Methodenartikel

Goedkoop elektro-encefalografisch opnamesysteem gecombineerd met een millimetergrote spoel om het muizenbrein in vivo transcraniaal te stimuleren

DOI:

10.3791/65302

⸱

26 mei 2023

 ,  ,  , 
1Bioengineering and Bioinformatics, Graduate School of Information Science and Technology, Hokkaido University, 2Bioengineering and Bioinformatics, Division of Information Science and Technology, Hokkaido University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een goedkoop elektro-encefalografisch registratiesysteem in combinatie met een millimetergrote spoel wordt voorgesteld om transcraniële magnetische stimulatie van het muizenbrein in vivo aan te sturen. Met behulp van conventionele schroefelektroden met een op maat gemaakt, flexibel, multi-elektrode arraysubstraat, kan multi-site opname worden uitgevoerd vanuit het muizenbrein als reactie op transcraniële magnetische stimulatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een goedkoop elektro-encefalografisch (EEG) opnamesysteem wordt hier voorgesteld om transcraniële magnetische stimulatie (TMS) van het muizenbrein in vivo aan te sturen, met behulp van een millimetergrote spoel. Met behulp van conventionele schroefelektroden in combinatie met een op maat gemaakt, flexibel, multi-elektrode arraysubstraat, kan multi-site opname worden uitgevoerd vanuit het muizenbrein. Daarnaast leggen we uit hoe een millimetergrote spoel wordt geproduceerd met behulp van goedkope apparatuur die meestal in laboratoria wordt aangetroffen. Praktische procedures voor het fabriceren van het flexibele multi-elektrode arraysubstraat en de chirurgische implantatietechniek voor schroefelektroden worden ook gepresenteerd, die nodig zijn om ruisarme EEG-signalen te produceren. Hoewel de methodologie nuttig is voor het opnemen vanuit de hersenen van elk klein dier, richt dit rapport zich op elektrode-implementatie in een verdoofde muizenschedel. Bovendien kan deze methode eenvoudig worden uitgebreid naar een wakker klein dier dat via een gemeenschappelijke adapter met vastgebonden kabels is verbonden en tijdens het opnemen met een TMS-apparaat aan het hoofd is bevestigd. De huidige versie van het EEG-TMS-systeem, dat maximaal 32 EEG-kanalen kan bevatten (een apparaat met 16 kanalen wordt gepresenteerd als een voorbeeld met minder kanalen) en één TMS-kanaalapparaat, wordt beschreven. Bovendien worden typische resultaten verkregen door de toepassing van het EEG-TMS-systeem op verdoofde muizen kort gerapporteerd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transcraniële magnetische stimulatie (TMS) is een veelbelovend hulpmiddel voor menselijke hersenwetenschap, klinische toepassing en diermodelonderzoek vanwege de niet-/ lage invasiviteit. Tijdens het vroege stadium van TMS-toepassingen was de meting van het corticale effect als reactie op single- en paired-pulse TMS bij mens en dier beperkt tot de motorische cortex; Gemakkelijk meetbare output was beperkt tot motorische geëvoceerde potentialen en geïnduceerde myo-elektrische potentialen waarbij de motorische cortex 1,2 betrokken was. Om de hersengebieden uit te breiden die kunnen worden gemeten door TMS-modulatie, werd elektro-encefalografische (EEG) -opname geïntegreerd met single- en paired-pulse TMS als een nuttige methode om direct de prikkelbaarheid, connectiviteit en spatiotemporale dynamiek van gebieden in de hele hersenen te onderzoeken 3,4,5. Zo is de gelijktijdige toepassing van TMS- en EEG-registratie (TMS-EEG) op de hersenen gebruikt om verschillende oppervlakkige corticale hersengebieden van mens en dier te onderzoeken om intracorticale neurale circuits te onderzoeken (zie Tremblay et al.6). Bovendien kunnen TMS-EEG-systemen worden gebruikt om aanvullende corticale spatiotemporale kenmerken te onderzoeken, waaronder de voortplanting van signalen naar andere corticale gebieden en het genereren van oscillerende activiteit 7,8.

Het werkingsmechanisme van TMS in de hersenen blijft echter speculatief vanwege de niet-invasiviteit van TMS, wat onze kennis beperkt over hoe de hersenen functioneren tijdens TMS-toepassingen. Daarom zijn invasieve translationele studies bij dieren, variërend van knaagdieren tot mensen, van cruciaal belang om het mechanisme van de effecten van TMS op neurale circuits en hun activiteit te begrijpen. Met name voor gecombineerde TMS-EEG-experimenten bij dieren is voor kleine dieren geen gelijktijdig stimulatie- en meetsysteem ontwikkeld. Daarom zijn experimentalisten verplicht om een dergelijk systeem met vallen en opstaan te construeren volgens hun specifieke experimentele vereisten. Bovendien zijn muismodellen nuttig onder andere in vivo diersoortmodellen omdat veel transgene en stamgeïsoleerde muizenstammen beschikbaar zijn als biologische hulpbronnen. Een handige methode om een TMS-EEG-gecombineerd meetsysteem voor muizen te bouwen, zou dus wenselijk zijn voor veel neurowetenschappelijke onderzoekers.

Deze studie stelt een TMS-EEG-gecombineerde methode voor die kan worden toegepast voor gelijktijdige stimulatie en registratie van het muizenbrein, het belangrijkste type transgeen dier dat in onderzoek wordt gebruikt, en dat gemakkelijk kan worden geconstrueerd in typische neurowetenschappelijke laboratoria. Ten eerste wordt een goedkoop EEG-registratiesysteem beschreven met behulp van conventionele schroefelektroden en een flexibel substraat om reproduceerbaar een elektrode-arraypositie toe te wijzen in elk experiment. Ten tweede wordt een magnetisch stimulatiesysteem geconstrueerd met behulp van een millimetergrote spoel, die gemakkelijk op maat kan worden gemaakt in typische laboratoria. Ten derde registreert het TMS-EEG-gecombineerde systeem neurale activiteit als reactie op geluid en magnetische stimulatie. De methode die in deze studie wordt gepresenteerd, kan de mechanismen onthullen die specifieke aandoeningen bij kleine dieren genereren, en de resultaten die in de diermodellen zijn verkregen, kunnen worden vertaald om de overeenkomstige menselijke aandoeningen te begrijpen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de huidige studie werden alle dierproeven uitgevoerd volgens de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Hokkaido University. C57BL/6J muizen, twee mannelijke en drie vrouwelijke, 8 tot 10 weken oud, werden gebruikt voor de huidige studie. Dit is een terminale procedure. De dieren werden verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen).

1. Flexibel tweedimensionaal arrayontwerp en -constructie

  1. Bereid het vereiste aantal miniatuurschroefelektroden voor (roestvrij, SUS XM7; zie materiaaltabel) met de volgende structurele eigenschappen voor gebruik als EEG-registratie- en referentie-elektroden: nominale diameter, neklengte en kopdiameter van respectievelijk 0,6 mm, 1,5 mm en 1,1 mm (figuur 1A).
    OPMERKING: In deze studie werden 16 miniatuur schroefelektroden gebruikt.
  2. Maak een blauwdruk van een afgedrukt schakelschema op een flexibel substraat volgens de onderstaande stappen.
    1. Maak een tweedimensionaal (2D) elektrodepadpatroon op een flexibel substraat (hele grootte, 41,2 mm × 19,9 mm; zie Materiaaltabel) voor de uit te lezen schroefelektroden. Ontwerp de opstelling van de 2D-elektrode. Figuur 1B toont de specifieke opstellingen die in dit onderzoek zijn gebruikt en de relatieve coördinaten vanaf een basislijnpunt (kruis gemarkeerd bij de oorsprong [0, 0]).
      OPMERKING: In deze studie, om neurale activiteit in de auditieve cortex in de temporale kwabben te registreren, was de plaatsing van elektroden in de laterale-naar-mediale (horizontale) richting langer dan die in de rostral-naar-caudale (verticale) richting (figuur 1B).
    2. Zorg ervoor dat voor de EEG-opname-elektroden elke koperen pad (zie materiaaltabel) op het flexibele substraat een ringvorm heeft met een buitendiameter van 1,3 mm en een binnendiameter van 0,8 mm (figuur 1C, links). Maak een klein gaatje (0,8 mm diameter) in het midden voor elke schroefelektrode om door het substraat te gaan. Voor de referentie-elektroden moet elke koperen pad een vierkante vorm hebben met een zijlengte van 1,4 mm; maak op dezelfde manier een klein gat (0,8 mm diameter) in het midden voor elke schroef om door de vierkante pad op het substraat te gaan (figuur 1C, rechts).
    3. Om vervolgens een connector voor opbouwmontage te solderen (figuur 1D, links), ontwerpt u uitleespads (2D-array) die naar de connector leiden (figuur 1D, rechts). Gebruik bijvoorbeeld een connector met 2 × 10 pinnen en een steek van 1,27 mm tussen aangrenzende pinnen (figuur 1D, rechts).
    4. Bedraad de schroefelektrodepads en verbindingspads met behulp van zowel de oppervlakte- als de ruglaag met een lijnbreedte van 0,03 mm en een lijninterval van 0,03 mm (dunne lijnen in figuur 1E).
    5. Om de referentie- en massakanalen met de versterker te verbinden, sluit u bovendien de elektrodepads voor de referentie- en massa-elektroden aan op het geïsoleerde deel aan de buitenkant van de flexibele 2D-array (twee verticale rechthoeken aangegeven met "G" en "HR" aan de onderkant van figuur 1E). Vergeet na het bepalen van de referentie- en massakanalen niet om de elektrodepads aan de overeenkomstige connectoren te solderen (zie stap 2.1).
    6. Ontwerp een blootgesteld gebied dat niet is bedekt met een beschermlaag (polyimidelaag) op de juiste manier. Stel de connectorpads in de oppervlaktelaag bloot terwijl u de schroefelektrodepads in zowel de oppervlakte- als de achterlaag blootlegt. Het hele elektrodeontwerp, de afmetingen en de gefabriceerde flexibele 2D-array worden geïllustreerd in figuur 1E en de afbeelding van een gefabriceerd substraat wordt weergegeven in figuur 1F.
    7. Zorg er in het bovenste elektrodegedeelte (kopgedeelte) van de flexibele 2D-array voor dat de drielaagse structuur van boven naar beneden bestaat uit het volgende (totale dikte van 49,0 μm): een bovenste koperlaag (12,0 μm dikte), een middelste laag kernpolyimide (25,0 μm) en een onderste koperlaag (12,0 μm) (figuur 1G, boven).
    8. Ets de koperlagen op het boven- en onderoppervlak van het substraat, bijvoorbeeld met behulp van nat etsen en de standaard fabricagetechniek9.
    9. Zorg er in het onderste vierkante padgedeelte (connectorgedeelte) van de flexibele 2D-array voor dat de zeslaagse structuur bestaat uit drie lagen, waaronder een bovenste koperlaag (12,0 μm dikte), een middelste kern polyimidelaag (25,0 μm) en een onderste koperlaag (12,0 μm), die zijn ingeklemd door beschermende polyimidelagen, inclusief boven- en onderkant (beide 12,5 μm) lagen. Bevestig een 2 mm polyimide plaat vanaf de onderkant als versterkend materiaal (figuur 1G, onder).
      OPMERKING: Om de flexibiliteit te behouden, is de versterkende polyimideplaat niet gemonteerd op het nekgedeelte van de flexibele 2D-array tussen de kop en het connectorgedeelte.
    10. Op dezelfde manier etst u in het verbindingsgedeelte de koperen en beschermende polyimidelagen aan de bovenkant met behulp van nat etsen en de standaard fabricagetechniek.
      OPMERKING: Het totale gewicht van het gefabriceerde, flexibele 2D-arrayapparaat, inclusief de connector, is 0,84 g. Na het ontwerpen van een lay-out voor een flexibele 2D-array, worden de substraten van een commerciële fabrikant (zie Materiaaltabel) soms aanbevolen voor het gemak.

figure-protocol-1
Figuur 1: Onderdelen van de flexibele tweedimensionale (2D) array voor elektro-encefalografische (EEG) opname en het gefabriceerde apparaat inclusief de array. (A) De miniatuurschroefelektrode die is ingebed in de schedel van de muis. (B) De ontworpen elektrodepads voor het meten van hersenactiviteit (groene cirkels) en het referentiekanaal (vierkant rechtsonder). De relatieve coördinaten van de elektrodepads vanaf een referentiepunt (kruisteken) bij de oorsprong (0, 0) worden weergegeven; De grootte in millimeters wordt tussen haakjes weergegeven. De middelste coördinaten van de elektrodepads zijn symmetrisch ten opzichte van de verticale as die door het kruisteken loopt. (C) De elektrodepads en boorgaten voor een opname-elektrode (links) en een referentie-elektrode (rechts) worden geïllustreerd. (D) Een opbouwconnector (2 × 10 pinnen) die wordt gebruikt voor de flexibele 2D-array (links) en het patroon en de grootte van de ontworpen pads op het substraat (rechts). (E) Ontworpen blauwdruk met de grootte van elk onderdeel in millimeters. (F) Afbeelding van een gefabriceerd substraat aangegeven door de blauwdruk in E. (G) De laagstructuur van de flexibele 2D-array (kop- en connectordelen). De boven- en zijaanzichten van de schroefelektrodepads (boven) en uitleeskussens (onder) worden geïllustreerd. De kop en de verbindingsdelen zijn samengesteld uit respectievelijk een drielaagse structuur (boven) en een zeslaagse structuur (onder). Bovendien bestaat het nekdeel uit een vijflaagse structuur; Een beschermende polyimidelaag is op het boven- en achteroppervlak gemonteerd en de versterkende polyimideplaat is niet op het nekgedeelte gemonteerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Adapterconstructie en kanaalmapping

  1. Voer de adapterconstructie uit volgens de onderstaande stappen.
    1. Spreid de soldeerflux op de 2× 10-pins, opbouwconnector (figuur 1D, links) en de connectorpads van de 2D-array (figuur 1D, rechts) (zie materiaaltabel) op het flexibele substraat.
    2. Soldeer de 2× 10-pins connector voor opbouwmontage aan de connectorpads. Bevestig met name de verbinding tussen de twee pads op het onderste deel van de 2D-array en de twee connectorpennen die worden gebruikt als referentie- en massakanalen (figuur 2A).
    3. Sluit elk van de twee pads aan op afzonderlijke looddraden om basislijnsignalen naar een extern punt te voeren (bijvoorbeeld een massapunt dat is aangesloten op het massakanaal van het meetsysteem; Figuur 2A).
      OPMERKING: In deze studie werd echter een van de ronde elektrodepads met schroefelektroden gebruikt als referentie-elektrode in plaats van een vierkante elektrode in het connectorgedeelte.
    4. Bedek na het solderen de soldeerpunten met epoxyhars (zie materiaaltabel) om de blootgestelde punten te beschermen en kortsluiting te voorkomen.
  2. Sluit de connectorkabel en hoofdversterker vast volgens de onderstaande stappen.
    1. Bereid een isolatie-verdringingsconnector (IDC) voor met 2 × 10 pinnen en een steek van 1,27 mm (figuur 2B, linksboven) en een platte 20-pins lintkabel (zie materiaaltabel) met een steek van 0,635 mm (figuur 2B, linksonder). Knip de platte lintkabel op de gewenste lengte (bijvoorbeeld 40 cm).
    2. Krimp de IDC en het ene uiteinde van de platte lintkabel met een IDC-krimpgereedschap (figuur 2B, rechtsboven) (zie materiaaltabel).
    3. Scheid elke lijn van het andere uiteinde van de kabel tot ongeveer 15 mm van het uiteinde van de punt met behulp van een frees. Verwijder de isolatie op 3 mm van het uiteinde van de punt.
    4. Sluit de gekrompen IDC aan op de platte lintkabel en de 2 × 10-pins connector is gesoldeerd aan het flexibele substraat (figuur 2C).
    5. Bevestig de overeenkomst tussen de opname-elektrode en de gescheiden lijn van de kabel. Zorg ervoor dat elke gebruikte regel geen onjuiste verbindingsfout veroorzaakt.
    6. Soldeer de blootgestelde koperdraden van de afzonderlijke lijnen die overeenkomen met de uitgang van elke elektrode aan de 20-pins connector (1,25 mm steek) van het meetsysteem, inclusief de hoofdversterker (figuur 2B, rechtsonder).
    7. Bevestig na het solderen de geleiding tussen de schroefelektrodepads en de connectorpennen met behulp van een testapparatuur (bijvoorbeeld een LCR-meter; zie materiaaltabel).
    8. Bedek de soldeerpunten met epoxyhars en afschermingstape om ze te beschermen tegen schade en contact met andere signaallijnen te voorkomen.
    9. Plak met epoxyhars een dunne roestvrijstalen staaf (diameter: 1,1-1,2 mm; lengte: 100 mm) aan de achterkant van het verbindingsgedeelte van de 2D-array op het flexibele substraat.
      OPMERKING: Deze roestvrijstalen staaf kan tijdens experimenten worden vastgepakt door een micromanipulatorhouder (figuur 2C).
    10. Bevestig ten slotte de toewijzing tussen de schroefelektroden en signaaluitgangskanalen (figuur 2D).

figure-protocol-2
Figuur 2: Het construeren van de adapter voor een tweedimensionale (2D) elektrode-array op het flexibele substraat en het in kaart brengen van opnamekanalen. (A) In het connectorgedeelte zijn de referentie- en massakanalen met looddraden verbonden met de onderste elektrodepads. Als de referentie- en massakanalen van tevoren zijn bepaald, moeten de kanalen tijdens de ontwerpfase worden aangesloten op de overeenkomstige onderste elektrodepads. In dergelijke gevallen is het solderen van looddraden aan de kanalen en elektrodepads niet nodig. (B) Isolatieverplaatsingsconnectoren (linksboven) worden aan het ene uiteinde van de platte kabel gekrompen (linksonder) om de connector van de meetversterker te verbinden (rechtsboven). Alle lijnen die overeenkomen met de te gebruiken kanalen worden gesoldeerd aan de groene connectoren (rechtsonder). In dit geval, omdat elke groene connector die op de hoofdversterker is aangesloten, is toegewezen voor een achtkanaalsmeting, zijn ten minste twee connectoren nodig om 16-kanaals hersenactiviteitssignalen op te nemen. De gesoldeerde punten zijn bedekt met epoxyhars en afschermingstape om contact met andere signaallijnen te voorkomen. (C) De connector en de gefabriceerde kabel worden op het oppervlak van het flexibele 2D-arraysubstraat geplaatst. De dunne roestvrijstalen staaf is bevestigd aan de achterkant van de flexibele ondergrond. (D) De ruimtelijke locaties van opnamekanalen op het hersenoppervlak van de muis en de kanaalkaarten voor elk punt voor het meetsysteem worden weergegeven. In dit geval zijn er 16 opnamekanalen met schroefelektroden (rode cirkels), hoewel het totale aantal mogelijke opnamelocaties 32 is. De andere 16 niet-opnamekanalen worden ook weergegeven als groene cirkels op het hersenoppervlak. In de kaartgrafiek geven "G" en "R" de kanalen aan die zijn ontworpen voor respectievelijk grond- en referentie-elektroden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Dierchirurgie

  1. Bereid de steriele chirurgische omgeving voor.
    1. Draag beschermende uitrusting, zoals latex handschoenen, tijdens de hele experimentele procedure met dieren.
    2. Steriliseer het stereotaxische apparaat en de chirurgische instrumenten (zie materiaaltabel).
    3. Na het steriliseren van de chirurgische instrumenten, was ze met steriele zoutoplossing.
  2. Verdoof de dieren.
    1. Meet het gewicht van de muis vóór de operatie. Dien atropinesulfaat (0,04 mg/kg; zie tabel met materialen) toe via intraperitoneale injectie.
    2. Verdoof de muis via een intraperitoneale injectie van een mengsel van medetomidine (0,3 mg/kg), midazolam (4,0 mg/kg) en butorphanol (5,0 mg/kg).
    3. Bevestig de diepte van de verdoving door het niveau van respons door in de teen te knijpen.
      OPMERKING: De anesthesie zal na ongeveer 40 minuten slijten. Als de muis reageert op een teenknijp, dien dan dezelfde dosis van het verdovingsmengsel toe via een intraperitoneale injectie.
  3. Bereid je voor op de elektrode-implantatieoperatie.
    1. Knip de snorharen van de muis om haptisch gevoel te voorkomen.
    2. Smeer beide ogen in met een oogzalf om uitdroging te voorkomen. Sluit de oogleden om het gezichtsvermogen te belemmeren en de sluiting te behouden door de bovenste en onderste oogleden vast te houden met reparatietape.
    3. Scheer het haar op het hoofd van de muis met een elektrische tondeuse. Steek een thermometer in het rectum en houd de lichaamstemperatuur op 37 °C met behulp van een verwarmingskussen.
    4. Dien lidocaïnehydrochloride toe als een lokaal verdovingsmiddel aan het deel van de hoofdhuid van de muis dat zal worden ingesneden.
    5. Insnijd de hoofdhuid van de muis met behulp van een scalpel of chirurgische schaar in een rostral-to-caudale richting (oppervlaktegrootte: 7 × 10 mm2).
    6. Knijp de hoofdhuid in de buurt van het ingesneden deel met een pincet en lift. Verwijder het zichtbare membraan op de schedel met behulp van een scalpel of een chirurgische schaar. Breek de bloedvaten rond de ogen niet tijdens de operatie.
    7. Grijp de huid in de buurt van beide centra van de incisielijn van de hoofdhuid met een tang en verbreed het ingesneden deel om de bovenkant van de schedel wijd bloot te leggen.
    8. Bevestig de volledige verwijdering van alle membranen op het oppervlak van de schedel en het weefsel rond lambda met een chirurgische schaar.
    9. Maak het schedeloppervlak nat met fysiologische zoutoplossing om de zichtbaarheid van het hersenoppervlak onder de schedel te verbeteren en de transversale sinus te lokaliseren.
      OPMERKING: Wanneer u schroefelektroden in de schedel implanteert, vergeet dan niet om ze niet boven en in de transversale sinus in te bedden.

4. Elektrode-implantatie

  1. Bevestig de roestvrijstalen staaf die is gemonteerd op de 2D-elektrode-array aan de achterkant van het flexibele substraat aan een micromanipulator. Plaats het flexibele substraat op de schedel.
  2. Pas de locatie van kanalen (Chs) 3 en 14 (Figuur 2D) op de array aan zodat deze binnen de inferieure colliculus passen.
    OPMERKING: De inferieure colliculus bevindt zich langs de transversale sinus. We raden aan om de locatie van de inferieure colliculus van tevoren te bevestigen met behulp van een muizenhersenatlas.
  3. Teken kleine cirkels op de locaties van hoofdstuk 3, 8, 9 en 14 (figuur 2D) op de schedel met een permanente markering om te gebruiken als oriëntatiepunten.
  4. Droog het schedeloppervlak om de hechting aan het tandcement te verbeteren en om de 2D-elektrode-array op het flexibele substraat elektrisch te isoleren van de muizenschedel.
  5. Breng tandcement (ongeveer 1 mm dikte; zie materiaaltabel) aan op het schedeloppervlak. Wacht na het aanbrengen van het tandcement ongeveer 30 minuten totdat het is uitgehard.
  6. Lijn het flexibele substraat uit volgens de kleine cirkelvormige markeringen op het oppervlak van de schedel.
  7. Lijn de punt van een tandartsboor uit op elk elektrodepadgat op het flexibele substraat. Boor voorzichtig in de schedel door elk van de gaten van de elektrodepad.
  8. Schroef elk van de miniatuurschroefelektroden door de geboorde gaten in de schedel met behulp van een speciale schroevendraaier voor miniatuurschroeven.
  9. Krimp de kop van de schroefelektrode en de elektrodepad stevig vast. Meet ten slotte de geleiding tussen elke schroefelektrode en de connector met testapparatuur (bijvoorbeeld een LCR-meter) om de elektrische geleidbaarheid te bevestigen.

5. Ontwerp en constructie van kleine spoelen

  1. Ontwerp een donutvormige schijf (zie aanvullend coderingsbestand 1) met een gat in het midden (binnendiameter: 2 mm; buitendiameter: 7 mm; dikte: 1 mm) met behulp van CAD-software (computerondersteund ontwerp) (zie materiaaltabel).
  2. Print met behulp van een 3D-printer twee schijven (figuur 3A, links) van niet-hittebestendig materiaal (bijv. polymelkzuurfilament); Niet-hittebestendig materiaal is niet altijd nodig (zie hieronder).
  3. Trim een permalloy-45 staaf (diameter: 2 mm; zie materiaaltabel) om een korte schacht te vormen (lengte: 60 mm).
  4. Steek de as in elk gat van de twee 3D-geprinte schijven (figuur 3A, rechts). Plaats één schijf aan het einde van de as en de andere op 11 mm van het uiteinde, wat resulteert in een afstand van 10 mm tussen de twee schijven. Hecht de schijven met instant lijm (zie Materiaaltabel).
  5. Bevestig het uiteinde van de as zonder schijf aan een botsdriver (figuur 3B). Bevestig een kleine magneet aan de permalloy-45 as. Plaats een hall-effect sensor in de buurt van de magneet op 5 mm van de as. Sluit de hall-effect sensor aan op een data-acquisitie (DAQ; zie Materiaaltabel) systeem.
  6. Om het aantal windingen te tellen, bereidt u een computerprogramma voor (zie materiaaltabel) dat uitgangssignalen van de hall-effectsensor via het DAQ-systeem analyseert.
  7. Sluit een dunne koperdraad (diameter: 0,16 mm) aan op de as en hecht zich met instantlijm aan het bovenste uiteinde van de draad.
  8. Wind met behulp van de impactdriver de koperdraad 1.000 omwentelingen tussen de twee schijven. Hoewel de rotatiesnelheid willekeurig is, wordt meestal ongeveer 5 rotaties per seconde gebruikt. Hecht vervolgens aan de wonddraad met instantlijm.
  9. Maak de twee schijven los van de schacht. Als de schijven sterk aan de as zijn bevestigd, smelt u de schijven met behulp van een warmtepistool.
  10. Bedek de spoel met epoxyhars om het oppervlak te isoleren en vast te zetten. Snijd vervolgens het afgewikkelde schachtgedeelte af als overmaat.
  11. Zorg ervoor dat de verkregen spoel een hoogte heeft van 10 mm en een diameter van 6 mm (figuur 3B, links). Voor spoelmanipulatie bouwt u een spoelhouder (figuur 3C, rechts) of bevestigt u een roestvrijstalen staaf aan de spoel (hier niet weergegeven).
  12. Meet de weerstand en inductie van de spoel met behulp van een LCR-meter (zie materiaaltabel). De hier gebruikte spoel had bijvoorbeeld een gelijkstroom (DC) weerstand van 18,3 Ω en een inductie van 7,9 mH bij 1 kHz wisselstroom (AC) ingang. De AC-eigenschappen (weerstand en inductie) zijn weergegeven in figuur 3D.
  13. Gebruik een functiegenerator om een bipolaire blokgolf op de spoel toe te passen. De typische amplitude van de ingangsspanning is 20 V via een bipolaire voeding met een 10x versterking, na een 2 V generatoruitgang. De resulterende golfvorm is een bipolaire blokgolf met een geschatte amplitude van 20 V (d.w.z. een piek-piekspanning van 40 V) (figuur 3E).
  14. Meet de magnetische fluxdichtheid met behulp van de hall-effect sensor en het DAQ-systeem. In dit geval was de magnetische fluxdichtheid (B) van de spoel bijvoorbeeld 113,6 ±2,5 mT (gemiddelde ± SEM) wanneer de spoelbodem in contact stond met de hall-effectsensor (figuur 3F).

figure-protocol-3
Figuur 3: Kleine spoel voor magnetische stimulatie. (A) Driedimensionale (3D)-geprinte schijf (links). Twee identieke schijven zijn vastgehecht aan de permalloy-45 as; De ene bevindt zich aan het einde van de schacht en de andere bevindt zich op 10 mm afstand (rechts). (B) Opstelling voor het wikkelen van de spoel. De 60 mm as met de twee schijven is bevestigd aan een impactdriver. Een hall-effect sensor wordt geplaatst in de buurt van de kleine magneet die aan de as is bevestigd. De koperdraad wordt tussen de twee schijven gewikkeld. (C) Geconstrueerde spoel. De spoel is 10 mm hoog, 6 mm in diameter en heeft 1.000 windingen van koperdraad. De rechterkant van de figuur toont de spoel gemanipuleerd door een 3D-geprinte spoelhouder. D) ac-eigenschappen van de spoel geregistreerd door een LCR-meter: (boven)weerstand versus frequentie van sinusoïdale ingang; (onderste) inductie versus ingangsfrequentie. Een typische spoel heeft een weerstand en inductie van respectievelijk 21,6 en 7,9 mH bij 1 kHz AC-ingang. (E) Bifasische rechthoekige golfvorm die wordt gebruikt als de spoelingang die door een oscilloscoop wordt geregistreerd. (F) Relatie tussen magnetische fluxdichtheid en de afstand tussen een geconstrueerde spoel en de hall-effectsensor. De magnetische fluxdichtheid werd geregistreerd door vijf verschillende hall-effect sensoren, eenmaal voor elke sensor. Het gemiddelde van vijf metingen wordt uitgezet en foutbalken vertegenwoordigen de standaardfouten van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Signaalregistratiesysteem en -procedure

  1. Sluit de flexibele 2D-array aan op het opnamesysteem (zie Materiaaltabel) met de platte lintkabel.
  2. Bevestig de roestvrijstalen staaf die op de spoel is gemonteerd aan een micromanipulator (zie materiaaltabel).
  3. Plaats de spoel boven bregma en pas de positie in de caudale richting aan om het brandpunt boven de inferieure colliculus te lokaliseren. Het brandpunt van het elektrisch veld is de middellijn van het gewikkelde gebied aan de onderkant van de spoel (d.w.z. 1 mm van de rand naar het midden).
  4. Bereid een stimulatiesysteem voor dat bestaat uit een bipolaire voeding en een functiegenerator (zie materiaaltabel) en sluit de spoel aan op het systeem.
  5. Sluit een kabel aan tussen de ingangsaansluiting van de functiegenerator en de uitgangsaansluiting van het DAQ-systeem om triggersignalen toe te passen op de functiegenerator van het DAQ-systeem. Bereid een geschikt computerprogramma voor op triggersignalen om stimuli te initiëren. Sluit bovendien het DAQ-systeem aan op het opnamesysteem om de stimulatietijden op te slaan als tijdstempels.
  6. Start het acquisitieproces voor het opnamesysteem.
    OPMERKING: Als het opnamesysteem ruis oppikt, zoekt u de bron van de ruis en vermindert u deze.
  7. Test de magnetische stimulatie door het stimulatiesysteem te activeren.
    OPMERKING: Als de ruis die door de magnetische stimulatie wordt geproduceerd het meetbereik verzadigt, past u het bereik correct aan. Controleer bovendien of het opnamesysteem de stimulatietijdstempels correct opslaat.
  8. Begin met het opnemen van de responsgegevens en begin met stimulatiesessies. Stop de opname wanneer elke stimulatiesessie is voltooid. Sla alle geregistreerde gegevens op voor latere analyse.
    OPMERKING: Om alle experimentele omstandigheden met vijf verschillende magnetische intensiteiten uit te voeren, bijvoorbeeld, was de totale tijd die nodig was voor alle sessies ongeveer 75 minuten. Het eindpunt werd meestal bepaald nadat alle opnamesessies voorbij waren. Toen de dieren echter klinische symptomen vertoonden, waaronder hoesten, moeizame ademhaling en hijgen, werd de experimentele sessie onmiddellijk beëindigd. Voor euthanasie werd onthoofding uitgevoerd met een scherpe, schone schaar terwijl dieren onder narcose waren.

7. Data-analyse

  1. Filter het breedbandsignaal (raw) met behulp van een laagdoorlaatfilter met een afkapfrequentie van 200 Hz.
  2. Verzamel gefilterde golfvormen gedurende een tijdvenster rond elke stimulatietijdstempel. Het gemiddelde van de golfvormen om de event-related potential (ERP) golfvormen te verkrijgen (Figuur 4 en Figuur 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voorbeeld EEG-gegevens geregistreerd in verdoofde C57BL/6J muizen met het flexibele substraat in combinatie met de schroefelektroden worden hieronder weergegeven.

Als typisch voorbeeld worden de gemiddelde EEG-golfvormen die worden gegenereerd als reactie op geluidsstimulatie (8 kHz tone-burst, 80 dB geluidsdrukniveau [SPL]) getoond voor 60 proeven met identieke stimuli (figuur 4A). Een schema van het in kaart brengen van opnamekanalen wordt ook weergegeven in het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie richt zich op een multi-site EEG-registratiesysteem in combinatie met een magnetisch stimulatiesysteem dat is ontworpen voor kleine dieren, waaronder muizen. Het geconstrueerde systeem is goedkoop en eenvoudig te bouwen in fysiologische laboratoria en kan hun bestaande meetopstellingen uitbreiden. De chirurgische procedure die nodig is om gegevens uit het muisregistratiesysteem te verkrijgen, is zeer eenvoudig als dergelijke laboratoria eerdere ervaring hebben met standaard elektrofysiologische experimenten.<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Murata Science Foundation, de Suzuken Memorial Foundation, de Nakatani Foundation for Advancement of Measuring Technologies in Biomedical Engineering, en een Grant-in-Aid for Exploratory Research (subsidienummer 21K19755, Japan) en voor Wetenschappelijk Onderzoek (B) (subsidienummer 23H03416, Japan) aan T.T.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3D printerZhejiang Flashforge 3D Technology Co., LtdFFD-101De printer die wordt gebruikt voor het 3D-printen van de donutvormige schijven
ATROPINE SULFATE  0,5 mgNIPRO ES PHARMA CO., LTD.-Atropinesulfaat
Bipolare versterkerNF Corp.KIT61380Voor het versterken van golfvormen voor spoelinput
ButorphanolMeiji Seika Pharma
Co., Ltd., Tokyo, Japan		-Voor anesthesie van dieren
Commerciële fabrikant van flexibele 2D-arrayp-ban.com Corp.-URL: https://www.p-ban.com/
Computerprogramma om uitgangssignalen te analyserenNatinal InstrumentsNI-DAQ en  NI-DAQmx PythonOm uitgangssignalen van de hall-effectsensor te analyseren
ConnectorHarwin Inc.G125-FV12005L0PVoor connector om te verbinden met het meetsysteem
Koperen padp-ban.com Corp.koperKoperen pad op elk substraat
KoperdraadKyowa Harmonet Ltd.P644432De windingen van de spoel
DAQ-kaartNational Instruments Corp.USB-6343Voor het meten van de magnetische fluxdichtheid van de spoel
Tandheelkundig cementSHOFU INC.Quick ResinZelfhardende orthodontische hars
ECoG-elektrodeNeuroNexus Inc.HC32Voor verwijzing naar het ontwerp van de flexibele 2D-array
EpoxyharsKonishi Co. Ltd.#16123Voor spoelconstructie
EthylcarbamaatFUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.050-05821Voor urethaan-anesthesie
Vlakke lintkabelOki Electric Cable Co., Ltd.FLEX-B2(20)-7/0.1 20028 5mVoor kabel om verbinding te maken tussen oppervlaktemontageconnector en meetsysteem
flexibel substraatp-ban.com Corp.polyimideBasisplaat van flexibel substraat
FunctiegeneratorNF Corp.WF1947Voor het genereren van golfvormen voor spoelinput
Hall-effectsensorHoneywell International Inc.SS94A2DVoor het meten van de magnetische fluxdichtheid van de spoel
IDC-krimptoolPro'sKit Industries Co.6PK-214Om de IDC en een uiteinde van de platte lintkabel te crimpen; Aansluitingstool voor platte kabel
InstantlijmKonishi Co. Ltd.#04612Voor spoelconstructie
Isolatieverdringende connector (IDC )Uxcell JapanB07GDDG3XG2 × 10 pinnen en een 1,27 mm paslengte 
LCR-meterNF Corp.ZM2376Voor het meten van de AC-eigenschappen van de spoel
ManipulatorNARISHIGE Group.SM-15LVoor het manipuleren van de spoel
MedetomidineKobayashi Kako, Fukui, Japan-Voor anesthesie van dieren
MidazolamAstellas Pharma, Tokyo, Japan-Voor anesthesie van dieren
MiniatuurschroefKOFUSEIBYO Co., Ltd.S0.6*1.5Voor EEG-senseing en referentie-elektrode
MuisJapan SLC, Inc.C57BL/6J (C57BL/6JJmsSlc)Experimenteel dier
Permalloy-45 staafThe Nilaco Corp.780544De kern van de spoel
OpnamesysteemPlexon Inc.OmniPlexVoor EEG-gegevensverzameling
Roestvrij draadWakisangyo Co., Ltd.HW-136Voor grip door manipulator
Stereotaxisch apparaatNARISHIGE Group.SR-5M-HTOm een muiskop te fixeren
Op de oppervlakte te monteren connectorUseconn Electronics Ltd.PH127-2x10MGVoor connector om te monteren op de flexibele 2D-array
Testapparatuur (LCR-meter)NF Corp.ZM2372Contactcontrole en impedansketting
Witte PLA-filamentZhejiang Flashforge 3D Technology Co., LtdPLA-F13Het materiaal dat wordt gebruikt voor het 3D-printen van de donutvormige schijven
Xylocaine-gel 2%Sandoz Pharma Co., Ltd.-lidocaine hydrochloride

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ilmoniemi, R. J., et al. Neuronal responses to magnetic stimulation reveal cortical reactivity and connectivity. Neuroreport. 8 (16), 3537-3540 (1997).
  2. Hallett, M. Transcranial magnetic stimulation: a primer. Neuron. 55 (2), 187-199 (2007).
  3. Thut, G., Pascual-Leone, A. Integrating TMS with EEG: How and what for. Brain Topography. 22 (4), 215-218 (2010).
  4. Ilmoniemi, R. J., Kicic, D. Methodology for combined TMS and EEG. Brain Topograpy. 22 (4), 233-248 (2010).
  5. Daskalakis, Z. J., Farzan, F., Radhu, N., Fitzgerald, P. B. Combined transcranial magnetic stimulation and electroencephalography: its past, present and future. Brain Research. 1463, 93-107 (2012).
  6. Tremblay, S., et al. Clinical utility and prospective of TMS-EEG. Clinical Neurophysiology. 130 (5), 802-844 (2019).
  7. Pellicciari, M. C., Veniero, D., Miniussi, C. Characterizing the cortical oscillatory response to TMS pulse. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 38(2017).
  8. Lin, Y. J., Shukla, L., Dugue, L., Valero-Cabre, A., Carrasco, M. Transcranial magnetic stimulation entrains alpha oscillatory activity in occipital cortex. Scientific Reports. 11 (1), 18562(2021).
  9. Takahashi, S., et al. Laminar responses in the auditory cortex using a multielectrode array substrate for simultaneous stimulation and recording. IEEJ Transactions Electrical and Electronic Engineering. 14 (2), 303-311 (2019).
  10. Yoshikawa, T., Higuchi, H., Furukawa, R., Tateno, T. Temporal and spatial profiles of evoked activity induced by magnetic stimulation using millimeter-sized coils in the mouse auditory cortex in vivo. Brain Research. 1796, 148092(2022).
  11. Tang, A. D., et al. Construction and evaluation of rodent-specific rTMS coils. Frontiers in Neural Circuits. 10, 47(2016).
  12. Li, L. Controlling annealing and magnetic treatment parameters to achieve high permeabilities in 55 Ni-Fe toroid cores. IEEE Transactions on Magnetics. 37 (4), 2315-2317 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Transcraniale magnetische stimulatiestimulatie van het muizenbreinflexibele elektrode arrayschroefelektrodenEEG bij kleine dierendata acquisitiesysteemrespons van de auditieve cortexmagnetische stimulatie

Gerelateerde artikelen