Op fluorescentie gebaseerde kwantificering van mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus met behulp van live beeldvorming in HeLa-cellen

Summary

Deze techniek beschrijft een effectieve workflow om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus in HeLa-cellen te visualiseren en kwantitatief te meten met behulp van op fluorescentie gebaseerde live beeldvorming.

Abstract

Mitochondriën zijn dynamische organellen die cruciaal zijn voor metabole homeostase door de energieproductie te regelen via ATP-synthese. Om het cellulaire metabolisme te ondersteunen, werken verschillende mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen samen om een gezond mitochondriaal netwerk te behouden. Een dergelijke route is mitofagie, waarbij PTEN-geïnduceerde kinase 1 (PINK1) en Parkin fosfo-ubiquitinatie van beschadigde mitochondriën autofagosoomsekwestratie en daaropvolgende verwijdering uit de cel via lysosoomfusie vergemakkelijken. Mitofagie is belangrijk voor cellulaire homeostase en mutaties in Parkin zijn gekoppeld aan de ziekte van Parkinson (PD). Vanwege deze bevindingen is er een aanzienlijke nadruk gelegd op het onderzoeken van mitochondriale schade en omzet om de moleculaire mechanismen en dynamiek van mitochondriale kwaliteitscontrole te begrijpen. Hier werd live-cell imaging gebruikt om het mitochondriale netwerk van HeLa-cellen te visualiseren, om het mitochondriale membraanpotentieel en superoxideniveaus te kwantificeren na behandeling met carbonylcyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), een mitochondriaal ontkoppelingsmiddel. Bovendien werd een PD-gebonden mutatie van Parkin (Parkin^T240R) die Parkin-afhankelijke mitofagie remt, uitgedrukt om te bepalen hoe mutante expressie het mitochondriale netwerk beïnvloedt in vergelijking met cellen die wild-type Parkin tot expressie brengen. Het hier beschreven protocol beschrijft een eenvoudige workflow met behulp van fluorescentie-gebaseerde benaderingen om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus effectief te kwantificeren.

Introduction

Het mitochondriale netwerk is een reeks onderling verbonden organellen die een cruciale rol spelen bij energieproductie¹, aangeboren immuniteit^2,3 en celsignalering ^4,5. Mitochondriale ontregeling is in verband gebracht met neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Parkinson (PD)^6,7. PD is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die dopaminerge neuronen van de substantia nigra aantast en die wereldwijd bijna 10 miljoen mensen treft^8....

Protocol

1. Bereiding van biologische monsters

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit met behulp van steriele techniek in een bioveiligheidskast. Spuit het oppervlak van de kast en alle materialen met 70% ethanol.

1. HeLa cel kweken en transfectie
   1. Kweek 30.000 HeLa-cellen in Dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM) met 4,5 g / L glucose aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% L-glutamine-oplossing (HeLa-media; zie Tabel met materialen). Plaats de cellen op 35 mm beeldvormende schalen met glazen bodem (zieT able of Materials) die 2 ml voorverwarmde HeLa-media bevatten. Houd d....

Results

In dit protocol werd op fluorescentie gebaseerde kwantificering gebruikt om de membraanpotentiaal en superoxideniveaus van het mitochondriale netwerk te meten na CCCP-behandeling (figuur 1). Deze workflow gebruikte HeLa-cellen, een vereeuwigde cellijn afgeleid van baarmoederhalskanker. HeLa-cellen worden routinematig gebruikt om mitochondriale biologie te bestuderen en zijn relatief vlak, waardoor het gemakkelijk is om het mitochondriale netwerk te visualiseren met behulp van microscopie. Om.......

Discussion

De hier beschreven workflow kan worden gebruikt om mitochondriale membraanpotentiaal en superoxideniveaus robuust en reproduceerbaar te kwantificeren met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming³⁰. Er zijn belangrijke technische beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van deze experimenten. HeLa-cellen werden getransfecteerd met een lege YFP-vector, YFP-Parkin^WT of YFP-Parkin^T240R. De lege YFP-vector werd gebruikt als een controle om te .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins
CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone)	Sigma-Aldrich	C2759
DMEM (1x) with 4.5 g/L glucose	Gibco	11-965-084
DMSO, Anhydrous	ThermoFisher Scientific	D12345
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH3007103
FuGENE 6 (Tranfection Reagent)	Promega	E2691
GlutaMAX 100x (L-Glutamine Solution)	Gibco	35-050-061
Hoescht 33342	ThermoFisher Scientific	62249
MitoSOX  Red	ThermoFisher Scientific	M36008
MitoTracker Deep Red	ThermoFisher Scientific	M7514
Opti-MEM (Redued Serum media)	ThermoFisher scientific	31985070
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE)	ThermoFisher Scientific	T669
Experimental models: Organisms/Strains
HeLa-M (Homo sapiens)	A. Peden (Cambridge Institute for Medical Research)	N/A
Recombinant DNA
EYFP Empty Vector	N/A	N/A
YFP-Parkin T240R	This Paper	Generated by site-directed mutagenesis from YFP-Parkin
YFP-Parkin WT	Addgene; PMID:19029340	RRID:Addgene_23955
Software and Algorithms
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	https://www.adobe.com/products/illustrator	(Schindelin, 2012)
Excel (Spreadsheet Software)	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel
ImageJ		https://imagej.net/software/fiji/
Leica Application Suite (LAS X)	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Microsoft Excel	Microsoft Office	https://www.microsoft.com/excel
Prism9 (Statistical Analysis Software)	GraphPad Software	https://www.graphpad.com
Other
35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated	MatTek	P35G-1.5-20-C
Cage Incubator (Environmental Chamber)	Okolab	https://www.oko-lab.com/cage-incubator
DMiL Inverted Microscope	Leica	N/A
LIGHTNING Deconvolution Software	Leica	N/A
STELLARIS 8 confocal microscope	Leica	N/A