon H3 ChIP zal helpen bepalen of eventuele histonmodificatieveranderingen overeenkomen met veranderingen in nucleosoomdichtheid. Omdat ChIP een proces is dat uit meerdere stappen bestaat, kan de efficiëntie bovendien variëren tussen monsters. De selectie van geschikte positieve en negatieve controleloci is nuttig om de signaal-ruisverhouding tussen monsters en experimenten te evalueren en te vergelijken. Om vergelijkingen tussen monsters te vergemakkelijken, worden de ChIP-DNA qPCR-drempelcycluswaarden op het RNAi-doelwit bovendien vaak genormaliseerd naar een controlelocus 3,11,15,23,30,31. Om de effecten van de RNAi-behandeling te evalueren, wordt ook de verhouding van het ChIP-signaal in behandelings-RNAi versus controle- of geen RNAi-omstandigheden vergeleken. Een beperking van de huidige aanpak is dat ChIP wordt uitgevoerd met hele dieren, terwijl de respons op RNAi-behandeling uniek kan zijn voor de kiembaan. Een manier om dit voorbehoud te overwinnen is om ChIP uit te voeren met behulp van geïsoleerde kiembaankernen. Aanvullende technische overwegingen voor het optimaliseren van ChIP zijn elders ook uitgebreid besproken^32,33.

Over het algemeen biedt dit RNAi-overervings- en ChIP-protocol een gedetailleerde en gemakkelijk aan te passen basis die kan worden geïntegreerd met andere technieken om transgenerationele epigenetische regulatie verder te onderzoeken. Zo kunnen bijvoorbeeld high throughput sequencing-bibliotheken worden geconstrueerd uit het ChIP-DNA (ChIP-seq) voor een gedetailleerder beeld van het chromatinelandschap, zowel proximaal van het RNAi-doelwit als op genoombrede schaal.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Bioshop	AGA002
Ampicillin	Bioshop	AMP201	Make a 100 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
Anti-H3K9me3 Rabbit Polyclonal Antibody	Abcam	ab8898	Concentration is batch-dependent (0.9 - 1 mg/mL).
Anti-Histone H3 Rabbit Polyclonal Antibody	Abcam	ab1791	Concentration is batch-dependent (0.7 - 1 mg/mL).
Bleach (6% Sodium hypochlorite)	Lavo	02358107
C. elegans strain with GFP RNAi Reporter	NA	SX1263	Sapetschnig et al. 2015 (ref. 7). A gift from E. Miska lab, University of Cambridge.
Carbenicillin	BioShop	CAR544	Make a 25 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
Dynabeads Protein G Magnetic Beads	Invitrogen	10003D
E. coli strain HT115(DE3)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	HT115(DE3)
E. coli strain OP50-1	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50-1
EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Invitrogen	15575020
Fluorescence Stereoscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Formaldehyde (37%)	Sigma	F8775
Glycine	Sigma	50046	Make a 1.25 M solution and store at 4 °C.
HEPES-KOH (1 M, pH 7.5)	Teknova	H1035
Hydrophobic Printed Slides, 10 wells	VWR	100488-904
IGEPAL CA-630 (Octylphenol ethoxylate)	BioShop	NON999	Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.
IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside)	BioShop	IPT001	Make a 0.2 g/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	1725122
LB Agar Plates supplemented with 100 µg/mL Ampicillin	NA	NA	Standard lab recipe.
Levamisole (Tetramisole hydrochloride)	Sigma	L9756	Make a 200 mM solution in ultrapure water. Store at -20 °C.
LiCl (8 M)	Sigma	L7026
M9 Buffer	NA	NA	22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl, 1 mM MgSO4.
Magnetic Separator (1.5 mL tubes)	Applied Biosystems	A13346
Magnetic Separator (0.2 mL tubes)	Permagen	MSR812
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12541B
Microscope Slide	Technologist Choice	LAB-037
NaCl (5 M)	Promega	V4221	For ChIP buffers.
NaOH	Sigma	S5881	Make a 10 M solution and store at room temperature.
NGM Plates	NA	NA	1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 μg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate pH 6.0, 1 mM MgSO4, 50 µg/mL streptomycin.
Normal Rabbit IgG (1 mg/mL)	Cell Signaling Technology	2729
Petri Dishes (35 mm x 10 mm)	Sarstedt	82.1135.500
Phosphate Buffered Saline (10X)	Fisher BioReagents	BP3991
Plasmid - Control RNAi	Addgene	L4440 (Plasmid #1654)
Plasmid - GFP-targetting RNAi	Addgene	L4417 (Plasmid #1649)	Note, alternative L4440-derived plasmids targeting GFP can be used.
Primer pair [-3.3 kb upstream of gfp]	Integrated DNA Technologies	NA	F: AAACCAAAGGACGAGAGATTCA, R: GGCTCGATCAAGTAAAATTTCG
Primer pair [+1.3 kb downstream of gfp]	Integrated DNA Technologies	NA	F: TCGACCAGTTCTAAAGTCACCG, R: ACGTGCGGGATCATTTCTTACT
Primer pair [clec-18]	Integrated DNA Technologies	NA	F: TGCTCCATGACCTCAACAACA, R: AGTACAGTTCACCGATCCAGA
Primer pair [gfp exon 1]	Integrated DNA Technologies	NA	F: CTGGAGTTGTCCCAATTCTTGT, R: GGGTAAGTTTTCCGTATGTTGC
Primer pair [gfp exon 4]	Integrated DNA Technologies	NA	F: GATGGCCCTGTCCTTTTACCA, R: ATGCCATGTGTAATCCCAGCA
Primer pair [hrp-2]	Integrated DNA Technologies	NA	F: CGTCAACAGGGAGCAGCTG, R: CCTCCGAACTTTCTCTGTCCA
Protease Inhibitor Cocktail Tablet	Roche	11836170001
Proteinase K	Bioline	BIO-37084
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28104
Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	CFX96
RNAi-NGM plates	NA	NA	1.7% (w/v) agar, 0.3% (w/v) NaCl, 0.25% (w/v) peptone, 1 mM CaCl2, 5 µg/mL cholesterol, 25 mM Potassium phosphate buffer pH 6.0, 1 mM MgSO4, 25 µg/mL carbenicillin and 5 mM IPTG.
RNase A	Sigma	R4642
Sarkosyl (N-Lauroylsarcosine sodium salt)	Sigma	L5777	Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.
SDS	Sigma	74255	Make a 10% (w/v) solution and store at room temperature.
Sodium deoxycholate	Sigma	30970	Make a 5% (w/v) solution and store at room temperature protected from light for a maximum of 1 month.
Sonication Tube	Evergreen	214-3721-010
Sonication Tube Cap	Evergreen	300-2911-020
Sonicator	Qsonica	Q800R3-110
Streptomycin sulfate	Bioshop	STP101	Make a 50 mg/mL solution in ultrapure water. Filter-sterilize and store at -20 °C.
TAE buffer (1X)	NA	NA	40 mM Tris, 20 mM acetate, 1 mM EDTA
Tally counter clicker	Uline	H-7350
Tetracycline	Bioshop	TET701	Make a 5 mg/mL solution in ethanol and store at -20 °C.
Thermomixer	Eppendorf	05-400-205
Tris-HCl (1 M, pH 8.0)	Invitrogen	15568025
Triton X-100	Sigma	T8787	Make a 10% (v/v) solution in ultrapure water and store at room temperature.