Nasonia-wespenembryo's werden na parasitering gedurende 12-24 uur ontleed uit Lucillia sericata-poppen en gewassen met alcohol en 10% natriumhypochlorietoplossing om kiemvrije embryo's te verkrijgen. Na het grootbrengen van de kiemvrije embryo's en het leveren van Nasonia-opfokmedium om in vitro te groeien en zich te ontwikkelen, werden kiemvrije Nasonia-volwassenen verkregen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Optimaliseren van de opfokprocedure van kiemvrije wespen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Aseptische kweektechnologie is een methode om insecten te kweken onder steriele of bijna steriele omstandigheden, die de invloed van externe micro-organismen op insectenmicrobiota effectief kan elimineren en zo de snelle ontwikkeling van onderzoek naar insectenmicrobiota kan bevorderen. Nasonia (wespengeslacht) is een sluipwespinsect dat veel voordelen heeft, zoals een korte levensduur, hoge genetische variatie, eenvoudige bediening, enz., En wordt veel gebruikt als een insectenmodelsysteem. In tegenstelling tot antibioticabehandeling, die alleen het aantal micro-organismen bij dieren kan verminderen, kunnen aseptische opfoktechnieken zowel de samenstelling als de hoeveelheid micro-organismen bij dieren regelen, waardoor de studie van gastheer-microbe-interacties verder wordt vergemakkelijkt. Eerdere versies van Nasonia-opfokmedium (NRM) hebben echter enkele defecten en problemen, zoals een complex en tijdrovend bereidingsproces, eenvoudige besmetting door bacteriën of schimmels en een korte opslagtijd. Daarom lost deze studie deze problemen op door de tools te optimaliseren die worden gebruikt in het NRM-voorbereidingsproces, opslagomstandigheden en componentverhoudingen. Het geoptimaliseerde medium kan opslag bij -20 °C gedurende ten minste 3 maanden mogelijk maken en de mogelijkheid van NRM-besmetting tijdens het voeren van steriele wespen elimineren. Dit verbetert verder de overlevingskans en het gezondheidsniveau van aseptische Nasonia, wat belangrijk is voor het gebruik van Nasonia als model voor microbieel onderzoek.
Inleiding
Kiemvrije dieren zijn dieren die geen detecteerbare levende micro-organismen en parasieten hebben1. Kiemvrije embryo's kunnen worden verkregen door de moeder onder aseptische omstandigheden te ontleden en vervolgens in barrièresystemenop te voeden 2. Dergelijke dieren kunnen worden gebruikt om de effecten van micro-organismen op dieren te bestuderen, zoals op de darmmicrobiota, het immuunsysteem en het metabolisme1. Met bepaalde technische middelen kunnen veel insecten en zelfs zoogdieren steriel worden gemaakt 3,4. Kiemvrije dieren hebben een unieke rol en zijn op grote schaal gebruikt in verschillende aspecten van microbiologisch onderzoek5. Het gebruik van kiemvrije Nasonia-wespen heeft bijvoorbeeld aangetoond dat micro-organismen gastheren kunnen helpen zich aan te passen aan nieuwe omgevingen onder langdurige exogene omgevingsstress 6,7.
Nasonia parasitoïden zijn kleine sluipwespen die hun eitjes injecteren in de poppen van vliegen4. Er zijn vier soorten Nasonia bekend, waaronder Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti en Nasonia oneida8. N. vitripennis is wereldwijd te vinden, terwijl de andere drie soorten een beperkt bereik hebben in Noord-Amerika4. Nasonia sluipwespen worden beschouwd als ideale modelinsecten vanwege hun kenmerken, zoals gemakkelijke teelt, korte voortplantingscyclus, gesequenced genoom en lange termijn diapause 8,9. Ze kunnen worden gebruikt om verschillende aspecten van insectenevolutie, genetica, ontwikkeling, gedrag en symbiose te bestuderen10. Bovendien kunnen Nasonia-sluipwespen ook helpen bij het bestrijden van schadelijke vliegen in de landbouw en ziekten11. Het succesvol opzetten van een steriel insectensysteem omvat twee belangrijke stappen: (1) sterilisatie van de embryo's en (2) levering van steriel voedsel aan de larven in vitro. Om steriel voedsel te verkrijgen, ontwikkelden Brucker en Bordenstein 12 in 2012 Nasonia-opfokmedium (NRMv1) door chemicaliën zoals antibiotica, bleekmiddel en foetaal runderserum te gebruiken om bacteriënte doden 12. De chemische sterilisatiemethode resulteerde echter in lage overlevings- en eclosiepercentages van N. vitripennis13. Vervolgens ontwikkelden Shropshire et al. in 2016 NRMv2 door een filtersterilisatiemethode te gebruiken in plaats van een chemische sterilisatiemethode om de gevaren van antibiotica en andere stoffen te elimineren en het fokproces te optimaliseren13. Helaas heeft deze methode nog steeds enkele nadelen, zoals de uitdagingen die gepaard gaan met het bereiden en gebruiken van het medium, evenals de risico's van verdrinking, ondervoeding of uitdroging voor de embryo's, larven en gesloten poppen14. Wang en Brucker14 hebben onlangs de Nasonia rearing media versie 3 (NRMv3) en de kiemvrije opfok versie 2 (GFRv2) protocollen verbeterd. Deze verbeteringen verminderden de kosten en het mediaverbruik. De NRMv3 heeft echter een zeer korte bewaartijd en is zeer gevoelig voor verontreiniging.
Voortbouwend op NRMv3 werden de opslagmethode van het NRM-voorbereidingsgereedschap en de nutriëntenverhouding in deze studie geoptimaliseerd. Deze methodologische verfijning vergemakkelijkt het gebruik van N. vitripennis als model voor microbioomstudies. Vergeleken met de NRMv3 ontwikkeld door Wang et al.14, verbetert het verbeterde hulpmiddel voor het knijpen van Sarcophaga bullata popa, een van de NRM-grondstoffen, de productie-efficiëntie van S. bullata-popweefselvloeistof aanzienlijk in vergelijking met de 60 ml spuit met een bodemgat die door Wang et al.14 wordt gebruikt. We pasten de voedingsstoffenverhouding van NRM aan, wat leidde tot een zekere toename van de overlevingskans van kiemvrije Nasonia-wespen zonder hun ontwikkelingstijd te beïnvloeden. Bovendien werd de NRM verpakt in centrifugebuizen met een kleine capaciteit (1,5 ml) en ingevroren in een koelkast van -20 °C om de opslagtijd te verlengen. Het is vermeldenswaard dat terwijl we de huisvlieg Lucilia sericata gebruikten als gastheer en bron voor NRM-voorbereiding, dit protocol waarschijnlijk kan worden aangepast voor andere Nasonia-gastheren die beschikbaar zijn in het laboratorium.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van kiemvrij Nasonia-opfokmedium
- Plaats de in de handel verkrijgbare L. sericata-poppen (zie materiaaltabel) op een oppervlak dat geschikt is voor alle poppen, zoals een dienblad of een vel papier. Gooi onderontwikkelde larven, donkere oude poppen, lege popschelpen, zaagsel of andere onzuiverheden weg. Houd alleen jonge poppen die bruinrood van kleur zijn en breng ze over naar een bekerglas (ongeveer 3.000-4.000 poppen).
OPMERKING: Na het uitvoeren van vele experimenten, bleek dat het medium gemaakt van de donkere oude poppen gemakkelijk donker werd en de ontwikkeling van kiemvrije wespen stopte. Dit fenomeen trad niet op bij het gebruik van de jonge bruinrode poppen om medium te produceren. De reden hiervoor is nog onduidelijk en vereist verder onderzoek om het te verifiëren. - Voeg voldoende gedeïoniseerd water toe aan het bekerglas om het hele oppervlak van de poppen te bedekken. Wikkel de mond van het bekerglas met tinfoil of gaas, schud het bekerglas om de onzuiverheden op het oppervlak van de poppen schoon te maken en giet vervolgens het water uit. Herhaal dit drie tot vijf keer.
- Plaats de gereinigde L. sericata-poppen in de filtertank van een knoflookpers, knijp hard en verzamel de weefselvloeistof van de L. sericata-poppen in een steriele centrifugebuis van 50 ml . Giet vervolgens de popdroesem uit en doe nieuwe poppen in de filtertank van de knoflookpers totdat ze allemaal zijn geperst.
OPMERKING: In vergelijking met het naaldextrusieapparaat dat door Wang et al.14 wordt gebruikt, is de knoflookpers handiger en kan de interstitiële vloeistof grondiger worden gescheiden. Deze vooruitgang legt de basis voor grootschalige productie en langdurige opslag van NRM. - Centrifugeer het mengsel gedurende 10 minuten bij 4 °C (25.000 x g). Na centrifugeren wordt het mengsel van onder naar boven in drie lagen gescheiden: sedimentlaag, eiwitlaag en vetlaag (figuur 1).
- Om verstopping tijdens filtratie te voorkomen, zuigt u de eiwitlaag op met behulp van een steriele naald van 18 G en brengt u deze over naar een nieuwe 50 ml conische steriele polypropyleencentrifugebuis.
- Voeg commercieel vloeibaar Drosophila-medium (zie materiaaltabel) toe aan het eiwitextract in een verhouding van 1:1.
OPMERKING: Handiger gecommercialiseerde L. sericata werd gebruikt als de gastheer en NRM-grondstof, vergeleken met NRMv3. Daarom werd de voedingsverhouding aangepast van 1:2 naar 1:1 op basis van NRMv3, dat meer geschikt was voor de groei en ontwikkeling van steriele Nasonia (figuur 2). - Filter het gemengde medium (Drosophila-medium en eiwitextract van L. sericata popa) met behulp van een vacuümfiltratiesysteem met verschillende poriegroottes (8, 1,2, 0,8 en 0,45 μm; zie materiaaltabel) om deeltjes van verschillende grootte te verwijderen. Om verstopping te voorkomen, vervangt u het filterpapier wanneer de stroom vertraagt.
OPMERKING: Het gebruik van een nieuwe steriele centrifugebuis van 50 ml is vereist voor elke filtratie. - Centrifugeer de vloeistof opnieuw bij 4 °C (15.000 x g) gedurende 10 minuten en steriliseer het bovennatuurlijke medium door een spuitfilter van 0,22 μm. Herhaal de bovenstaande stappen eenmaal.
- Bewaar het kweekmedium bij -20 °C na aliquotering (figuur 3A) voor langdurige opslag.
OPMERKING: Om besmetting en herhaaldelijk invriezen en ontdooien te voorkomen, wordt aanbevolen om elke tube NRM slechts één keer te openen wanneer het kweekmedium na verpakking wordt gebruikt (figuur 3A).
2. Kiemvrije eicelverzameling
- Om een stabiele man-vrouwverhouding bij nakomelingen te garanderen, plaatst u de poppen in een Drosophila-injectieflacon tijdens het popstadium in een verhouding van 50 vrouwtjes tot 15 mannetjes vanwege hun haploïde genetische kenmerken (mannetjes ontwikkelen zich uit haploïde cellen, terwijl vrouwtjes zich ontwikkelen uit diploïde cellen die het gevolg zijn van bevruchte eieren)4,15.
- Nadat je bij volwassenen bent gekomen, laat je de mannetjes en vrouwtjes 1,5 dag paren en doe je vervolgens ongeveer 40 L. sericata-poppen in de injectieflacon. Gebruik binnen 12-24 uur na parasitering een steriele ontleednaald om het ene uiteinde van de popschaal voorzichtig te openen onder een stereomicroscoop (figuur 4).
- Houd het andere uiteinde met de hand vast en zoek de wespenembryo's. Gebruik een ontleednaald om embryo's van het oppervlak van het L. sericata-popweefsel over te brengen naar een steriele celzeef met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)14.
OPMERKING: Oudere L. sericata-poppen moeten worden gebruikt voor parasitisme omdat het droge L. sericata-popweefsel gemakkelijker embryo's kan overbrengen . Om de soepele overdracht van eieren van het L. sericata-popweefseloppervlak te garanderen, moet u voorzichtig zijn om het weefsel niet te doorboren wanneer de ontleednaald de popbehuizing opent, zodat de interstitiële vloeistof niet naar buiten stroomt.
- Plaats 20-30 embryo's op een celzeef en was ze gelijkmatig met 1.000 μL 10% commerciële natriumhypochlorietoplossing (zie tabel met materialen), gevolgd door nog een wasbeurt met 1.000 μL 1x steriele PBS. Was vervolgens eenmaal met 1.000 μL 70% ethanoloplossing en was drie keer met 1.000 μL 1x steriele PBS.
- Plaats eerst een polypropyleen gaasplaat met een diameter van 5 mm (zie materiaaltabel) die met 1x PBS is voorbevochtigd in een plaat met 24 putten. Borstel vervolgens met een gesteriliseerde kleine borstel de wespenembryo's voorzichtig op de celzeef op het polypropyleen gaasvel. Dit kan voor alle vier de putten in een verticale kolom van de 24-putplaat.
3. Kiemvrije wespenopfok
- Voeg 50 μL NRM toe aan elke put in een laminaire stroomkap. Om een vochtige omgeving voor groei te behouden, voegt u 1 ml steriel water toe tussen elke put in de 24-putplaat. Een klein bekerglas met 30 ml steriel water kan ook in de steriele plastic doos van 5 L met de 24-putplaat worden geplaatst.
- Bewaar gedurende het hele experiment de steriele plastic doos en de 24-putplaat in een klimaatkamer bij een constante temperatuur van 25 ± 2 °C en onder constant licht.
- Voordat u nrm elke dag overbrengt en toevoegt, ontdooit u de bevroren NRM op een laminaire flowbank. Gebruik in een steriele omgeving een met alcohol gedesinfecteerd pincet om het polypropyleengaas met larven erop van de ene put naar de andere over te brengen. Voeg ten slotte 50 μL NRM toe die in evenwicht is gebracht met kamertemperatuur (figuur 3B). Herhaal de bovenstaande bewerkingen elke dag totdat poppen worden waargenomen.
OPMERKING: Met de ontwikkeling van wespen moet de hoeveelheid NRM op de juiste manier worden verhoogd om ervoor te zorgen dat de kiemvrije wespen voldoende voeding hebben. Zo werden de vierde instarlarven voorzien van 60 tot 70 μL NRM. Omdat verschillende ontwikkelingsstadia naast elkaar kunnen bestaan in dezelfde put, gebruik dan een gesteriliseerde borstel om de poppen over te brengen. Voeg een kleine hoeveelheid NRM toe aan de resterende larven. Gebruik aseptische technieken om microbiële invasie en vervuiling te voorkomen. - Na 9 tot 11 dagen voeden ontwikkelt meer dan 80% van de larven zich tot witte of gele poppen. Verplaats op dit moment het filter naar een schone putplaat en stop met het toevoegen van kweekmedium om te wachten op eclosie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De voorbereidingsefficiëntie van NRM werd sterk verbeterd door het verbeteren van de voorbereidingstools. Bovendien werd het probleem van NRM-vervuiling in het voedingsproces geëlimineerd door de strategie en conserveringsmethode te optimaliseren. Tegelijkertijd had de aangepaste NRM een meer geschikte voedingsverhouding voor de groei en ontwikkeling van kiemvrije wespen met L. sericata als gastheren. De overlevingskans van kiemvrije wespen van larven tot poppen was significant verbeterd in vergelijking met kiem...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met de toepassing van high-throughput detectietechnologieën zoals genomica en metabolomica, hebben onderzoekers zich geleidelijk gerealiseerd dat er een enorme genetische diversiteit en metabole complexiteit is in de darmmicrobiota16. Deze symbiotische bacteriën zijn nauw verwant aan verschillende fysiologische of pathologische toestanden, zoals het voedingsmetabolisme van de gastheer, tumoren, immuniteit en veroudering door complexe interacties met de gastheer17. Het onder...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Financiering: dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation of China (32270538), het National Key R&D Program of China (2022YFF0710603), de Natural Science Foundation of Beijing (6222046) en de CAS strategische financiering via het CAS-CSIRO financieringsprogramma (152111KYSB20210011) toegekend aan G.H.W. Auteursbijdragen: alle auteurs ontwikkelden de reikwijdte en focus van de review en droegen bij aan het schrijven van het manuscript.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
| 10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
| 24 well-plate | NEST | 702001 | |
| 8, 1.2, 0.8, en 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
| Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
| Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
| Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
| Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
| Garlic press | Taobao | Geen catalogusnummers | Koop op Taobao |
| Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | Geen catalogusnummers | Koop op Taobao |
| Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
| Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
| Tweezers | SALMART | A109001-56 |
Referenties
- Diviccaro, S., et al. Exploring the impact of the microbiome on neuroactive steroid levels in germ-free animals. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12551(2021).
- Pang, X., et al. Inter-species transplantation of gut microbiota from human to pigs. The ISME Journal. 1 (2), 156-162 (2007).
- Uzbay, T. Germ-free animal experiments in the gut microbiota studies. Current Opinion in Pharmacology. 49, 6-10 (2019).
- Zhu, Z., Liu, Y., Hu, H., Wang, G. -H. Nasonia-microbiome associations: a model for evolutionary hologenomics research. Trends in Parasitology. 39 (2), 101-112 (2022).
- Li, J., Wei, H. Establishment of an efficient germ-free animal system to support functional microbiome research. Science China Life Sciences. 62 (10), 1400-1403 (2019).
- Wang, G. H., et al. Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure. Cell Host Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).
- Wang, G. H., Dittmer, J., Douglas, B., Huang, L., Brucker, R. M. Coadaptation between host genome and microbiome under long-term xenobiotic-induced selection. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Dittmer, J., Brucker, R. M. When your host shuts down: larval diapause impacts host-microbiome interactions in Nasonia vitripennis. Microbiome. 9 (1), 85(2021).
- Dittmer, J., et al. Disentangling a holobiont-recent advances and perspectives in Nasonia wasps. Frontiers in Microbiology. 7, 1478(2016).
- Brooks, A. W., Kohl, K. D., Brucker, R. M., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. Phylosymbiosis: relationships and functional effects of microbial communities across host evolutionary history. PLoS Biology. 14 (11), e2000225(2016).
- Heavner, M. E., et al. Partial venom gland transcriptome of a Drosophila parasitoid wasp, Leptopilina heterotoma, reveals novel and shared bioactive profiles with stinging Hymenoptera. Gene. 526 (2), 195-204 (2013).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. In vitro cultivation of the hymenoptera genetic model, Nasonia. PLoS One. 7 (12), e51269(2012).
- Shropshire, J. D., van Opstal, E. J., Bordenstein, S. R. An optimized approach to germ-free rearing in the jewel wasp Nasonia. PeerJ. 4, e2316(2016).
- Wang, G. H., Brucker, R. M. An optimized method for Nasonia germ-free rearing. Scientific Reports. 12 (1), 219(2022).
- Brucker, R. M., Bordenstein, S. R. The hologenomic basis of speciation: gut bacteria cause hybrid lethality in the genus Nasonia. Science. 341 (6146), 667-669 (2013).
- Fontaine, C. A., et al. How free of germs is germ-free? Detection of bacterial contamination in a germ free mouse unit. Gut Microbes. 6 (4), 225-233 (2015).
- Mazmanian, S. K., Liu, C. H., Tzianabos, A. O., Kasper, D. L. An immunomodulatory molecule of symbiotic bacteria directs maturation of the host immune system. Cell. 122 (1), 107-118 (2005).
- Weersma, R. K., Zhernakova, A., Fu, J. Interaction between drugs and the gut microbiome. Gut. 69 (8), 1510-1519 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
