Methodenartikel

Elektrische cel-substraatdetectie voor real-time evaluatie van toxicologische profielen van metaal-organische kaders

DOI:

10.3791/65313

⸱

26 mei 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University, 2Department of Anthropology for Energy, West Virginia University, 3Department of Hospitality and Tourism, West Virginia University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende studie evalueert het toxicologische profiel van een geselecteerd metaal-organisch raamwerk met behulp van elektrische celsubstraatimpedantiedetectie (ECIS), een real-time, high-throughput screeningstechniek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaal-organische raamwerken (MOF's) zijn hybriden die worden gevormd door de coördinatie van metaalionen en organische linkers in organische oplosmiddelen. De implementatie van MOFs in biomedische en industriële toepassingen heeft geleid tot bezorgdheid over hun veiligheid. Hierin werd het profiel van een geselecteerde MOF, een zeolitisch imidazolraamwerk, geëvalueerd bij blootstelling aan menselijke longepitheelcellen. Het platform voor evaluatie was een real-time techniek (d.w.z. elektrische cel-substraat impedantie sensing [ECIS]). Deze studie identificeert en bespreekt enkele van de schadelijke effecten van de geselecteerde MOF op de blootgestelde cellen. Bovendien toont deze studie de voordelen aan van het gebruik van de real-time methode ten opzichte van andere biochemische testen voor uitgebreide celevaluaties. De studie concludeert dat waargenomen veranderingen in celgedrag kunnen wijzen op mogelijke toxiciteit geïnduceerd bij blootstelling aan MOFs met verschillende fysisch-chemische kenmerken en de dosering van die kaders die worden gebruikt. Door veranderingen in celgedrag te begrijpen, voorziet men het vermogen om safe-by-design-strategieën van MOFs te verbeteren die worden gebruikt voor biomedische toepassingen door specifiek hun fysisch-chemische kenmerken aan te passen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metaal-organische raamwerken (MOF's) zijn hybriden gevormd door de combinatie van metaalionen en organische linkers 1,2 in organische oplosmiddelen. Vanwege de verscheidenheid van dergelijke combinaties bezitten MOFs structurele diversiteit3, instelbare porositeit, hoge thermische stabiliteit en hoge oppervlakten 4,5. Dergelijke kenmerken maken ze aantrekkelijke kandidaten in een verscheidenheid aan toepassingen, van gasopslag6,7 tot katalyse8,9, en van contrastmiddelen 10,11 tot medicijnafgifte-eenheden 12,13. De implementatie van MOFs in dergelijke toepassingen heeft echter aanleiding gegeven tot bezorgdheid over hun veiligheid voor zowel de gebruikers als het milieu. Voorbereidende studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat cellulaire functie en groei veranderen bij de blootstelling van cellen aan metaalionen of linkers die worden gebruikt voor MOF-synthese 1,14,15. Tamames-Tabar et al. toonden bijvoorbeeld aan dat ZIF-8 MOF, een op Zn gebaseerde MOF, leidde tot meer cellulaire veranderingen in een menselijke baarmoederhalskankercellijn (HeLa) en een muismacrofaagcellijn (J774) ten opzichte van op Zr gebaseerde en Fe-gebaseerde MOFs. Dergelijke effecten waren vermoedelijk te wijten aan de metaalcomponent van ZIF-8 (d.w.z. Zn), die mogelijk celapoptose zou kunnen induceren bij raamwerkdesintegratie en Zn-ionenafgifte1. Evenzo toonden Gandara-Loe et al. aan dat HKUST-1, een op Cu gebaseerde MOF, de hoogste vermindering van de levensvatbaarheid van muisretinoblastoomcellen veroorzaakte bij gebruik in concentraties van 10 μg / ml of meer. Dit was vermoedelijk te wijten aan het Cu-metaalion dat tijdens de synthese van dit raamwerk werd opgenomen en dat, eenmaal vrijgegeven, oxidatieve stress in de blootgestelde cellen kon induceren15.

Bovendien toonde analyse aan dat de blootstelling aan MOFs met verschillende fysisch-chemische kenmerken kon leiden tot verschillende reacties van blootgestelde cellen. Wagner et al. toonden bijvoorbeeld aan dat ZIF-8 en MIL-160 (een op Al gebaseerd raamwerk), gebruikt bij de blootstelling van een vereeuwigde menselijke bronchiale epitheelcel, leidden tot cellulaire reacties die afhankelijk waren van de fysisch-chemische eigenschappen van frameworks, namelijk hydrofobiciteit, grootte en structurele kenmerken16. Complementair toonden Chen et al. aan dat een concentratie van 160 μg / ml MIL-100 (Fe) blootgesteld aan menselijke normale levercellen (HL-7702) het grootste verlies aan cellulaire levensvatbaarheid veroorzaakte, vermoedelijk als gevolg van de metalen component van dit specifieke raamwerk (d.w.z. Fe17).

Hoewel deze studies de schadelijke effecten van MOFs op cellulaire systemen categoriseren op basis van hun fysisch-chemische kenmerken en blootstellingsconcentraties, waardoor potentiële zorgen ontstaan over de implementatie van het kader, vooral op biomedisch gebied, zijn de meeste van deze evaluaties gebaseerd op colorimetrische assays met één tijdspunt. Er werd bijvoorbeeld aangetoond dat wanneer (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) tetrazolium (MTT) en in water oplosbaar tetrazoliumzout (WST-1) assays werden gebruikt, deze biochemische reagentia konden leiden tot valse positieven bij hun interacties met de deeltjes waaraan de cellen ook werden blootgesteld18. Het tetrazoliumzout en de neutrale rode reagentia bleken een hoge adsorptie- of bindingsaffiniteit op de oppervlakken van de deeltjes te bezitten, wat resulteerde in signaalinterferentie van het middel19. Bovendien werd voor andere soorten testen, zoals flowcytometrie, waarvan eerder is aangetoond dat deze worden gebruikt voor het beoordelen van veranderingen in cellen die zijn blootgesteld aan MOFs20,21, aangetoond dat belangrijke problemen moeten worden omzeild om een levensvatbare analyse van de schadelijke effecten van deeltjes te overwegen. In het bijzonder moeten detectiebereiken van de grootte van de deeltjes, vooral in gemengde populaties zoals die worden aangeboden door MOFs of referenties van de deeltjes die worden gebruikt voor kalibratie vóór cellulaire veranderingen, worden aangepakt22. Er werd ook aangetoond dat de kleurstof die wordt gebruikt tijdens celetikettering voor dergelijke cytometrietests ook kan interfereren met de nanodeeltjes waaraan de cellen werden blootgesteld23.

Het doel van deze studie was om een real-time, high-throughput evaluatietest te gebruiken om veranderingen in celgedrag te beoordelen bij blootstelling aan een geselecteerde MOF. Real-time evaluaties kunnen helpen inzicht te geven in tijdsafhankelijke effecten, zoals gerelateerd aan de vensters van blootstellingen16. Verder geven ze informatie over veranderingen in cel-substraatinteracties, celmorfologie en cel-celinteracties, evenals hoe dergelijke veranderingen afhankelijk zijn van de fysisch-chemische eigenschappen van de materialen van belang en blootstellingstijden24,25 respectievelijk.

Om de validiteit en toepasbaarheid van de voorgestelde aanpak aan te tonen, werden menselijke bronchiale epitheelcellen (BEAS-2B), ZIF-8 (een hydrofoob raamwerk van zeolitisch imidazolaat16) en elektrische celsubstraatimpedantiedetectie (ECIS) gebruikt. BEAS-2B-cellen vertegenwoordigen een model voor longblootstelling 26 en zijn eerder gebruikt om veranderingen te evalueren bij de blootstelling van cellen aan nanoclays en hun thermisch afgebroken bijproducten26,27,28, evenals om de toxiciteit van nanomaterialen te beoordelen, zoals enkelwandige koolstofnanobuizen (SWCNT's)18. Bovendien worden dergelijke cellen al meer dan 30 jaar gebruikt als model voor de longepitheelfunctie29. ZIF-8 werd gekozen vanwege de brede implementatie in katalyse30 en als contrastmiddelen 31 voor bioimaging en medicijnafgifte32, en dus voor het uitgebreide potentieel voor longblootstelling tijdens dergelijke toepassingen. Ten slotte werd ECIS, de niet-invasieve, real-time techniek, eerder gebruikt om veranderingen in celtrouw, proliferatie, motiliteit en morfologie te evalueren 16,26 als gevolg van een verscheidenheid aan interacties tussen analyten (zowel materialen als geneesmiddelen) en blootgestelde cellen in realtime 16,18,28. ECIS gebruikt een wisselstroom (AC) om de impedantie van cellen geïmmobiliseerd op gouden elektroden te meten, waarbij de impedantieveranderingen inzicht geven in veranderingen in weerstand en capaciteit op de cel-goudsubstraatinterface, barrièrefunctie zoals geïnduceerd door cel-celinteracties en over-cel laagdekking van dergelijke gouden elektroden33,34. Het gebruik van ECIS maakt kwantitatieve metingen op nanoschaal mogelijk op een niet-invasieve, real-time manier26,34.

Deze studie beoordeelt en vergelijkt de eenvoud en het gemak van evaluatie van MOF-geïnduceerde veranderingen in cellulair gedrag in real-time met single-point assay evaluaties. Een dergelijke studie zou verder kunnen worden geëxtrapoleerd voor het evalueren van celprofielen in reactie op blootstelling aan andere deeltjes van belang, waardoor veilige deeltjestests door ontwerp mogelijk worden gemaakt en vervolgens kunnen worden geholpen bij de implementatie. Bovendien zou deze studie een aanvulling kunnen zijn op genetische en cellulaire testen die single-point evaluaties zijn. Dit zou kunnen leiden tot een beter geïnformeerde analyse van de schadelijke effecten van deeltjes op de cellulaire populatie en zou kunnen worden gebruikt voor het screenen van de toxiciteit van dergelijke deeltjes op een maniermet een hoge doorvoer 16,35,36.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ZIF-8 synthese

  1. Gebruik voor dit voorbeeld een massaverhouding van 1:10:100 (metaal:linker:oplosmiddel) om de ZIF-8 te synthetiseren. Meet hiervoor zinknitraathexahydraat en noteer de meting. Gebruik de voorbeeldmassaverhouding om de hoeveelheid te berekenen die nodig is voor de linker, 2-methylimidazol en het oplosmiddel (d.w.z. methanol).
  2. Plaats het zinknitraathexahydraat en de linker in twee verschillende glazen injectieflacons. Voeg de helft van de berekende hoeveelheid methanol toe aan het zinknitraathexahydraat en de andere helft aan de linker. Laat elke oplossing oplossen.
  3. Combineer de twee oplossingen (d.w.z. oplossingen die respectievelijk het metaal en de linker bevatten). Plaats de container met de gecombineerde oplossing voor de reactie op een roerplaat en roer gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (RT) bij 700 tpm.

2. ZIF-8 collectie

  1. Zodra de bovenstaande reactie is beëindigd (d.w.z. na 24 uur), plaatst u de oplossing in centrifugebuizen van 50 ml en centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 3,075 x g (gebruik gelijke hoeveelheden en balanceer de rotor). Verwijder een van de supernatanten uit de gecentrifugeerde buizen.
  2. Voeg methanol (5-15 ml) toe aan de centrifugebuizen en dispergeer de deeltjes opnieuw.
  3. Herhaal de centrifugeer- en wasstappen nog minstens twee tot vier keer. Na de laatste wasbeurt ontlaadt u het supernatant.
    OPMERKING: De wasstappen verwijderen alle niet-neergeslagen soorten.
  4. Verwijder de deksels van de buizen en plaats parafilm tape over de bovenkant; prik vervolgens gaten in de parafilm. Plaats de buis(sen) met het monster in een vacuümkamer bij RT om gedurende 24 uur te drogen.

3. ZIF-8 oppervlaktemorfologie (scanning elektronenmicroscopie [SEM])

  1. Monteer de droge poeders van ZIF-8 op koolstoftape en sputter gedurende 120 s met goud-palladium om te voorkomen dat er tijdens de SEM-analyse opladen kan optreden.
  2. Stel de versnellingsspanning van de microscoop in op 15 kV. Breng de deeltjes in beeld en pas de vergroting aan (vergrotingen van 500x, 1.000x, 1.500x, 4.000x, 10.000x, 20.000x, 30.000x en 40.000x werden gebruikt.)
  3. Beeld de deeltjes af onder de vergroting die zowel een duidelijke deeltjesgrootte als morfologische beoordeling mogelijk maakt (aanbevolen om bereiken voor deeltjes van 5 μm, 10 μm en 20 μm te overwegen).
  4. Verzamel gegevens uit ten minste drie verschillende gezichtsvelden en overweeg voor elk gezichtsveld verschillende vergrotingen.

4. ZIF-8 elementaire samenstelling

  1. Volg de stappen voor SEM-beeldvorming.
  2. Analyseer met behulp van de energiedispersieve röntgenspectroscopie (EDX) van de SEM-microscoop de elementaire samenstelling van het monster.
  3. Zorg ervoor dat de SEM-versnellingsspanning en -vergroting overeenkomen met de EDX-monitor. Schakel de infraroodcamera op de SEM-microscoop uit.
  4. Ga op de EDX-monitor naar Spectrum verzamelen en voer een verzameltijd van 200 s in. Dit wordt aanbevolen om deeltjeslading en desintegratie te voorkomen die tot valse evaluaties kunnen leiden.
  5. Verzamel gegevens uit ten minste drie verschillende gezichtsvelden. Zodra de verzameling is voltooid, analyseert u de gegevens en identificeert u de interessante elementen.

5. Celkweek

  1. Kweek vereeuwigde BEAS-2B cellen in media aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS) en 0,2% penicilline/streptomycine.
    OPMERKING: Passages tussen 5-10 moeten worden gebruikt om ervoor te zorgen dat er geen fenotypische veranderingen hebben plaatsgevonden in de gebruikte celbatch37 (alle reagentia zijn opgenomen in de materiaaltabel).
  2. Neem een celkweekplaat van 100 mm en plaats 10 ml van de media op de plaat. Voeg 1 ml van de BEAS-2B celoplossing toe aan de plaat.
  3. Plaats de plaat in een incubator (37 °C, 5% CO2) en laat de cellen groeien.
  4. Controleer de plaat na 24 uur om te bepalen of de cellen 80% confluentie hebben bereikt. Hierin verwijst de 80% confluentie naar het percentage van het oppervlak bedekt door aangehechte cellen. Zo niet, verander dan de media en laat de cellen groeien totdat het confluentieniveau van 80% is bereikt.

6. Celtelling

  1. Zodra de cellen op de plaat een samenvloeiing van 80% hebben bereikt, verwijdert u de media van de plaat. Was de plaat met 5 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
  2. Verwijder de PBS van de plaat. Voeg 2 ml trypsine toe aan de plaat en plaats deze gedurende 2 minuten in de couveuse (37 °C, 5% CO2).
  3. Voeg 2 ml media toe aan de plaat en pipetteer de media op en neer om de cellen van de plaat te verwijderen. Breng de oplossing over in een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 123 x g .
  4. Verwijder het supernatant uit de tube en voeg 2 ml media toe. Pipetteer de media op en neer om de cellen opnieuw te verspreiden.
  5. Voeg met behulp van een buis van 1,5 ml 20 μL trypan blauw en vervolgens 20 μL van de celoplossing toe (1:1 verhouding trypan blue:cell oplossing).
  6. Plaats 10 μL van het celmengsel op een glasplaat en plaats het op een automatische celteller. Wacht tot het scherm scherp wordt gesteld en selecteer vervolgens vastleggen.
  7. Het scherm toont de live celnummers en de levensvatbaarheid van de cel. Het meetbereik strekt zich uit van 1 x 104-1 x 107 cellen.
  8. U kunt de cellen ook handmatig tellen met behulp van een hemocytometer.
    1. Voeg hiervoor 15-20 μL van de trypan blauwbehandelde celoplossing toe aan de hemocytometer.
    2. Gebruik een rechtopstaande microscoop met een 10x objectieve focus op de rasterlijnen van de hemocytometer.
    3. Tel het aantal cellen in de vier buitenste vierkanten en deel het aantal door vier. Vermenigvuldig vervolgens met 10.000 om het aantal levende cellen te verkrijgen.
    4. Om de levensvatbaarheid van cellen te berekenen, telt u het aantal levende en dode cellen bij elkaar op om het totale celgetal te verkrijgen en deelt u vervolgens het aantal levende cellen door het totale aantal cellen.

7. ZIF-8 dosispreparaat

  1. Maak een ZIF-8 stamoplossing van 1 mg/ml. Meet hiervoor de hoeveelheid ZIF-8 en voeg gedeïoniseerd (DI) water toe aan de deeltjes om een concentratie van 1 mg / ml te bereiken.
  2. Soniceer (stel de sonicator in op sonics) de ZIF-8 stockoplossing gedurende 2 minuten met intervallen van 30 s in een waterbad.
  3. Maak verschillende doses ZIF-8 voor cellulaire blootstellingen door de hoeveelheid stockoplossing en dulbecco's gemodificeerde adelaarmedium (DMEM) te berekenen die nodig is om de gewenste doses te bereiken metbehulp van de vergelijking C 1 V1 = C 2 V2. De doses variëren van 0-950 μg / ml.
    OPMERKING: In dit experiment werden doses van 0 μg/ml, 1 μg/ml, 10 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml en 950 μg/ml geselecteerd.

8. Half-maximale remmende concentratie (IC 50)

  1. Na celtelling, zaad de BEAS-2B cellen met een dichtheid van 4 x 104 cellen / ml in een 96-well plaat, met een volume van 100 μL / put.
    1. Om een dichtheid van 4 x 104 cellen/ml te bereiken, gebruikt u C 1 V1= C 2 V2om de hoeveelheid celoplossing te berekenen die met de media moet worden gecombineerd.
    2. Zorg ervoor dat u lege putten voor elke dosis onderhoudt; laat deze putten leeg tot ZIF-8 blootstelling.
  2. Plaats de 96-putplaat in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 en laat de cellen gedurende 24 uur uitgroeien tot een confluente monolaag.
  3. Verwijder de media uit de putjes en stel de BEAS-2B-cellen bloot aan ZIF-8-doses variërend van 0-950 μg / ml. Voeg 100 μL ZIF-8 toe aan hun respectievelijke blanco- en celputten.
  4. Plaats de 96-putplaten terug in de incubator voor een belichtingstijd van 48 uur.
  5. Voeg na de blootstelling 10 μL 4-[3-(4-idofenyl)-2-(4-nitrofenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzeendisulfonaat (WST-1) toe aan elk putje (blanco en celputten) en incubeer gedurende 2 uur. De media blijven in de putten; De verhouding is 1:10 (Reagens:Media).
  6. Lees de veranderingen in absorptie op een plaatlezer met een absorptie van 485 nm.
  7. Bereken de levensvatbaarheid van de cel via de software om de IC 50-waarde te bepalen (zie sectie10 ).

9. Elektrische cel-substraat impedantie sensing (ECIS)

  1. Gebruik een 96-well plaat (96W10idf) om ECIS-analyse uit te voeren. De plaat28 bevat inter-digitated vingerverbindingselektroden die een gebied van ongeveer 4 mm2 beslaan.
  2. Test eerst of alle putten worden uitgelezen door de sensoren. Plaats hiervoor de 96-putplaat op het bronstation en klik op de knop Instellen .
  3. Als de putten goed zijn aangesloten, verschijnt er groen; Alle niet-aangesloten putten worden geïdentificeerd als rood. Als een dergelijk geval zich voordoet, verwijdert u de putplaat en plaatst u deze opnieuw en klikt u nogmaals op de knop Instellen , totdat alle putten levensvatbare groene metingen bieden.
  4. Stabiliseer de elektroden gedurende 40 minuten met 200 μL media per put om mogelijke drift te voorkomen. Voeg 200 μL media toe aan elke put die wordt gebruikt en plaats vervolgens de 96-putplaat op het ECIS-station. Klik op Setup/Check om te controleren of de plaat correct is aangesloten. Klik op Stabiliseren.
  5. Zodra de stabilisatie is voltooid, verwijdert u de plaat uit het station en verwijdert u de media uit elke put.
  6. Zaai de BEAS-2B-cellen met een dichtheid van 4 x 104 cellen/ml, met een volume van 100 μL per put, in de putjes met de cellen en plaats de plaat op het ECIS-station in de incubator.
  7. Klik op de monitor op Controleren om te bepalen of alle elektroden worden gelezen door de sensoren op het station.
  8. Stel de tijdloopmeting in door Meervoudige frequentie/tijd (MFT) te selecteren. Het programma meet elke put op zeven verschillende frequenties.
  9. Klik op Start en laat het 24 uur draaien, zodat de cellen een confluente monolaag kunnen vormen.
  10. Na 24 uur zullen de putten met cellen een verhoogde weerstand op de monitor vertonen. Dit is een indicator die cellen aan de elektroden hebben bevestigd.
  11. Druk op Pauzeren op de monitor om het verzamelen van gegevens te stoppen.
  12. Maak de ZIF-8-doses op, boven en onder de berekende IC50-waarde door de stappen te volgen die zijn beschreven in rubriek 7 hierboven.
  13. Stel de ZIF-8 nanodeeltjes bloot aan hun respectievelijke blanco- en celputten met een volume van 100 μL per put en plaats de 96-putplaat terug op het station.
  14. Klik nogmaals op Controleren op de monitor om er zeker van te zijn dat de sensoren alle elektroden lezen. Klik op Hervatten en laat het systeem 72 uur draaien om het mobiele gedrag en de bijlage te controleren.
  15. Zodra het verzamelen van gegevens is voltooid, klikt u op Voltooien op de monitor. Als u het bestand wilt opslaan, klikt u op Bestand > Opslaan als. Sla de gegevens op als een spreadsheetbestand.
  16. Om de alfaparameters te krijgen, klikt u op Model. Klik in het pop-upvenster op Media-Only Well en selecteer vervolgens het putje met alleen media.
  17. Klik op Set Ref. Klik op de monitor op Zoeken.
  18. Als het goed dat in het systeem wordt weergegeven niet hetzelfde is als het gekozen systeem, herhaalt u stap 9.16.
  19. Klik op Instellen. Klik op Fit T-Range om het gewenste tijdsbereik voor gegevensverzameling te bepalen.
  20. Terwijl het wordt verwerkt, klikt u op Alpha. Wanneer het systeem klaar is met de analyse, klikt u op RbA opslaan en slaat u deze op als een spreadsheetbestand.
    OPMERKING: Raadpleeg de ECIS-handleiding, die te vinden is op de website van de fabrikant38.

10. Data-analyse

  1. SEM
    1. Open de beeldbewerkingssoftware om de SEM-beelden te analyseren. Klik op Bestand > openen en selecteer vervolgens de afbeelding die u wilt analyseren.
    2. Klik op Afbeelding > Typ > 8 bits om de afbeelding naar grijswaarden te converteren om de drempelbewerkingen uit te voeren.
    3. Kalibreer de afstandsmeting van pixels tot micron. Klik op het gereedschap Rechte lijn en traceer de lengte van elk te meten deeltje.
    4. Klik op Analyseren en vervolgens op Schaal instellen. De bekende afstand wordt ingesteld op de lengte van de grootte van de schaalbalk op de SEM-afbeelding. De bekende lengte-eenheid wordt ingesteld op micron. Vink Algemeen aan en druk op OK.
    5. Klik op het gereedschap Rechtlijnig , traceer de diameter van het deeltje en selecteer vervolgens Analyseren en meten. Noteer het lengteresultaat.
    6. Herhaal dit voor alle verzamelde afbeeldingen. Gemiddelde van alle diameters van ten minste 60 deeltjes voor een geschikte statistische evaluatie.
  2. EDX
    1. Gemiddelde van alle gewichtspercentages van elk element samen van alle verzamelde afbeeldingen (zie edx-sectie hierboven).
    2. Plot met behulp van een spreadsheet een staafdiagram van elk element op de x-as en hun gemiddelde elementaire gewichtspercentage op de y-as.
  3. IC50
    1. Gemiddelde van de lege putten en gemiddelde van de dosisputten voor elke replicatie.
    2. Bereken de aangepaste blanco door het blancogemiddelde van de controle af te trekken van het blancogemiddelde van de dosis. Bereken de werkelijke celwaarde voor elke dosis door de aangepaste blanco af te trekken van de gemiddelde dosiswaarde.
    3. Trek de aangepaste blancowaarde voor elke dosis af van de gemiddelde controlewaarde. Bereken de levensvatbaarheid van elke dosis met behulp van de vergelijking: levensvatbaarheid van de cel = (werkelijke celwaarde / (controlewaarde - aangepaste blancowaarde)) x 100.
    4. Herhaal dit voor alle andere replicaties.
    5. Gemiddelde van de levensvatbaarheid van de cellen voor elke replicatie samen om de uiteindelijke levensvatbaarheid van de cel voor elke dosis te krijgen.
    6. Kies in de software het tabblad XY op het scherm.
    7. Voer de concentratiewaarden (dosiswaarden) in de kolom X en de levensvatbaarheid van de cel (%) van elke dosis in de kolom Y in.
    8. Transformeer de X-waarden door te klikken op Analyseren > Transformeren > OK en Transformeren X = Log(X).
    9. Normaliseer de Y-waarden door het blad Getransformeerde gegevens te selecteren, op Analyseren te klikken en vervolgens Normaliseren te selecteren.
    10. Selecteer het gegevensblad Normaliseren van transformatie , klik op Analyseren en selecteer Niet-lineaire regressie (Curve Fit). Selecteer Dosis-Respons-Inhibitie en klik op Log(Inhibitor) Vs. Response-Variable Slope (Four Parameters). Klik op OK om de resultaten te bekijken.
  4. Eis
    1. Neem uit de spreadsheet de weerstandskolommen (ohm) voor elke replicatie (lege putten en doseerputten) en neem ze samen gemiddeld vanaf de 4.000 Hz-frequentie. Deze frequentie maakt cel-cel contact evaluatie38 mogelijk.
    2. Bereken de gecorrigeerde weerstand door de gemiddelde blanco af te trekken van de gemiddelde dosis voor elke replicatie. Het gemiddelde van de gecorrigeerde weerstand voor de replicaten voor elke dosis.
    3. Herhaal dezelfde stappen voor de alfawaarden om de gemiddelde alfaparameter te berekenen. Zet de x-as uit als tijd (h) en de y-as als de gemiddelde weerstands-/alfawaarden voor elke dosiswaarde.

11. Statistische analyse

  1. SEM
    1. Voer een standaarddeviatie uit in het spreadsheetbestand waarin de gemiddelde diameters van de ZIF-8-deeltjes zijn berekend.
    2. Gebruik de STDEV-functie in de spreadsheet, markeer de gegevens van de 60 deeltjes en klik op Enter. Grafiek de standaarddeviatie voor elke berekende gemiddelde diameter.
  2. EDX
    1. Bereken net als bij SEM (stappen 11.1.1-11.1.2) de standaarddeviatie voor elke gemiddelde elementaire compositie met behulp van de functie STDEV in de spreadsheet. Maak een grafiek van de standaarddeviaties voor elke gemiddelde elementaire samenstelling.
  3. IC50
    1. Open de software die wordt gebruikt om de IC50 te berekenen en klik op Gegroepeerd gegevensblad.
    2. Voer de ZIF-8-doses in de rijen met het label Groep A, Groep B, enz. In. Voer de gemiddelde levensvatbaarheid van de cel voor elke dosis in en repliceer in de kolom die overeenkomt met de dosis ZIF-8.
    3. Klik op Analyseren en selecteer onder Kolomanalyses de optie One-way ANOVA (en niet-parametrisch of gemengd).
    4. Selecteer op het tabblad Experimenteel ontwerp de optie Geen overeenkomst of koppeling. Selecteer onder Gaussische verdeling van residuen de optie Ja gebruik ANOVA. Selecteer ten slotte Ja gewone ANOVA-test gebruiken onder Aannemen van gelijke SD's.
    5. Selecteer op het tabblad Meerdere vergelijkingen de optie Vergelijk het gemiddelde van elke kolom met het gemiddelde van een besturingselementkolom. Klik op OK om de resultaten te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van een gemeenschappelijk in vitro model cellijn39 (BEAS-2B), was deze studie gericht op het aantonen van de haalbaarheid en toepasbaarheid van ECIS om veranderingen in celgedrag te beoordelen bij blootstelling aan een in het laboratorium gesynthetiseerde MOF. Deze beoordeling van veranderingen werd aangevuld met analyse door middel van conventionele colorimetrische assays.

De fysisch-chemische kenmerken van het raamwerk werden eerst geëvalueerd om d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eerdere analyse toonde aan dat ECIS kan worden gebruikt om het gedrag te beoordelen van cellen die worden blootgesteld aan analyten (d.w.z. koolstofnanobuisjes35, geneesmiddelen43 of nanoklei16). Bovendien gebruikten Stueckle et al. ECIS om de toxiciteit van BEAS-2B-cellen blootgesteld aan nanoclays en hun bijproducten te evalueren en vonden dat het cellulaire gedrag en de hechting afhankelijk waren van de fysisch-chemische kenmerken van dergelijke m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs melden geen belangenconflicten in dit werk.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door het T32-programma van het National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (T32 GM133369) en de National Science Foundation (NSF 1454230). Daarnaast worden WVU Shared Research Facilities en Applied Biophysics assistentie en ondersteuning erkend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 4-[3-(4-idofenyl)-2-(4-nitrofenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzeen disulfonaat (WST-1 assay) Roche5015944001
0,25% Trypsine-EDTA (1x)Gibco25255-056
100 mm platenCorning430167
1300 Series A2 biofume-kapThermo Scientific323TS
2510 Branson bad sonicatorProcess Equipment & Supply, Inc. 251OR-DTH
2-methylimidazool, 97%Alfa Aesar693-98-1
5 mL steriele microbuisjesArgos TechnologiesT2076S-CA
50 mL  buisjes Falcon352098
96W10idf wel platenApplied Biophysics 96W10idf PET
96-wel platenFisherbrandFB012931
BiorenderBiorenderN/A
Countess celtellingkamersInvitrogenC10283
Countess II FL geautomatiseerde celtellerLife TechnologiesC0916-186A-0303
Denton Desk V sputter- en koolstoflatDenton VacuumN/A
Dimethylsulfoxide Corning25-950-CQC
DPBS/GemodificeerdCytivaSH30028.02
Dulbecco's gemodificeerd Eagle mediumCorning10-014-CV
ECIS-ZΘApplied Biophysics ABP 1129
ExcelMicrosoftVersie 2301
Falcon buisjes (15 mL)Corning352196
Foetaal bovien serumGibco16140-071
FLUOstar OPTIMA platelezerBMG LABTECH413-2132
GraphPad Prism Software (9.0.0)GraphPad Software, LLCVersie 9.0.0
HERAcell 150i CO2 IncubatorThermo Scientific50116047
Hitachi S-4700 veld emissie rasterelektronenmicroscoop uitgerust met energiedispersief röntgen Hitachi High-Technologies CorporationS4700 en EDAX TEAM analysesoftware
ImageJ softwareNational Institutes of HealthN/A
Geïmmortaliseerde humane bronchiale epitheelcellenAmerican Type Culture CollectionCRL-9609
Isotemp vriezerFisher Scientific 
Methanol, 99%Fisher Chemical67-56-1
Parafilm afdichtfolieThe Lab DepotHS234526A
Penicilline/SteptomycineGibco15140-122
Sorvall Legend X1R Centrifuge Thermo Scientific75004220
Sorvall T 6000BDU PONT T6000B
Trypanblauw, 0,4% oplossing in PBSMP Biomedicals, LLC1691049
VacuumkamerBelart999320237
Zinknitraat hexahydraat, 98% extra zuiverAcros Organic101-96-18-9

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tamames-Tabar, C., et al. Cytotoxicity of nanoscaled metal-organic frameworks. Journal of Materials Chemistry. B. 2 (3), 262-271 (2014).
  2. Lin, W. X., et al. Low cytotoxic metal-organic frameworks as temperature-responsive drug carriers. ChemPlusChem. 81 (8), 804-810 (2016).
  3. Vasconcelos, I. B., et al. Cytotoxicity and slow release of the anti-cancer drug doxorubicin from ZIF-8. RSC Advances. 2 (25), 9437-9442 (2012).
  4. Yang, B. C., Shen, M., Liu, J. Q., Ren, F. Post-synthetic modification nanoscale metal-organic frameworks for targeted drug delivery in cancer cells. Pharmaceutical Research. 34 (11), 2440-2450 (2017).
  5. Lucena, M. A. M., et al. Application of the metal-organic framework Eu(BTC) as a luminescent marker for gunshot residues: A synthesis, characterization, and toxicity study. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (5), 4684-4691 (2017).
  6. Kayal, S., Sun, B. C., Chakraborty, A. Study of metal-organic framework MIL-101(Cr) for natural gas (methane) storage and compare with other MOFs (metal-organic frameworks). Energy. 91, 772-781 (2015).
  7. Gutov, O. V., et al. Water-stable zirconium-based metal-organic framework material with high-surface area and gas-storage capacities. Chemistry. 20 (39), 12389-12393 (2014).
  8. Ghorbanloo, M., Safarifard, V., Morsali, A. Heterogeneous catalysis with a coordination modulation synthesized MOF: morphology-dependent catalytic activity. New Journal of Chemistry. 41 (10), 3957-3965 (2017).
  9. Valvekens, P., et al. Base catalytic activity of alkaline earth MOFs: a (micro) spectroscopic study of active site formation by the controlled transformation of structural anions. Chemical Science. 5 (11), 4517-4524 (2014).
  10. Taylor, K. M. L., Rieter, W. J., Lin, W. B. Manganese-based nanoscale metal-organic frameworks for magnetic resonance imaging. Journal of the American Chemical Society. 130 (44), 14358-14359 (2008).
  11. Taylor-Pashow, K. M. L., Della Rocca, J., Xie, Z. G., Tran, S., Lin, W. B. Postsynthetic modifications of iron-carboxylate nanoscale metal-organic frameworks for imaging and drug delivery. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14261-14263 (2009).
  12. Kundu, T., et al. Mechanical downsizing of a gadolinium(III)-based metal-organic framework for anticancer drug delivery. Chemistry. 20 (33), 10514-10518 (2014).
  13. Orellana-Tavra, C., et al. Drug delivery and controlled release from biocompatible metal-organic frameworks using mechanical amorphization. Journal of Materials Chemistry. B. 4 (47), 7697-7707 (2016).
  14. Su, H. M., et al. A highly porous medical metal-organic framework constructed from bioactive curcumin. Chemical Communications. 51 (26), 5774-5777 (2015).
  15. Gandara-Loe, J., et al. Metal-organic frameworks as drug delivery platforms for ocular therapeutics. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (2), 1924-1931 (2019).
  16. Wagner, A., et al. Toxicity screening of two prevalent metal organic frameworks for therapeutic use in human lung epithelial cells. International Journal of Nanomedicine. 14, 7583-7591 (2019).
  17. Chen, G. S., et al. In vitro toxicity study of a porous iron(III) metal-organic framework. Molecules. 24 (7), 1211(2019).
  18. Eldawud, R., Wagner, A., Dong, C. B., Rojansakul, Y., Dinu, C. Z. Electronic platform for real-time multi-parametric analysis of cellular behavior post-exposure to single-walled carbon nanotubes. Biosensors & Bioelectronics. 71, 269-277 (2015).
  19. Kroll, A., Pillukat, M. H., Hahn, D., Schnekenburger, J. Current in vitro methods in nanoparticle risk assessment: Limitations and challenges. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (2), 370-377 (2009).
  20. Lucena, F. R. S., et al. Induction of cancer cell death by apoptosis and slow release of 5-fluoracil from metal-organic frameworks Cu-BTC. Biomedicine & Pharmacotherapy. 67 (8), 707-713 (2013).
  21. Orellana-Tavra, C., et al. Tuning the endocytosis mechanism of Zr-based metal-organic frameworks through linker functionalization. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (41), 35516-35525 (2017).
  22. Zucker, R. M., Ortenzio, J. N. R., Boyes, W. K. Characterization, detection, and counting of metal nanoparticles using flow cytometry. Cytometry. Part A. 89 (2), 169-183 (2016).
  23. Robson, A. L., et al. Advantages and limitations of current imaging techniques for characterizing liposome morphology. Frontiers in Pharmacology. 9, 80(2018).
  24. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (17), 7896-7900 (1991).
  25. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  26. Wagner, A., et al. Toxicity evaluations of nanoclays and thermally degraded byproducts through spectroscopical and microscopical approaches. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861, 3406-3415 (2017).
  27. Wagner, A., et al. Early assessment and correlations of nanoclay's toxicity to their physical and chemical properties. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (37), 32323-32335 (2017).
  28. Wagner, A., et al. Incineration of nanoclay composites leads to byproducts with reduced cellular reactivity. Scientific Reports. 8 (1), 10709(2018).
  29. Zhao, F., Klimecki, W. T. Culture conditions profoundly impact phenotype in BEAS-2B, a human pulmonary epithelial model. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 945-951 (2015).
  30. Wu, S. X., Wang, W. H., Fang, Y. Z., Kong, X. J., Liu, J. H. Efficient Friedel-Crafts acylation of anisole over silicotungstic acid modified ZIF-8. Reaction Kinetics Mechanisms and Catalysis. 122, 357-367 (2017).
  31. Shu, F. P., et al. Fabrication of a hyaluronic acid conjugated metal organic framework for targeted drug delivery and magnetic resonance imaging. RSC Advances. 8 (12), 6581-6589 (2018).
  32. Shi, Z. Q., et al. FA-PEG decorated MOF nanoparticles as a targeted drug delivery system for controlled release of an autophagy inhibitor. Biomaterials Science. 6 (10), 2582-2590 (2018).
  33. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).
  34. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  35. Eldawud, R., et al. Carbon nanotubes physicochemical properties influence the overall cellular behavior and fate. Nanoimpact. 9, 72-84 (2018).
  36. An, Y., Jin, T. Y., Zhang, F., He, P. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) for profiling cytotoxicity of cigarette smoke. Journal of Electroanalytical Chemistry. 834, 180-186 (2019).
  37. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  38. Applied Biophysics, Allied Biophysics. , Available from: https://biophysics.com (2023).
  39. Park, Y. H., Kim, D., Dai, J., Zhang, Z. Human bronchial epithelial BEAS-2B cells, an appropriate in vitro model to study heavy metals induced carcinogenesis. Toxicology and Applied Pharmacology. 287 (3), 240-245 (2015).
  40. Yang, F., et al. Morphological map of ZIF-8 crystals with five distinctive shapes: Feature of filler in mixed-matrix membranes on C3H6/C3H8 separation. Chemistry of Materials. 30 (10), 3467-3473 (2018).
  41. Rose, O. L., et al. Thin films of metal-organic framework interfaces obtained by laser evaporation. Nanomaterials. 11 (6), 1367(2021).
  42. Stueckle, T. A., et al. Impacts of organomodified nanoclays and their incinerated byproducts on bronchial cell monolayer integrity. Chemical Research in Toxicology. 32 (12), 2445-2458 (2019).
  43. Eldawud, R., et al. Potential antitumor activity of digitoxin and user-designed analog administered to human lung cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1864 (11), 129683(2020).
  44. Zhuang, J., et al. Optimized metal-organic-framework nanospheres for drug delivery: Evaluation of small-molecule encapsulation. ACS Nano. 8 (3), 2812-2819 (2014).
  45. Eldawud, R., et al. Combinatorial approaches to evaluate nanodiamond uptake and induced cellular fate. Nanotechnology. 27 (8), 085107(2016).
  46. Houthaeve, G., De Smedt, S. C., Braeckmans, K., De Vos, W. H. The cellular response to plasma membrane disruption for nanomaterial delivery. Nano Convergence. 9 (1), 6(2022).
  47. Otero-Gonzalez, L., Sierra-Alvarez, R., Boitano, S., Field, J. A. Application and validation of an impedance-based real time cell analyzer to measure the toxicity of nanoparticles impacting human bronchial epithelial cells. Environmental Science & Technology. 46 (18), 10271-10278 (2012).
  48. Ibarguren, M., Lopez, D. J., Escriba, P. V. The effect of natural and synthetic fatty acids on membrane structure, microdomain organization, cellular functions and human health. Biochimica et Biophysica Acta. 1838 (6), 1518-1528 (2014).
  49. Nor, Y. A., et al. Shaping nanoparticles with hydrophilic compositions and hydrophobic properties as nanocarriers for antibiotic delivery. ACS Central Science. 1 (6), 328-334 (2015).
  50. Farcal, L., et al. Comprehensive in vitro toxicity testing of a panel of representative oxide nanomaterials: First steps towards an intelligent testing strategy. PLoS One. 10 (5), e0127174(2015).
  51. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  52. Xiao, C. D., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: Concentration and time response function approach. Analytical Chemistry. 74 (22), 5748-5753 (2002).
  53. Coyle, J. P., et al. Carbon nanotube filler enhances incinerated thermoplastics-induced cytotoxicity and metabolic disruption in vitro. Particle and Fibre Toxicology. 17 (1), 40(2020).
  54. Yu, M. H., et al. Hyaluronic acid modified mesoporous silica nanoparticles for targeted drug delivery to CD44-overexpressing cancer cells. Nanoscale. 5 (1), 178-183 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Metaal organische raamwerkenMOF toxiciteitelektrische celsensoringreal time celmonitoringmenselijk longepitheelzeoliet imidazoolraamwerkimpedantiesensoringnanomateriaaltoxiciteitbiomedische toepassingenanalyse van celgedrag

Gerelateerde artikelen