Een driedimensionale techniek voor de visualisatie van mitochondriale ultrastructurele veranderingen in pancreaskankercellen

Summary

Dit protocol beschrijft hoe mitochondriale cristae kan worden gereconstrueerd om 3D-beeldvorming te bereiken met hoge nauwkeurigheid, hoge resolutie en hoge doorvoer.

Abstract

Het begrijpen van de dynamische kenmerken van de ultrastructuur van het celorganel, die niet alleen rijk is aan onbekende informatie, maar ook geavanceerd vanuit een driedimensionaal (3D) perspectief, is van cruciaal belang voor mechanistische studies. Elektronenmicroscopie (EM) biedt een goede beelddiepte en maakt de reconstructie van beeldstapels met hoge resolutie mogelijk om de ultrastructurele morfologie van cellulaire organellen te onderzoeken, zelfs op nanometerschaal; daarom wint 3D-reconstructie aan belang vanwege de onvergelijkbare voordelen. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) biedt een high-throughput beeldacquisitietechnologie die het mogelijk maakt om grote structuren in 3D te reconstrueren vanuit hetzelfde interessegebied in opeenvolgende segmenten. Daarom wordt de toepassing van SEM in grootschalige 3D-reconstructie om de echte 3D-ultrastructuur van organellen te herstellen steeds gebruikelijker. In dit protocol stellen we een combinatie van seriële ultradunne sectie en 3D-reconstructietechnieken voor om mitochondriale cristae in pancreaskankercellen te bestuderen. De details van hoe deze technieken worden uitgevoerd, worden in dit protocol stapsgewijs beschreven, inclusief de osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) -methode, de seriële ultradunne sectiebeeldvorming en de visualisatieweergave.

Introduction

Mitochondriën zijn een van de belangrijkste organellen in de cel. Ze dienen als de centrale hub van cellulaire bio-energetica en metabolisme ^1,2 en spelen een cruciale rol bij kanker³. Alvleesklierkanker (PC) is een van de moeilijkste kankers⁴ om te behandelen vanwege de snelle verspreiding en het hoge sterftecijfer. Mitochondriale disfunctie, die voornamelijk wordt veroorzaakt door veranderingen in de mitochondriale morfologie 3,5,6,7^, is in verband gebracht ....

Protocol

1. Materiaalvoorbereiding

1. Kweek 2 x 10⁶ Panc02-cellen in 12 ml DMEM-medium (10% foetaal runderserum en 100 U / ml penicilline-streptomycine) en houd gedurende 48 uur op 37 °C en 95% vochtigheid in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide en 95% lucht.
2. Verzamel Panc02-cellen, centrifugeer gedurende 2 minuten op 28 x g en gooi het supernatant vervolgens weg. Zorg ervoor dat het monster de juiste grootte heeft (1 x 10⁷ cellen), omdat anders de volgende fixatie- en uitdrogingsstappen niet goed werken.
3. Voeg 1 ml 2,5% glutaaraldehyde toe als fixeermiddel om de verse Panc02-cellen in de 1,5 ml microcen....

Results

Tijdens de celkweek (figuur 1A) verdeelden we de alvleesklierkankercellen eerst in een controlegroep gekweekt met volledig kweekmedium, een (1S,3R)-RSL3⁴⁸ (RSL3, een ferroptose-activator, 100 nM) groep, en een RSL3 (100 nM) plus ferrostatine-1⁴⁹ (Fer-1, een ferroptoseremmer, 100 nM) groep. Door de bovenstaande experimentele stappen verkreeg de scanning elektronenmicroscoop 38 (aanvullende figuur 1), 43 (aanvullende figuur 2) en 44 (aanv.......

Discussion

De hier gepresenteerde methode is een nuttige stapsgewijze handleiding voor het toepassen van de 3D-reconstructietechniek, waarbij elektronenmicroscopie en beeldverwerkingstechnologie worden toegepast op het stapelen en segmenteren van 2D-tomografische beelden die zijn gegenereerd uit seriële ultradunne secties. Dit protocol benadrukt een beperking van 2D-beelden die kunnen worden aangepakt door 3D-visualisatie van de organel-ultrastructuur, wat de voordelen heeft van een sterke reproduceerbaarheid van de structuren op e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging		2020.2
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929