Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beoordeling van bladluis effect van entomopathogene schimmels tegen parthenogenetisch insect, mosterdluis, Lipaphis erysimi (Kalt.)

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65312

⸱

21 juli 2023

 , 
1Department of Entomology, National Chung Hsing University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerd vrijstaand bioassaysysteem voor het evalueren van de effectiviteit van entomopathogene schimmels (EPF) tegen de mosterdluis (Lipaphis erysimi (Kalt.)), een parthenogenetisch insect. De methode schetst het gegevensverzamelingsproces tijdens experimenten met petrischaaltjes, waardoor onderzoekers consequent de virulentie van EPF kunnen meten tegen mosterdbladluizen en andere parthenogenetische insecten.

Samenvatting

De mosterdluis (L. erysimi) is een plaag die verschillende kruisbloemige gewassen aantast en plantenvirussen overbrengt. Om milieuvriendelijke plaagbestrijding te bereiken, zijn entomopathogene schimmels (EPF) potentiële microbiële bestrijdingsmiddelen voor het bestrijden van deze plaag. Daarom is virulentiescreening van EPF-isolaten onder petrischaalcondities noodzakelijk vóór toepassing in het veld. De mosterdluis is echter een parthenogenetisch insect, waardoor het moeilijk is om gegevens vast te leggen tijdens experimenten met petrischaaltjes. Om dit probleem aan te pakken, werd een aangepast systeem voor bioassays met losse bladeren ontwikkeld, waarbij een microsproeier werd gebruikt om conidia op bladluizen te inoculeren en verdrinking te voorkomen door het drogen aan de lucht na sporensuspensie te vergemakkelijken. Het systeem handhaafde gedurende de hele observatieperiode een hoge relatieve vochtigheid en de bladschijf bleef meer dan tien dagen vers, waardoor parthenogenetische reproductie van de bladluizen mogelijk was. Om de opbouw van nakomelingen te voorkomen, werd een proces van dagelijkse verwijdering met behulp van een verfborstel geïmplementeerd. Dit protocol demonstreert een stabiel systeem voor het evalueren van de virulentie van EPF-isolaten tegen mosterdluis of andere bladluizen, waardoor de selectie van potentiële isolaten voor bladluisbestrijding mogelijk wordt.

Inleiding

De mosterdluis (L. erysimi) is een beruchte plaag die een verscheidenheid aan kruisbloemige gewassen aantast en aanzienlijke economische verliezen veroorzaakt. Hoewel verschillende systematische insecticiden zijn aanbevolen om bladluisplagen te bestrijden, geeft het frequente gebruik van deze insecticiden aanleiding tot bezorgdheid over resistentie tegen pesticiden 2,3. Daarom zouden entomopathogene schimmels (EPF) in termen van milieuvriendelijke plaagbestrijding kunnen dienen als een geschikte alternatieve bestrijdingsstrategie. EPF is een ziekteverwekker van insecten met het vermogen om gastheren te infecteren door hun nagelriemen binnen te dringen, waardoor het een krachtig middel is voor het bestrijden van bladluizen en andere plantenzuigende insecten4. Bovendien heeft EPF bewezen een haalbare en duurzame plaagbestrijdingstechniek te zijn, die voordelen biedt zoals antagonisme van plantpathogenen en bevordering van de plantengroei5.

EPF kan worden verkregen door middel van aas in de grond van insecten of geïsoleerd uit insectenkadavers in het veld 6,7. Alvorens verder gebruik van schimmelisolaten is echter screening op pathogeniteit noodzakelijk. Er zijn verschillende onderzoeken uitgevoerd naar de effectiviteit van EPF tegen bladluizen, dit zijn belangrijke gewasplagen die ernstige schade kunnen aanrichten 8,9. Mosterdbladluizen, naast verschillende soorten bladluizen, zijn getest op gevoeligheid voor verschillende stammen van Beauveria spp., Metarhizium spp., Lecanicillium spp., Paecilomyces spp. en zelfs Alternaria, dat vooral bekend staat als een saprofytische en plantpathogene schimmel, maar enkele dodelijke effecten heeft vertoond tegen mosterdbladluizen10,11,12.

Om de effectiviteit van EPF tegen bladluizen onder laboratoriumomstandigheden te evalueren, kunnen bioassays worden onderverdeeld in twee hoofddelen: de inoculatiekamer en schimmelinoculatie. Het huidige protocol beschrijft de bouw van een inoculatiekamer, waar bladluizen op verschillende manieren kunnen worden onderhouden, zoals een uitgesneden blad met een bladsteel gewikkeld in vochtig katoen, een uitgesneden bladschijf met een petrischaal bekleed met vochtig filtreerpapier, direct onderhoud aan potplanten, of een uitgesneden bladschijf ingebed in wateragar in een petrischaal of -container10, 11,13. Veelgebruikte methoden voor schimmelinoculatie zijn onder meer conidia sproeien, bladluisonderdompeling in een conidia-suspensie, bladonderdompeling in een conidia-suspensie en endofyteninoculatie van planten11,14,15,16. Hoewel er verschillende inoculatiemethoden bestaan, moeten de bioassays de toepassingsomstandigheden in het veld simuleren. In het geval van de bladgedompelde methode12,17 kan bijvoorbeeld de efficiëntie van EPF worden geëvalueerd, maar aangezien de bladluizen de met schimmel beladen bladeren besmetten, wordt de dorsale zijde van de bladluis, die een preferentiële penetratieplaats is, meestal niet blootgesteld aan de schimmel.

Om het bladluiseffect van EPF onder laboratoriumomstandigheden te evalueren, stelt dit protocol voor om de losbladmethode te gebruiken die is beschreven door Yokomi en Gottwald18 met enkele aanpassingen, gevolgd door conidia-inoculatie met behulp van een microsproeier. Deze methode handhaaft de luchtvochtigheid in de bioassaykamer gedurende ten minste zeven dagen met ongeveer 100% zonder dat er extra water hoeft te worden bijgevuld18,19. Bovendien zorgt het beperken van bladluizen tot één oppervlak ervoor dat ze worden blootgesteld aan conidia-sproeien en vergemakkelijkt het observaties20. Bladluizen kunnen echter vast komen te zitten in het blootgestelde agaroppervlak terwijl ze zich binnen de inoculatiekamer bewegen. Bovendien kan het opnemen van gegevens in het petrischaalexperiment met mosterdbladluizen, parthenogenetische insecten, een uitdaging zijn vanwege hun snelle ontwikkeling en voortplanting. Het is moeilijk om onderscheid te maken tussen ingeënte volwassenen en hun nakomelingen zonder verwijdering. De details over hoe u verder moet gaan met deze stap worden zelden genoemd en sommige inconsistente factoren, zoals het bladverbruiksgebied, moeten worden geoptimaliseerd.

Dit protocol demonstreert een stabiel systeem voor het screenen van de virulentie van EPF-isolaten tegen mosterdbladluizen, waardoor potentiële isolaten tegen verschillende bladluissoorten uit een uitgebreide EPF-bibliotheek kunnen worden geselecteerd. In het veld verzamelde bladluizen kunnen worden geïdentificeerd en er kan een voldoende laboratoriumpopulatie van mosterdbladluizen worden vastgesteld om het bladluiseffect van verschillende schimmelisolaten te evalueren met behulp van een eenvoudige en haalbare methodologie met consistente resultaten. Bladluizen hebben meerdere evolutionaire mechanismen ontwikkeld als reactie op intense en herhaalde antropogene druk in agro-ecosystemen, wat een uitdaging vormt voor de voedselzekerheid9. Daarom zou deze beschreven methode kunnen worden uitgebreid om potentiële EPF-isolaten tegen verschillende bladluissoorten te evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het volledige stroomschema wordt weergegeven in afbeelding 1.

1. Mosterdbladluis verzamelen en onderhouden

  1. Inzameling van mosterdbladluizen
    1. Draai de bladeren om en controleer visueel op aantasting van mosterdbladluizen op kruisbloemige gewassen in het veld.
    2. Registreer de informatie over de bemonsteringslocatie (d.w.z. GPS) en waardplant(en) en bevestig de geschiedenis van insecticidentoepassingen met de boeren.
    3. Gebruik een insectenzuiger of een fijn schilderspenseel (zie Materiaaltabel) om ongeveer 50 mosterdbladluizen te verzamelen in een centrifugebuis van 50 ml van kruisbloemige gewassen in het veld en breng het monster binnen 3 uur naar het laboratorium.
    4. Maak een petrischaaltje voor tijdelijk onderhoud met weggesneden kruisbloemige bladeren en met water geïnfiltreerd filtreerpapier op de bodem.
    5. Plaats de vijf bladluizen op de tijdelijke petrischaal bij kamertemperatuur (25 ± 2 °C) met een relatieve luchtvochtigheid van 70% en 12:12 uur (licht:donker) fotoperiode gedurende 14 dagen om te bevestigen dat bladluizen natuurlijke vijandvrij sparen voordat ze verder worden gekweekt.
      OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat in het veld verzamelde bladluizen vrij zijn van natuurlijke vijanden zoals sluipwespen of entomopathogene schimmels, is het van cruciaal belang om de afwezigheid van deze organismen te bevestigen voordat u verder gaat met de kweek.
  2. Instandhouding van mosterdbladluizen
    NOTITIE: Gebruik kruisbloemige bladeren zonder pesticiden (inclusief biopesticide) om mosterdbladluizen te behouden.
    1. Zorg voor een stabiele en voldoende aanvoer van kruisbloemige bladeren (ongeveer 25cm2).
      OPMERKING: Haal de kruisbloemige bladeren van de markt of kweek de planten. Voorafgaand aan de langdurige, massale kweek van mosterdbladluizen, kunnen verschillende soorten kruisbloemigen worden getest om een geschikte kruisbloemige te vinden. Als de soort van het kruisbloemige blad eenmaal is gefixeerd, verander het dan niet. In dit onderzoek is Komatsuna (Brassica rapa var. perviridis) in het 6-7-bladstadium gebruikt (zie Tabel met materialen). Gooi bovendien de 2-3 oudste bladeren weg.
    2. Voeg water toe voordat het filtreerpapier aan de onderkant helemaal droog is.
    3. Observeer dagelijks de populatiedichtheid van de mosterdbladluizen. De populatie zou na 7 dagen 2-3-voudig moeten groeien.
    4. Wanneer het aantal bladluizen toeneemt, snijdt u de oorspronkelijk weggesneden bladeren met mosterdbladluizen in 4-6 kleinere stukken en doet u elk klein bladstukje met mosterdbladluizen in een petrischaal met vers uitgesneden blad en met water geïnfiltreerd filtreerpapier.
    5. Plaats de petrischaal in een incubator bij 25 °C met een fotoperiode van 12:12 uur (licht:donker) en observeer dagelijks de populatiedichtheid van mosterdbladluizen.
    6. Verwijder de originele uitgesneden bladeren nadat de meeste bladluizen zijn gemigreerd naar verse weggesneden bladeren voordat de oorspronkelijke bladeren rotten.

2. Moleculaire identificatie van mosterdluis

OPMERKING: Om de soort in het veld verzamelde mosterdluis te bevestigen, werd moleculaire identificatie uitgevoerd met behulp van twee moleculaire markers: de sequentie gekarakteriseerd geamplificeerd gebied (SCAR) op basis van A05Le, ontworpen door Lu et al.21, en mosterdbladluis cytochroomoxidase subeenheid 1 (COI) gebied van de mosterdluis.

  1. Extractie van genoom-DNA van mosterdluis
    1. Verzamel ongeveer 50 bladluizen in een centrifugebuisje van 1,5 ml.
      OPMERKING: Bladluizen die voor moleculaire identificatie worden gebruikt, moeten afstammelingen zijn van één enkele bladluis, en verschillende stadia kunnen ook in dezelfde buis worden samengevoegd voor DNA-extractie.
    2. Homogeniseer de bladluizen met een pelletstamper en extraheer het DNA met behulp van Gene-Spin Genomic DNA Isolation Kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen).
    3. Elueer het genomische DNA met 50 μL voorverwarmd nucleasevrij water.
  2. PCR-amplificatie en DNA-sequencing
    1. Amplificeer de doel-DNA-sequenties van genoom-DNA van bladluis met behulp van PCR Master Mix (2x) met primerparen A05LeF/A05LeR en LeCO1F/LeCO1R (tabel 1) met verschillende PCR-programma's21.
      OPMERKING: De PCR-reactie met een totaal volume van 20 μL bestaat uit 2 μL bladluis genomische DNA-sjabloon, 1 μL voorwaartse en 1 μL omgekeerde primers, 10 μL PCR Master Mix (zie Materiaaltabel) en 6 μL ddH2O.
    2. Voer de PCR uit in een thermische cycler (zie materiaaltabel) met het volgende programma: 94 °C gedurende 5 min, 25 cycli van 94 °C gedurende 45 s, 61 °C (voor A05LeF/A05LeR) en 58 °C (voor LeCO1F/LeCO1R) gedurende 45 s, 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door een laatste verlenging van 72 °C gedurende 5 min.
    3. Analyseer het PCR-product door middel van 1% agarosegelelektroforese om de identiteit van de mosterdluis te bevestigen (Figuur 2).
      OPMERKING: Als primerpaar A05LeF/A05LeR met succes de juiste grootte van het DNA-fragment ampliseert, heeft het de in het veld verzamelde bladluis overtuigend geïdentificeerd als mosterdluis21. De primerparen staan vermeld in tabel 2.
    4. Zuiver het PCR-product van het COI-amplicon van mosterdluis met behulp van een in de handel verkrijgbare gel/PCR-kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel) en sequentie van het PCR-product met behulp van een commerciële sequencingservice.
  3. Sequentie analyse
    OPMERKING: Volgens Lu et al.21 is de DNA-buiging van A05Le een mosterdbladluisspecifiek DNA-fragment; daarom hoeft het A05Le PCR-product niet verder te worden gesequenced.
    1. Controleer de leeskwaliteit door Chromas-software (zie Materiaaltabel) na het verkrijgen van de LeCO1-sequentie.
    2. Trim upstream en downstream leesbewerkingen van lage kwaliteit door een fasta- (of txt)-bestand te openen en de leesbewerkingen van lage kwaliteit direct te verwijderen.
    3. Dien de bijgesneden reeks in bij NCBI web BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) met behulp van standaardparameters.
      OPMERKING: Als de amplicongroottes van A05Le- en LeCO1-primersets correct zijn, moet theoretisch de sequentiestraalzoekopdracht in NCBI-standaarddatabases overeenkomen met mosterdluis.

3. Bereiding van entomopathogene schimmels

OPMERKING: De EPF die in dit onderzoek is gebruikt, staat vermeld in tabel 1.

  1. Terugwinning van EPF uit schimmelbibliotheek
    1. Ontdooi de geconserveerde schimmelvoorraad (conidia gesuspendeerd in 30% glycerine) uit de vriezer van -80 °C.
    2. Breng een kleine hoeveelheid (ongeveer 10 μl) van de conidia suspensie over op een plaat van 6 cm 1/4 Sabouraud dextrose-agar (SDA) (0,75 g Sabouraud-dextrosebouillon met 1,5 g agar per 100 ml ddH2O) en verdeel deze gelijkmatig met behulp van een celverdeler in een laminaire stroomkap.
    3. Sluit de petrischaal af met paraffinefolie en broed deze 10-14 dagen in het donker bij 25 °C uit.
    4. Herkweek de schimmelisolaten door schimmelmassa op een 1/4 SDA-plaat te strepen en schimmels gedurende 10-14 dagen in het donker bij 25 °C te incuberen voordat de conidia22 worden geoogst.
      OPMERKING: De schimmelcultuur moet ongeveer 10 dagen voor het inoculeren van de bladluizen worden gebruikt. EPF-kweek die meer dan 14 dagen oud is, wordt niet aanbevolen voor gebruik in de virulentietest.
  2. Bereiding van conidia-suspensie
    1. Schraap de conidia van de 10-14 dagen oude schimmelcultuur op 1/4 SDA-plaat door een lus te inoculeren na toevoeging van 2-3 ml 0,03% Tween 80 (zie Tabel met materialen).
    2. Vang de schimmelsuspensie op in een centrifugebuisje.
    3. Draai de oplossing met de hoogste snelheid vortex, tel het aantal conidia met behulp van een hemocytometer onder een lichtmicroscoop en pas de concentratie van de conidia suspensie aan tot 108 conidiën/ml.
    4. Breng de conidia-suspensie over in een UV-gesteriliseerde microsproeier.
      OPMERKING: Draai de conidia-suspensie opnieuw voordat u deze overbrengt, omdat de conidia vatbaar zijn voor neerslaan. De microsproeier moet voor gebruik gedurende 30 minuten worden blootgesteld aan ultraviolette straling in een laminaire stroomkap.

4. Virulentiescreening tegen mosterdluis

  1. Voorbereiding van nieuw opgekomen volwassenen
    1. Verplaats aptereuze (zonder vleugel) en alate (gevleugelde) volwassenen van de opgroeiende petrischaal naar vers uitgesneden bladeren om nieuwe nakomelingen van dezelfde leeftijd te reproduceren. Verwijder de volwassen dieren na 24 uur om overbevolking te voorkomen en de productie van gelaagde nakomelingen te minimaliseren23,24. Alleen geschikte volwassenen zullen in verdere experimenten worden gebruikt.
    2. Voed de nakomelingen op naar het volwassen stadium en verwijder de nakomelingen die zich na 48 uur niet ontwikkelen tot het volwassen stadium (figuur 3) om leeftijdsvariatie tussen bladluizen voor het experiment te voorkomen. Verwijder bovendien gealiseerde volwassenen.
  2. Voorbereiding van de inentkamer
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om eerst kruisbloemige bladeren met een diameter van 9 cm te bereiden, zodat de bladschijf vóór het stollen in de wateragar kan worden ingebed.
    1. Reinig de kruisbloemige bladeren met kraanwater, verwijder vuil en resten en eventuele andere geleedpotigen.
    2. Veeg overtollig water weg met keukenpapier en controleer met een stereomicroscoop op andere geleedpotigen op het oppervlak van de kruisbloemige bladeren. Verwijder eventuele geleedpotigen, indien aanwezig.
    3. Knip een bladschijf met een diameter van 9 cm af door de onderste petrischaal als mal direct op het blad te drukken of door een schaar te gebruiken.
      OPMERKING: Als de bladeren kleiner zijn dan 9 cm in diameter, combineer dan een paar weggesneden bladeren.
    4. Bereid 1,5% wateragar voor elke petrischaal door 450 mg agar (zie materiaaltabel) te verwarmen en op te lossen in 30 ml ddH2O met behulp van de magnetron.
      OPMERKING: De hoeveelheid 1,5% wateragar kan worden aangepast afhankelijk van de schaal van het experiment.
    5. Giet 30 ml 1,5% wateragar in de petrischaal van 9 cm voordat u stolt in de laminaire stroomkap en wacht tot de agar is afgekoeld tot ~40 °C totdat het oppervlak van de agar half gestold is.
      NOTITIE: Controleer of het oppervlak half gestold is door de petrischaal voorzichtig horizontaal te schudden.
    6. Plaats de bladschijf, met het abaxiale oppervlak naar boven, bovenop de wateragar en plaats de bladschijf in de agar.
      NOTITIE: Minimaliseer de blootstelling van het agar-oppervlak.
    7. Nadat de wateragar volledig is gestold, sluit u het deksel van de petrischaal.
      NOTITIE: Open het deksel voor waterverdamping als er onmiddellijk veel druppels op het deksel condenseren.
    8. Plaats 20 volwassen dieren op de bladschijf.
      NOTITIE: Het wordt aanbevolen om onder een stereomicroscoop te werken om schade aan hun monddelen te voorkomen.
  3. EPF-inoculatie en observatie
    1. Open het deksel van de inoculatiekamer en spuit 0,3 ml conidia suspensie (uit stap 3.2) rechtstreeks op de bladluizen en de bladschijf vanaf ongeveer 15 cm boven de bladschijf.
      OPMERKING: Draai de conidia-suspensie opnieuw voor het spuiten. De spuitgebieden moeten vóór het experiment worden getest, omdat ze kunnen variëren tussen verschillende sproeiers. In dit geval wordt 0,3 ml met 15 cm afstand aanbevolen. Het spuitgebied moet de hele bladschijf bedekken en een dunne laag conidia-suspensie moet de bladschijf bedekken. Als druppeltjes samenkomen in stilstaand water op het blad, moet het inoculatievolume worden verminderd. Reinig de tafel met 70% ethanol voor inoculatie en tussen het gebruik van verschillende isolaten.
    2. Wacht tot de conidia-suspensie droog is en sluit dan het deksel om te voorkomen dat mosterdbladluizen verdrinken.
      OPMERKING: Bladluizen zwerven zelden rond tijdens het experiment; Het is echter nog steeds nodig om ervoor te zorgen dat de bladluizen niet ontsnappen.
    3. Sluit de inoculatiekamer af met paraffinefolie om een hoge relatieve luchtvochtigheid te behouden en plaats de inoculatiekamer in een incubator bij 25 °C met 12:12 h (licht:donker) fotoperiode.
    4. Open het deksel van de inoculatiekamer om de sterfte onder een stereomicroscoop om de 12 uur gedurende 5 dagen.
    5. Veeg de honingdauw die aan het deksel kleeft weg met keukenpapier en verwijder de nieuw opgekomen bladluizen met een fijne verfkwast. Reinig het deksel elke 24 uur met kraanwater.
      OPMERKING: De observatieperiode kan variëren voor verschillende soorten bladluizen op basis van de volwassen levensduur.
    6. Houd het kadaver op de bladschijf voor mycose om een succesvolle inoculatie te bevestigen.
  4. Bevestiging van de kiemkracht van conidia
    OPMERKING: Deze stap is optioneel. Om de kiemsnelheid van conidia paarsgewijs te bevestigen bij het uitvoeren van de virulentiescreening om de activiteit van conidia te garanderen.
    1. Laat één druppel 5 μL conidia suspensie vallen op 1/4 SDA voor drie replicaten.
    2. Bereken na 18 uur de kiemkracht met de lichtmicroscoop. Tel ten minste 100 sporen willekeurig in een enkele druppel om de kiemkracht van de schimmel te bevestigen.
      OPMERKING: Normaal gesproken zou de kiemkracht van de isolaten die in het experiment worden gebruikt hoger moeten zijn dan 90%.

5. Bioassay van geselecteerde EPF-isolaten

OPMERKING: EPF-isolaten die een hoge virulentie vertoonden, die uit stap 4 werden geselecteerd, werden onderworpen aan een bioassay tegen mosterdbladluizen met behulp van vier concentraties conidia-suspensies (variërend van 104 tot 107 conidiën/ml).

  1. Bereiding van conidia-suspensie
    1. Herhaal stap 3.1 om de geselecteerde EPF-isolaten te herstellen.
    2. Herhaal stap 3.2 om vier concentraties conidia suspensie te bereiden, waaronder 104, 105,10 6 en 107 conidiën/ml.
  2. Voorbereiding van nieuw opgekomen volwassenen
    1. Herhaal stap 4.1 om pas opgekomen volwassenen voor te bereiden.
  3. Voorbereiding van de inentkamer
    1. Herhaal stap 4.1. om de inoculatiekamer voor te bereiden.
  4. EPF-inoculatie en observatie
    1. Herhaal stap 4.3. om de EPF-inoculatie en observatie uit te voeren met respectievelijk de vier concentraties conidia-suspensie.

6. Statistische analyse

  1. Berekening van de gecorrigeerde sterfte
    1. Bereken de gecorrigeerde mortaliteit met behulp van de formule25 van Abbott, zoals hieronder weergegeven:
      Gecorrigeerde mortaliteit (%) = [(MT− M C) × 100%] / (100− MC)
      MT staat voor de mortaliteit van de behandelde groep en MC staat voor de mortaliteit van de controlegroep.
      OPMERKING: De mortaliteit van de controlegroep mag niet hoger zijn dan 20%.
    2. Open het SPSS-softwareplatform (zie Materiaaltabel), maak variabelen aan, waaronder "behandeling" en "cor_mor" (die gecorrigeerde mortaliteit vertegenwoordigen) en voer de berekende resultaten in voor de inoculatie van verschillende isolaten op hetzelfde tijdstip met dezelfde geïnoculeerde concentratie.
    3. Selecteer Analyseren, Vergelijk Gemiddelden en Verhoudingen, Onafhankelijke Steekproeven T-Test in SPSS voor onafhankelijke t-toetsanalyse .
    4. Voer in SPSS de behandeling in het vak "Groeperingsvariabele" in en cor_mor in de "Testvariabele(n)". Definieer groepen aan de hand van verschillende schimmelisolaten. Druk op OK om te analyseren.
  2. Berekening van de mediane letale tijd (LT 50) en de mediane letale concentratie (LC50)
    1. Open de SPSS, maak variabelen "totaal", "respons" en "duur"/"concentratie" en voer het geregistreerde resultaat in de spreadsheet in.
    2. Selecteer Analyze, Regression, Probit in SPSS om LT 50 en/of LC50 te berekenen.
      OPMERKING: Als de cumulatieve mortaliteit uiteindelijk niet hoger is dan 50%, kan LT 50 en/of LC50 niet worden geschat.
    3. Voer het totaal in het vak "Totaal waargenomen" in, de respons in het vak "Responsfrequentie", de duur/concentratie in het vak "Covariabele(n)". Druk op OK om te analyseren.
      OPMERKING: Druk in het algemeen op Opties en stel het "Significantieniveau voor gebruik van heterogeniteitsfactor" in op 0.05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gepresenteerde stroomschema illustreert de stabiele toestand van de mosterdbladluizen van veldverzameling tot virulentiescreening. Het in stand houden van bladluizen uit veldverzameling zorgde voor een stabiele toename van bladluiskolonies met voldoende voedselaanbod. De in het veld verzamelde bladluizen werden bevestigd als mosterdluizen door het gebruik van moleculaire markers, waaronder PCR-amplicongrootte en LeCO1-sequencing. De virulentiescreening, uitgevoerd met behulp van de losbladmethode, onthulde een consis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Kruisbloemigen, een groep groenten, worden vaak aangetast door meerdere soorten bladluis, waaronder mosterdluis (L. erysimi) en koolluis (Brevicoryne brassicae)26. Beide soorten zijn gemeld in Taiwan27, en het is mogelijk dat ze naast elkaar bestaan op de verzamelplaats. Om nauw verwante bladluissoorten te onderscheiden, werd in dit onderzoek gebruik gemaakt van een moleculaire identificatietechniek met behulp van een multiplex primerset2...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling bij dit werk.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door 109-2313-B-005 -048 -MY3 van het Ministerie van Wetenschap en Technologie (MOST).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 μL Inoculating LoopNEST Scientific718201
100 bp DNA Ladder IIIGeneaidDL007
2x SuperRed PCR Master MixBiotoolsTE-SR01
50 mL centrifuge tubeBioman ScientificET5050-12
6 cm Petri dishAlpha Plus Scientific16021
6 mm insect aspiratorMegaView ScienceBA6001
70 mm filter paper NO.1Toyo Roshi Kaisha
70% ethanol
9 cm Petri dishAlpha Plus Scientific16001
AgarBioman ScientificAGR001.1Microbiology grade
AgaroseBioman ScientificPB1200
BioGreen Safe DNA Gel BufferBioman ScientificSDB001T
ChromasTechnelysium
GeneDoc
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300https://www.geneaid.com/data/files/1605861013102532959.pdf
Gene-Spin Genomic DNA Isolation KitProtech TechnologyPT-GD112-V3http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
HemocytometerPaul Marienfeld640030
Komatsuna leaves (Brassica rapa var. perviridis)Tai Cheng Farm1-010-300410
Microsprayer
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834
Mustard aphid (Lipaphis erysimi)
Painting brushTian Cheng brush company4716608400352
Parafilm MBemisPM-996
Pellet pestleBioman ScientificGT100R
Sabouraud Dextrose BrothHiMediaMH033-500G
SPSS StatisticsIBM
TAE buffer 50xBioman ScientificTAE501000
Tween 80PanReac AppliChem142050.1661
```

Referenties

  1. Ghosh, S., Roy, A., Chatterjee, A., Sikdar, S. R. Effect of regional wind circulation and meteorological factors on long-range migration of mustard aphids over indo-gangetic plain. Scientific Reports. 9, 5626(2019).
  2. Dhillon, M. K., Singh, N., Yadava, D. K. Preventable yield losses and management of mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kaltenbach) in different cultivars of Brassica juncea(L.) Czern & Coss. Crop Protection. 161, 106070(2022).
  3. Huang, F., Hao, Z., Yan, F. Influence of oilseed rape seed treatment with imidacloprid on survival, feeding behavior, and detoxifying enzymes of mustard aphid, lipaphis erysimi. Insects. 10 (5), 144(2019).
  4. Mannino, M. C., Huarte-Bonnet, C., Davyt-Colo, B., Pedrini, N. Is the insect cuticle the only entry gate for fungal infection? insights into alternative modes of action of entomopathogenic fungi. Journal of Fungi. 5 (2), 33(2019).
  5. Bamisile, B. S., Akutse, K. S., Siddiqui, J. A., Xu, Y. Model application of entomopathogenic fungi as alternatives to chemical pesticides: prospects, challenges, and insights for next-generation sustainable agriculture. Frontiers in Plant Science. 12, 741804(2021).
  6. Scorsetti, A. C., Humber, R. A., Garcia, J. J., Lopez Lastra, C. C. Natural occurrence of entomopathogenic fungi (Zygomycetes: Entomophthorales) of aphid (Hemiptera: Aphididae) pests of horticultural crops in Argentina. Biocontrol. 52, 641-655 (2007).
  7. Liu, Y. C., Ni, N. T., Chang, J. C., Li, Y. H., Lee, M. R., Kim, J. S., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882(2021).
  8. Francis, F., Fingu-Mabola, J. C., Fekih, I. B. Direct and endophytic effects of fungal entomopathogens for sustainable aphid control: a review. Agriculture. 12 (12), 2081(2022).
  9. Simon, J., Peccoud, J. Rapid evolution of aphid pests in agricultural environments. Current Opinion in Insect Science. 26, 17-24 (2018).
  10. Ujjan, A. A., Shahzad, S. Use of Entomopathogenic Fungi for the Control of Mustard Aphid (Lipaphis erysimi) on canola (Brassica napus L). Pakistan Journal of Botany. 44 (6), 2081-2086 (2012).
  11. Sajid, M., Bashir, N. H., Batool, Q., Munir, I., Bilal, M., Jamal, M. A., et al. In-vitro evaluation of biopesticides (Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Bacillus thuringiensis) against mustard aphid Lipaphis erysimi kalt. (Hemiptera: Aphididae). Journal of Entomology and Zoology Studies. 5 (6), 331-335 (2017).
  12. Paschapur, A. U., Subbanna, A. R. N. S., Singh, A. K., Jeevan, B., Stanley, J., Rajashekara, H., Mishra, K. K., Koti, P. S., Kant, L., Pattanayak, A. Alternaria alternata strain VLH1: a potential entomopathogenic fungus native to North Western Indian Himalayas. Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 138(2022).
  13. Miohammed, A. A. Lecanicillium muscarium and Adalia bipunctata combination for the control of black bean aphid, Aphis fabae. Biocontrol. 63, 277-287 (2018).
  14. Thaochan, N., Ngampongsai, A., Prabhakar, C. S., Hu, Q. Beauveria bassiana PSUB01 simultaneously displays biocontrol activity against Lipaphis erysimi (Kalt.) (Hemiptera: Aphididae) and promotes plant growth in Chinese kale under hydroponic growing conditions. Biocontrol Science and Technology. 31 (10), 997-1015 (2021).
  15. Mseddi, J., Farhat-Touzri, D. B., Azzouz, H. Selection and characterization of thermotolerant Beauveria bassiana isolates and with insecticidal activity against the cotton-melon aphid Aphis gossypii (Glover) (Hemiptera: Aphididae). Pest Management Science. 78 (6), 2183-2195 (2022).
  16. Butt, T. M., Ibrahim, L., Clark, S. J., Beckett, A. The germination behaviour of Metarhizium anisopliae on the surface of aphid and flea beetle cuticles. Mycological Research. 99 (8), 945-950 (1995).
  17. Ullah, S., Raza, A. B. M., Alkafafy, M., Sayed, S., Hamid, M. I., Majeed, M. Z., Riaz, M. A., Gaber, N. M., Asim, M. Isolation, identification and virulence of indigenous entomopathogenic fungal strains against the peach-potato aphid, Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae), and the fall armyworm, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Egyptian Journal of Biological Pest Control. 32, 2(2022).
  18. Yokomi, R. K., Gottwald, T. R. Virulence of Verticillium lecanii Isolates in Aphids Determined by Detached-leaf Bioassay. Journal of Inbertebrate Pathology. 51, 250-258 (1988).
  19. Vu, V. H., Hong, S. I., Kim, K. Selection of entomopathogenic fungi for aphid control. Journal of Bioscience and Bioengineering. 104 (6), 498-505 (2007).
  20. Vandenberg, J. D. Standardized bioassay and screening of beauveria bassiana and paecilomyces fumosoroseus against the russian wheat aphid (homoptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 89 (6), 1418-1423 (1996).
  21. Lu, W. N., Wu, Y. T., Kuo, M. H. Development of species-specific primers for the identification of aphids in Taiwan. Applied Entomology and Zoology. 43 (1), 91-96 (2008).
  22. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. Journal of Visualized Experiments. 175, e62882(2021).
  23. Menger, J., Beauzay, P., Chirumamilla, A., Dierks, C., Gavloski, J., Glogoza, P., et al. Implementation of a diagnostic-concentration bioassay for detection of susceptibility to pyrethroids in soybean aphid (hemiptera: aphididae). Journal of Economic Entomology. 113 (2), 932-939 (2020).
  24. Zhang, R., Chen, J., Jiang, L., Qiao, G. The genes expression difference between winged and wingless bird cherry-oat aphid Rhopalosiphum padi based on transcriptomic data. Scientific Reports. 9, 4754(2019).
  25. Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. Journal of Economic Entomology. 18, 265-267 (1925).
  26. Liu, T. X., Sparks, A. N. Jr Aphids on Cruciferous Crops: Identification and Management. , Texas A&M AgriLife Extension Service. 9-11 (2001).
  27. Kuo, M., Chianglin, H. Temperature dependent life table of brevicoryne brassicae (l.)(hemiptera: aphididae) on radish. Formosan Entomologist. 27, 293-302 (2007).
  28. Im, Y., Park, S., Lee, S. Y., Kim, J., Kim, J. J. Early-Stage defense mechanism of the cotton aphid aphis gossypii against infection with the insect-killing fungus beauveria bassiana JEF-544. Frontiers in Immunology. 13, 907088(2022).
  29. Kim, J. J., Roberts, D. W. The relationship between conidial dose, moulting and insect developmental stage on the susceptibility of cotton aphid, Aphis gossypii, to conidia of Lecanicillium attenuatum, an entomopathogenic fungus. Biocontrol Science and Technology. 22 (3), 319-331 (2012).
  30. Reingold, V., Kottakota, C., Birnbaum, N., Goldenberg, M., Lebedev, G., Ghanim, M., et al. Intraspecies variation ofMetarhiziumbrunneumagainst the green peach aphid,Myzus persicae, provides insight into thecomplexity of disease progression. Pest Management Science. 77, 2557-2567 (2021).
  31. Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the Surface: entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4, 357-374 (2013).
  32. Knodel, J. J., Beauzay, P., Boetel, M., Prochaska, T., Chirumamilla, A. 2022 North Dakota Field Crop Insect Management Guide. , 23 North Dakota State University Extension Publication: North Dakota, USA. (2021).
  33. Yeo, H., Pell, J. K., Alderson, P. G., Clark, S. J., Pye, B. J. Laboratory evaluation of temperature effects on the germination and growth of entomopathogenic fungi and on their pathogenicity to two aphid species. Pest Management Science. 59 (2), 156-165 (2003).
  34. Erdos, Z., Chandler, D., Bass, C., Raymond, B. Controlling insecticide resistant clones of the aphid, Myzus persicae, using the entomopathogenic fungus Akanthomyces muscarius: fitness cost of resistance under pathogen challenge. Pest Management Science. 77 (11), 5286-5293 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Bestrijding van de mosterdbladluisbioassay met losgekoppelde bladerenvirulentiescreeninginoculatie van conidi nterugwinning van schimmelisolatenextractie van genomisch DNAPCR amplificatiebladluismortaliteit
Beoordeling van bladluis effect van entomopathogene schimmels tegen parthenogenetisch insect, mosterdluis, Lipaphis erysimi (Kalt.)
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.