Methodenartikel

Een geïntegreerde workflow om de promotor-centrische spatio-temporele genoomarchitectuur in schaarse celpopulaties te bestuderen

DOI:

10.3791/65316

⸱

21 april 2023

 ,  ,  ,  , 
1Josep Carreras Leukaemia Research Institute, 2Barcelona Supercomputing Center, 3Catalan Institution for Research and Advanced Studies (ICREA), 4Institute for Health Science Research Germans Trias i Pujol

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genexpressie wordt gereguleerd door interacties van genpromotors met distale regulerende elementen. Hier beschrijven we hoe low input Capture Hi-C (liCHi-C) de identificatie van deze interacties in zeldzame celtypen mogelijk maakt, die voorheen niet meetbaar waren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spatiotemporale gentranscriptie wordt strak gereguleerd door distale regulerende elementen, zoals versterkers en geluiddempers, die afhankelijk zijn van fysieke nabijheid met hun doelgenpromotors om transcriptie te regelen. Hoewel deze regulerende elementen gemakkelijk te identificeren zijn, zijn hun doelgenen moeilijk te voorspellen, omdat de meeste celtypespecifiek zijn en kunnen worden gescheiden door honderden kilobases in de lineaire genoomsequentie, waarbij andere niet-doelgenen worden overgeslagen. Sinds enkele jaren is Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) de gouden standaard voor de associatie van distale regulerende elementen aan hun doelgenen. PCHi-C is echter afhankelijk van de beschikbaarheid van miljoenen cellen, waardoor de studie van zeldzame celpopulaties zoals die gewoonlijk worden verkregen uit primaire weefsels, wordt verboden. Om deze beperking te overwinnen, is low input Capture Hi-C (liCHi-C), een kosteneffectieve en aanpasbare methode om het repertoire van distale regulerende elementen te identificeren die elk gen van het genoom beheersen, ontwikkeld. liCHi-C vertrouwt op een vergelijkbaar experimenteel en computationeel raamwerk als PCHi-C, maar door minimale buisveranderingen toe te passen, de reagensconcentratie en -volumes te wijzigen en stappen te verwisselen of te elimineren, is het goed voor minimaal materiaalverlies tijdens de bouw van de bibliotheek. Gezamenlijk maakt liCHi-C de studie van genregulatie en spatiotemporale genoomorganisatie mogelijk in de context van ontwikkelingsbiologie en cellulaire functie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temporele genexpressie stimuleert celdifferentiatie en, uiteindelijk, de ontwikkeling van organismen, en de verandering ervan is nauw verbonden met een breed scala aan ziekten 1,2,3,4,5. Gentranscriptie wordt fijn gereguleerd door de werking van regulerende elementen, die kunnen worden geclassificeerd als proximaal (d.w.z. genbevorderaars) en distale (bijv. versterkers of geluiddempers), waarvan de laatste zich vaak ver van hun doelgenen bevinden en fysiek met hen interageren door chromatinelussen om genexpressie 6,7,8 te moduleren.

De identificatie van distale regulerende regio's in het genoom is een zaak waarover algemeen wordt gesproken, aangezien deze regio's specifieke histonmodificaties 9,10,11 bevatten en specifieke transcriptiefactorherkenningsmotieven bevatten, die fungeren als wervingsplatforms voor hen12,13,14. Trouwens, in het geval van enhancers en super-enhancers 15,16, hebben ze ook een lage nucleosoombezetting 17,18 en worden ze getranscribeerd in niet-coderende eRNA's 19,20.

Niettemin zijn de doelgenen van elk distale regulerend element moeilijker te voorspellen. Vaker wel dan niet, interacties tussen distale regulerende elementen en hun doelen zijn celtype en stimulusspecifiek 21,22, beslaan honderden kilobases, overbruggen over andere genen in elke richting 23,24,25, en kunnen zelfs worden gelokaliseerd in intronische gebieden van hun doelgen of andere niet-interveniërende genen 26,27. Bovendien kunnen distale regulerende elementen ook meer dan één gen tegelijk aansturen, en vice versa28,29. Deze positionele complexiteit belemmert het lokaliseren van regulerende associaties tussen hen, en daarom blijven de meeste doelen van elk regulerend element in elk celtype onbekend.

In de afgelopen jaren is er een aanzienlijke hausse geweest in de ontwikkeling van chromosoomconformatie-capture (3C) -technieken voor het bestuderen van chromatine-interacties. De meest gebruikte van hen, Hi-C, maakt het mogelijk om een kaart te genereren van alle interacties tussen elk fragment van het genoom van een cel30. Om significante interacties op het niveau van restrictiefragmenten te detecteren, vertrouwt Hi-C echter op ultradiepe sequencing, waardoor het gebruik ervan wordt verboden om routinematig het regulerende landschap van individuele genen te bestuderen. Om deze economische beperking te overwinnen, zijn verschillende op verrijking gebaseerde 3C-technieken ontstaan, zoals ChIA-PET31, HiChIP 32 en zijn tegenhanger met lage input HiCuT33. Deze technieken zijn afhankelijk van het gebruik van antilichamen om te verrijken voor genoombrede interacties gemedieerd door een specifiek eiwit. Toch is het unieke kenmerk van deze 3C-technieken ook de vloek van hun toepassing; Gebruikers rekenen op de beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen voor het eiwit van belang en kunnen geen omstandigheden vergelijken waarin de binding van het eiwit dynamisch is.

Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) is een andere op verrijking gebaseerde 3C-techniek die deze beperkingen omzeilt34,35. Door gebruik te maken van een gebiotinyleerd RNA-sondeverrijkingssysteem, is PCHi-C in staat om genoombrede hogeresolutiebibliotheken van genomische regio's te genereren die interageren met 28.650 menselijke of 27.595 muis-geannoteerde genpromotors, ook bekend als het promotorinteractoom. Deze benadering stelt men in staat om significante langeafstandsinteracties te detecteren op het niveau van restrictiefragmenten van zowel actieve als inactieve promotors, en promotorinteractomen robuust te vergelijken tussen elke aandoening, onafhankelijk van de dynamiek van histonmodificaties of eiwitbinding. PCHi-C is de afgelopen jaren op grote schaal gebruikt om promotor-interactoomreorganisaties te identificeren tijdens celdifferentiatie 36,37, het werkingsmechanisme van transcriptiefactoren38,39 te identificeren en nieuwe potentiële genen en routes te ontdekken die in de ziekte zijn gedereguleerd door niet-coderende varianten 40,41,42,43,44,45,46,47,48, naast nieuwe driver niet-coderende mutaties49,50. Bovendien kan deze techniek, door alleen het vangsysteem aan te passen, worden aangepast aan de biologische vraag om elk interactoom te ondervragen (bijvoorbeeld het enhancer-interactoom 51 of het interactoom van een verzameling niet-coderende wijzigingen41,52).

PCHi-C vertrouwt echter op minimaal 20 miljoen cellen om de techniek uit te voeren, wat de studie van schaarse celpopulaties zoals die vaak worden gebruikt in ontwikkelingsbiologie en klinische toepassingen voorkomt. Om deze reden hebben we low input Capture Hi-C (liCHi-C) ontwikkeld, een nieuwe kosteneffectieve en aanpasbare methode op basis van het experimentele raamwerk van PCHi-C om promotorinteractomen met hoge resolutie te genereren met laagcellige input. Door het experiment uit te voeren met minimale buisveranderingen, stappen uit het oorspronkelijke PCHi-C-protocol te verwisselen of te elimineren, de reactievolumes drastisch te verminderen en reagensconcentraties te wijzigen, wordt de complexiteit van de bibliotheek gemaximaliseerd en is het mogelijk om bibliotheken van hoge kwaliteit te genereren met slechts 50.000 cellen53.

Low input Capture Hi-C (liCHi-C) is vergeleken met PCHi-C en gebruikt om promotor interactome herbedrading tijdens menselijke hematopoietische celdifferentiatie op te helderen, potentiële nieuwe ziekte-geassocieerde genen en routes te ontdekken die zijn gedereguleerd door niet-coderende veranderingen, en chromosomale afwijkingen te detecteren53. Het stapsgewijze protocol en de verschillende kwaliteitscontroles via de techniek worden hier gedetailleerd beschreven tot de laatste generatie van de bibliotheken en hun computationele analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om minimaal materiaalverlies te garanderen, (1) werken met DNA-buizen en -uiteinden met een lage binding (zie materiaaltabel), (2) reagentia op de buiswand plaatsen in plaats van de punt in het monster te brengen en, (3) indien mogelijk, het monster mengen door inversie in plaats van het monster op en neer te pipetteren, en daarna naar beneden draaien om het monster te herstellen.

1. Celfixatie

  1. Cellen die in suspensie groeien
    1. Oogst 50.000 tot een miljoen cellen en plaats ze in een DNA-laagbindende buis van 1,5 ml.
      OPMERKING: De celtypen die voor dit onderzoek zijn gebruikt, worden gedetailleerd beschreven in de sectie representatieve resultaten.
    2. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 600 x g (bij 4 °C) met behulp van een rotorcentrifuge met vaste hoek en verwijder het supernatant door pipetteren.
    3. Resuspendie van de cellen in 1 ml RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij kamertemperatuur.
    4. Voeg 143 μL methanolvrij 16% formaldehyde toe om een concentratie van 2% te bereiken en meng.
    5. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten terwijl u op kamertemperatuur draait om de cellen te fixeren.
      OPMERKING: Probeer zo nauwkeurig mogelijk te zijn met de incubatie van 10 minuten. Over- of onderfixatie van de cellen kan leiden tot een afname van de kwaliteit van de bibliotheek.
    6. Doof de reactie door 164 μL ijskoude 1 M glycine toe te voegen en meng. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten, roterend bij kamertemperatuur.
    7. Incubeer de cellen verder gedurende 15 minuten op ijs, mengen door inversie om de ~ 5 minuten.
    8. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 1.000 x g (bij 4 °C) met behulp van een rotorcentrifuge met vaste hoek en verwijder het supernatant.
    9. Was de cellen door de pellet opnieuw te suspenderen in 1 ml ijskoude 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
    10. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 1.000 x g (bij 4 °C) en verwijder het supernatant.
      OPMERKING: De gepelletiseerde cellen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof of droogijs en worden opgeslagen bij -80 °C.
  2. Aanhangende cellen
    1. Was de cellen in de kweekschaal met 1x PBS.
    2. Bereid voldoende RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS en methanolvrij 2% formaldehyde bij kamertemperatuur om de kweekschaal te bedekken.
    3. Voeg de aangevulde media toe aan de kweekschaal met de cellen en incubeer gedurende 10 minuten, schommelend op kamertemperatuur om de cellen te fixeren.
      OPMERKING: Probeer zo nauwkeurig mogelijk te zijn met de incubatie van 10 minuten. Over- of onderfixatie van de cellen kan leiden tot een afname van de kwaliteit van de bibliotheek.
    4. Doof de reactie door 1 M glycine toe te voegen tot 0,125 M en meng door te schommelen.
    5. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten, schommelend bij kamertemperatuur.
    6. Incubeer de cellen verder gedurende 15 minuten bij 4 °C, mengen door elke 3-4 minuten te schommelen.
    7. Verwijder de media en was de cellen met koude 1x PBS.
    8. Schraap de cellen en breng ze over in een 1,5 ml DNA laagbindende buis. Veeg de kweekschaal schoon met 0,5-1 ml koude 1x PBS.
    9. Centrifugeer de cellen gedurende 10 minuten bij 1.000 x g (bij 4 °C) met behulp van een rotorcentrifuge met vaste hoek en verwijder het supernatant. De gepelletiseerde cellen kunnen worden ingevroren in vloeibare stikstof of droogijs en worden opgeslagen bij -80 °C.

2. Lysis en spijsvertering

  1. Resuspendeer de cellen in 1 ml koude lysisbuffer (tabel 1) om het celmembraan te verstoren. De toevoeging van de buffer alleen zou voldoende moeten zijn om de cellen te resuspenderen, maar ze kunnen indien nodig verder worden geresuspendeerd door lichte vortexing.
  2. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten, meng door inversie elke ~ 5 min. Centrifugeer de kernen gedurende 10 minuten bij 1.000 x g (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendeer de kernen met 500 μL koude 1,25x restrictiebuffer 2 (zie Materiaaltabel).
  3. Centrifugeer de kernen gedurende 10 minuten bij 1.000 x g (bij 4 °C) en verwijder het supernatant. Resuspendie van de kernen in 179 μL van 1,25x restrictiebuffer 2.
  4. Voeg 5,5 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS; zie materiaaltabel) toe en meng. De cellen kunnen klonten vormen; Dit is normaal en moet zoveel mogelijk worden uitgesplitst door vortexing. Incubeer het monster gedurende 1 uur bij 37 °C in een thermoblok, met schudden bij 950 tpm.
  5. Doof de SDS door 37,5 μL 10% Triton X-100 toe te voegen en meng. Incubeer het monster gedurende 1 uur bij 37 °C in een thermoblok, met schudden bij 950 tpm.
  6. Verwerk de chromatine door 7,5 μL HindIII (100 U/μL; zie Tabel met materialen) toe te voegen en meng. Incubeer het monster een nacht bij 37 °C in een thermoblok, met schudden bij 950 tpm.
  7. Voeg de volgende ochtend een extra 2,5 μL HindIII (100 U/μL) toe en incubeer het monster verder gedurende 1 uur bij 37 °C in een thermoblok, met schudden bij 950 tpm om een goede chromatinevertering te garanderen.
    OPMERKING: Als onderdeel van de controles van de verteringsefficiëntie (zie stap 5.1), breng het equivalent van 20.000 tot 40.000 kernen over naar een andere buis om de onverteerde controle weer te geven. Breng na de spijsvertering hetzelfde aantal cellen opnieuw over naar een andere buis om de verteerde controle weer te geven. Het wordt aanbevolen om de vergistingsefficiëntie als een afzonderlijk experiment te testen als de beschikbaarheid van het uitgangsmateriaal schaars is.

3. Ligatie en decrosslinking

  1. Koel het monster op ijs. Bereid een mastermix en voeg de volgende reagentia toe om de overhangen van het restrictiefragment op te vullen en te biotinyleren: 3 μL 10x restrictiebuffer 2, 1 μL nucleasevrij water, 0,75 μL 10 mM dCTP, 0,75 μL 10 mM dTTP, 0,75 μL 10 mM dGTP, 18,75 μL 0,4 mM biotine-14-dATP en 5 μL 5 U/μL Klenow (zie materiaaltabel). Incubeer het monster gedurende 75 minuten bij 37 °C, meng het door inversie om de ~ 15 minuten.
  2. Koel het monster op ijs. Bereid een mastermix en voeg de volgende reagentia toe om de ingevulde DNA-uiteinden te ligateren: 50 μL 10x ligatiebuffer, 2,5 μL 20 mg/ml runderserumalbumine (BSA), 12,5 μL 1 U/μL T4 DNA-ligase en 173 μL nucleasevrij water (zie tabel met materialen).
  3. Incubeer het monster gedurende 4-6 uur bij 16 °C en meng het elke ~ 1 uur door inversie. Incubeer het monster verder gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Decrosslink de chromatine door 30 μL 10 mg/ml Proteinase K toe te voegen en te mengen. Incubeer het monster een nacht bij 65 °C.
  4. Voeg de volgende ochtend een extra 15 μL van 10 mg/ml Proteinase K toe en incubeer het monster verder gedurende 2 uur bij 65 °C om een goede chromatine-decrosslinking te garanderen.

4. DNA-zuivering

  1. Koel het monster af tot kamertemperatuur en breng het over in een geschikte buis voor fenol-chloroformzuivering.
  2. Voeg 1 volume (545 μL) fenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) toe om het DNA te zuiveren en meng door krachtig te schudden.
  3. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 12.000 x g bij kamertemperatuur en breng de bovenste waterige fase (545 μL) over naar een 2 ml DNA laagbindende buis.
  4. Voeg de volgende reagentia toe om het DNA neer te slaan: 1.362,5 μl 100% ethanol gekoeld tot -20 °C, 54,5 μl 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 2 μl 15 mg/ml glycogeen als coprecipitant.
  5. Incubeer gedurende 1 uur bij -80 °C of 's nachts bij -20 °C.
  6. Centrifugeer het monster gedurende 30 minuten bij 16.000-21.000 x g bij 4 °C en verwijder het supernatant. De DNA-pellet moet zichtbaar zijn.
  7. Was de pellet door 1 ml 70% ethanol, vortexing en centrifugeren toe te voegen gedurende 10 minuten bij 16.000-21.000 x g bij kamertemperatuur.
  8. Verwijder het supernatant en laat de pellet aan de lucht drogen. Resuspendeerde de DNA-pellet in 130 μL nucleasevrij water.
  9. Beoordeel de concentratie door middel van fluorometrische kwantificering (zie materiaaltabel). Bewaar het gezuiverde 3C-materiaal enkele maanden bij -20 °C voordat u doorgaat met het protocol.

5. Optionele kwaliteitscontroles

  1. Beoordeel de efficiëntie van de spijsvertering. Voer decrosslinking en fenol:chloroform DNA-zuivering uit, zoals eerder beschreven, naar de onverteerde en verteerde controles verkregen in stap 2.13. Resuspendeerde de DNA-pellet in 10 μL nucleasevrij water. Kwantificeer de concentratie en verdun het verkregen DNA, indien nodig, tot 4 ng/μL.
  2. Voer kwantitatieve PCR uit met 4 ng DNA van zowel de onverteerde als de verteerde controles, met primers die een open chromatinelocus overspannen met en zonder een HindIII-doel (zie tabel 2 voor primerontwerp). Bereken de efficiëntie van de spijsvertering volgens een eerder gepubliceerd rapport35.
    OPMERKING: De efficiëntie van ligatie wordt berekend als een percentage met behulp van de formule: vertering (%) = 100 -100/(2^[(Ct verteerd met HindIII - Ctdigested zonder HindIII) - (Ct onverteerd met HindIII - Ct onverteerd zonder HindIII)]) (zie tabel 3), waarbij rekening wordt gehouden met het verschil van de verschillende Cts verkregen voor elk primerpaar in de onverteerde en verteerde controles.
  3. Beoordeel de gevoeligheid van de interactiedetectie door conventionele polymerasekettingreactie (PCR) uit te voeren (0,2 mM dNTP, 0,4 μm beide F + R-primers, 0,1 en U / μL hot start polymerase), met primers die zowel lange- als korteafstandscel-invariante interacties omvatten (zie tabel 2 voor primerontwerp). Gebruik 50-100 ng 3C-materiaal (voor interacties op korte en lange afstand) en versterk met behulp van de volgende omstandigheden: 98 °C gedurende 15 minuten, gevolgd door 37 cycli van 98 °C gedurende 30 s, 60 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 minuut en eindigen met 72 °C gedurende 10 minuten. Houd bij 4 °C.
    OPMERKING: Als de hoeveelheid verkregen DNA minder dan 2 μg is, controleer dan alleen een lange- en een korteafstandsinteractie in plaats van het hele interactiepaneel.
  4. Voer het product uit op 1x tris-boraat-EDTA (TBE) met 1,6% agarose-gel en zoek naar de aanwezigheid van het overeenkomstige PCR-amplicon54.
    OPMERKING: Vanwege het onvoorspelbare "knippen en plakken" van het genoom, kunnen niet-specifieke banden verschijnen. Zolang de juiste bandmaat in acht wordt genomen, wordt deze als correct geteld.
  5. Beoordeel de efficiëntie van biotine fill-in en ligatie door een PCR-product met een korte afstand differentieel te verteren met HindIII, NheI (zie tabel met materialen), beide enzymen of geen (water), en het product te laten lopen op een 1x TBE 1,6% agarose-gel. Een correcte invulling en ligatie elimineren het vorige HindIII-doel en creëren een nieuw NheI-doel, dus het amplicon moet alleen in aanwezigheid van NheI worden gesneden.
    OPMERKING: Om materiaalverlies te minimaliseren, haalt u 2,5 μL van een PCR-product met een kort bereik op uit de interactiebesturingselementen en versterkt u het vijf keer opnieuw om de invul- en ligatiecontroles uit te voeren.

6. Sonicatie

  1. Breng de 130 μL van het monster over (vul aan met nucleasevrij water als er wat werd gebruikt voor de controles) naar een cuvette die geschikt is voor ultrasoonapparaat.
  2. Stel een waterbadsonicator in en soniceer met behulp van de volgende parameters (geoptimaliseerd voor het model en de cuvetten beschreven in de materiaaltabel): duty factor: 20%; piekinvalvermogen: 50; cycli per burst: 200; tijd: 65 s; en temperatuurbereik: 6-10 °C (8 °C optimaal).
  3. Breng het monster over in een nieuwe 1,5 ml DNA laagbindende buis.

7. Eindreparatie

  1. Bereid een mastermix voor en voeg de volgende reagentia toe om de ongelijke uiteinden van de DNA-fragmenten te herstellen die tijdens de ultrasoonapparaat zijn ontstaan: 18 μL 10x ligatiebuffer, 18 μL van elk 2,5 mM dNTP-mengsel, 6,5 μL 3 U / μL T4 DNA-polymerase, 6,5 μL van 10 U / μL T4 PNK en 1,3 μL van 5 U / μL Klenow (zie tabel met materialen).
  2. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 20 °C en vul het aan met Tris-low EDTA (TLE) buffer (zie tabel 1) tot 300 μL.

8. Biotine pull-down

  1. Breng 150 μL C1 streptavidin-kralen (zie materiaaltabel) per monster over in een buis van 1,5 ml, plaats ze op een buismagneet van 1,5 ml en wacht 2-3 minuten of totdat alle kralen aan de muur zijn vastgeplakt. Verwijder het supernatant en laat de kralen achter.
  2. Was de kralen met 400 μL 1x Tween buffer (TB; zie tabel 1). Om de kralen te wassen, voeg je de buffer toe en resuspensie je ze door zachte vortexing. Plaats de buis terug in de magneet en wacht 2-3 minuten of totdat alle kralen aan de muur zijn geplakt. Verwijder het supernatant en laat de kralen achter.
  3. Was de kralen met 300 μL 1x geen Tween buffer (NTB; zie tabel 1). Resuspendie van de kralen in 300 μL van 2x NTB (zie tabel 1).
    OPMERKING: De kralen kunnen een stoffige laag rond de buiswand vormen bij het wassen met buffers zonder reinigingsmiddel. Dit is normaal en heeft geen invloed op de uitkomst van het protocol.
  4. Combineer deze 300 μL kralen in 2x NTB met de 300 μL van het monster. Incubeer gedurende 15 minuten, draai bij kamertemperatuur om de informatieve DNA-fragmenten met biotine naar beneden te trekken. De bibliotheek zit nu vast aan de C1 streptavidin kralen.
  5. Was de kralen met 400 μL van 1x NTB. Was de kralen met 100 μL TLE-buffer en suspensie ze daarna in 35,7 μL TLE-buffer.

9. dATP-tailing, adapterligatie en PCR-versterking

  1. Maak een mastermix en voeg de volgende reagentia toe aan het monster om de uiteinden van de gerepareerde DNA-fragmenten te dATP-tailen: 5 μL van 10x restrictiebuffer 2, 2,3 μL van 10 mM dATP en 7 μL van 5 U/μL Klenow exo-. Incubeer het monster gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  2. Inactiveer Klenow exo- door het monster gedurende 10 minuten verder te incuberen bij 65 °C. Laat het monster afkoelen op ijs. Was de kralen met 300 μL of 1x TB. Was de kralen met 300 μL of 1x NTB.
  3. Was de kralen met 100 μL 1x ligatiebuffer en suspensie ze daarna in 50 μL 1x ligatiebuffer. Voeg 4 μL voorgegloeid adaptermengsel van 15 μM (zie tabel 2) en 1 μL 2.000 U/μL T4 DNA-ligase (zie materiaaltabel) toe aan het monster.
  4. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. Was de kralen met 400 μL of 1x TB. Was de kralen met 200 μL van 1x NTB. Was de kralen met 100 μl 1x restrictiebuffer 2.
  5. Was de kralen met 50 μL 1x restrictiebuffer 2 en suspensie ze daarna in 50 μL 1x restrictiebuffer 2.
  6. Meng de volgende reagentia om de PCR-reactie voor te bereiden om de bibliotheek te versterken: 50 μL kralen met de bibliotheek, 250 μL 2x PCR mastermix met enzym, 12 μL F + R-primers (elk 25 μM; zie tabel 2) en 188 μL nucleasevrij water.
  7. Voer de PCR uit onder de volgende omstandigheden (splits het PCR-reagensmengsel in reacties van 50 μL): 98 °C gedurende 40 s, gevolgd door X-cycli van 98 °C gedurende 10 s, 65 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 30 s en eindigen met 72 °C gedurende 10 minuten. Houd bij 4 °C.
    OPMERKING: Gebruik het volgende aantal cycli als uitgangspunt voor het optimaliseren van het protocol in diploïde cellen met als doel een output van 500-1.000 ng voordat de bibliotheek wordt vastgelegd: één miljoen cellen voor acht cycli; 250.000 cellen gedurende 10 cycli; 50.000 cellen voor 12 cycli.
  8. Bundel alle 50 μL-reacties van hetzelfde monster in een 1,5 ml DNA-buisje met lage binding, plaats deze op een buismagneet van 1,5 ml en wacht 2-3 minuten of totdat alle kralen aan de muur zijn geplakt.
  9. Breng het supernatant met de bibliotheek (500 μL) over in een nieuwe 1,5 ml DNA-laagbindingsbuis. Bijvullen met TLE-buffer tot 500 μL als een deel van het supernatant verloren is gegaan. De C1 streptavidin kralen zijn niet meer nodig.
  10. Voer een dubbelzijdige selectie55 uit met behulp van paramagnetische kralenzuivering (0,4-1 volume). Dit maakt de selectieve eliminatie van te grote (>1.000 bp) en te kleine fragmenten of PCR-primers (<200 bp) mogelijk, afhankelijk van de concentratie polyethyleenglycol en zout van de toegevoegde paramagnetische kralen.
  11. Voeg 200 μL (0,4 volumes) stockparels toe aan de bibliotheek en meng door vortexing. Incubeer gedurende 10 minuten, draai bij kamertemperatuur.
  12. Plaats op een magneet, wacht 2-3 minuten of totdat alle kralen aan de muur zijn geplakt en breng het supernatant met de bibliotheek (zonder de grotere fragmenten) over naar een nieuwe 1,5 ml DNA-laagbindingsbuis.
  13. Concentreer de kralen door 750 μL bouillonkralen te nemen, plaats ze in een buis van 1,5 ml op een magneet, wacht 2-3 minuten of totdat alle kralen aan de muur zijn vastgeplakt, verwijder het supernatant en resuspensie van de kralen door draaikolken in 300 μL nieuwe stamkralen.
  14. Voeg deze 300 μL geconcentreerde kralen toe aan het monster (1 volume) en meng door vortexing. Incubeer gedurende 10 minuten, draai bij kamertemperatuur. Plaats op een magneet, wacht 2-3 minuten of totdat alle kralen aan de muur zijn geplakt en verwijder het supernatant (met de kleinere fragmenten en PCR-primers).
  15. Was de kralen drie keer met 1 ml 70% ethanol. Voeg hiervoor de ethanol toe terwijl de buis met de kralen nog steeds op de magneet zit, probeer de kralen niet te storen en wacht 30-60 s. Verwijder daarna het supernatant zonder de kralen te verstoren.
  16. Laat de kralen aan de lucht drogen en resuspensie in 21 μL TLE-buffer door vortexing.
    OPMERKING: Overmatig drogen van de kralen kan de opbrengst verminderen bij het elueren van het DNA. Probeer ze onmiddellijk in de TLE-buffer te resuspenderen nadat ze niet langer "glanzend" zijn van de ethanol.
  17. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 37 °C in een thermoblok om de bibliotheek uit de kralen te elueren. Plaats de buis in een magneet en breng het supernatant met de bibliotheek over naar een nieuwe 1,5 ml DNA laagbindende buis.
  18. Kwantificeer de grootte en concentratie door geautomatiseerde elektroforese (zie materiaaltabel). Gezuiverd Hi-C-materiaal kan enkele maanden bij -20 °C worden bewaard voordat het protocol wordt uitgevoerd.

10. Bibliotheek vastleggen

  1. Werk met 500-1.000 ng van de bibliotheek. Concentreer de bibliotheek door het DNA te drogen met behulp van een vacuümconcentrator en het materiaal opnieuw te suspenderen in 3,4 μL nucleasevrij water.
  2. Voeg de volgende blokkers uit de doelverrijkingskit (zie materiaaltabel) toe aan het monster: 2,5 μl blokker 1, 2,5 μl blokker 2 en 0,6 μl aangepaste oligoblokker voor de adapters.
  3. Resuspendien grondig, breng de oplossing over in een PCR-strip van 0,2 ml en incubeer gedurende 5 minuten in een thermocycler bij 95 °C, gevolgd door 5 minuten bij 65 °C met een verwarmd deksel. Laat de buis incuberen bij 65 °C.
  4. Bereid de hybridisatieoplossing door de volgende reagentia uit de doelverrijkingskit (zie materiaaltabel) per monster (13 μl) te combineren. Op de bank bewaren bij kamertemperatuur: 6,63 μL Hyb 1, 0,27 μL Hyb 2, 2,65 μL Hyb 3 en 3,45 μL Hyb 4.
  5. Verdun 0,5 μl RNaseblok uit de doelverrijkingskit met 1,5 μl nucleasevrij water per monster. Ontdooi 5 μL van het gebiotinyleerde RNA per monster op ijs en voeg daar de 2 μL van het verdunde RNase-blok aan toe. Op de bank bewaren bij kamertemperatuur.
  6. Voeg de 13 μL van de hybridisatieoplossing toe aan de 7 μL van het gebiotinyleerde RNA met RNase en meng goed.
  7. Breng op de thermocycler bij 65 °C de hybridisatieoplossing met het gebiotinyleerde RNA (20 μL) over naar de geblokkeerde bibliotheek. Sluit het buisdeksel stevig en incubeer in de thermocycler gedurende een nacht bij 65 °C.
    OPMERKING: Om monsterverdamping te minimaliseren (wat kan leiden tot suboptimale RNA-DNA-hybridisatie) bij het uitvoeren van meerdere monsters tegelijkertijd, gebruikt u een meerkanaalspipet om het gebiotinyleerde RNA tegelijkertijd naar elke bibliotheek over te brengen.

11. Biotine pull-down en PCR versterking

  1. Breng 50 μL T1 streptavidin-kralen per monster over naar een 1,5 ml DNA-laagbindende buis, plaats ze op een buismagneet van 1,5 ml en wacht 2-3 minuten of totdat alle kralen aan de muur zijn vastgeplakt. Verwijder het supernatant en laat de kralen achter. Was de kralen drie keer met 200 μL van de bindbuffer uit de doelverrijkingskit.
  2. Suspendeerde de kralen in 200 μL bindingsbuffer. Breng het monster op de thermocycler bij 65 °C over naar de geresuspendeerde T1-streptavidinkorrels en incubeer gedurende 30 minuten, draaiend bij kamertemperatuur.
  3. Was de kralen met 200 μL wasbuffer 1 uit de doelverrijkingskit. Incubeer gedurende 15 minuten, roterend bij kamertemperatuur. Was de kralen driemaal met 200 μL wasbuffer 2 uit de tot 65 °C verwarmde doelverrijkingskit. Incubeer gedurende 10 minuten bij 65 °C in een thermoblok, schud bij 300 tpm tussen de wasbeurten door.
  4. Was de kralen met 200 μL 1x restrictiebuffer 2 en suspensie ze daarna in 30 μL 1x restrictiebuffer 2.
  5. Meng de volgende reagentia om de PCR-reactie voor te bereiden om de bibliotheek te versterken: 30 μL kralen met de bibliotheek, 150 μL 2x PCR mastermix met enzym, 7,2 μL F + R primers (25 μM elk; zie tabel 2), en 112,8 μL nucleasevrij water.
  6. Voer de PCR uit onder de volgende omstandigheden (splits het PCR-reagensmengsel in reacties van 50 μL): 98 °C gedurende 40 s, gevolgd door vier cycli van 98 °C gedurende 10 s, 65 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 30 s en eindigen met 72 °C gedurende 10 minuten. Houd bij 4 °C.
  7. Bundel alle 50 μL-reacties van hetzelfde monster in een 1,5 ml DNA-buisje met lage binding, plaats deze op een buismagneet van 1,5 ml en wacht 2-3 minuten of totdat alle kralen aan de muur zijn geplakt.
  8. Breng het supernatant met de bibliotheek (300 μL) over in een nieuwe 1,5 ml DNA laagbindende buis. Bijvullen met TLE-buffer tot 300 μL als een deel van het supernatant verloren is gegaan. De T1 streptavidin kralen zijn niet meer nodig.
  9. Voer een DNA-zuivering uit met behulp van paramagnetische kralen (0,9 volumes; zie materiaaltabel). Voeg 270 μL bouillonparels toe aan het monster en meng door vortexing.
  10. Incubeer gedurende 10 minuten, draai bij kamertemperatuur.
  11. Plaats op een magneet, wacht 2-3 minuten of totdat alle kralen aan de muur zijn geplakt en verwijder het supernatant.
  12. Was de kralen drie keer met 1 ml 70% ethanol. Voeg hiervoor de ethanol toe terwijl de buis met de kralen nog steeds op de magneet zit, probeer de kralen niet te storen en wacht 30-60 s. Verwijder daarna het supernatant zonder de kralen te verstoren.
  13. Laat de kralen aan de lucht drogen en resuspensie in 21 μL TLE-buffer door vortexing.
    OPMERKING: Overmatig drogen van de kralen kan de opbrengst verminderen bij het elueren van het DNA. Probeer ze onmiddellijk in de TLE-buffer te resuspenderen nadat ze niet langer "glanzend" zijn van de ethanol.
  14. Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 37 °C in een thermoblok om de bibliotheek uit de kralen te elueren.
  15. Plaats de buis in een magneet en breng het supernatant met de bibliotheek over naar een nieuwe 1,5 ml DNA laagbindende buis.
  16. Kwantificeer de grootte en concentratie door geautomatiseerde elektroforese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C biedt de mogelijkheid om hoogwaardige en resolutiebrede promotor-interactoombibliotheken te genereren met slechts 50.000 cellen53. Dit wordt bereikt door – naast de drastische vermindering van reactievolumes en het gebruik van DNA low-binding plasticware in het hele protocol – onnodige stappen uit het oorspronkelijke protocol te verwijderen, waarbij aanzienlijke materiaalverliezen optreden. Deze omvatten de fenolzuivering na decrosslinking, de biotineverwijdering en de daaropvolgende fenol...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

liCHi-C biedt de mogelijkheid om interactoombibliotheken met hoge resolutie te genereren met behulp van een vergelijkbaar experimenteel raamwerk van PCHi-C's, maar met een sterk verminderd celnummer. Dit wordt in hoge mate bereikt door het elimineren van onnodige stappen, zoals fenolzuivering en biotineverwijdering. In het klassieke in-nucleus ligatie Hi-C protocol57 en de daaropvolgende afgeleide techniek PCHi-C wordt biotine verwijderd uit niet-geligeerde restrictiefragmenten om te voorkomen dat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken de rest van de leden van het Javierre lab voor hun feedback op het manuscript. We danken het CERCA-programma, Generalitat de Catalunya en de Josep Carreras Foundation voor institutionele steun. Dit werk werd gefinancierd door FEDER/Spaans Ministerie van Wetenschap en Innovatie (RTI2018-094788-A-I00), de European Hematology Association (4823998) en de Spaanse Vereniging tegen Kanker (AECC) LABAE21981JAVI. BMJ wordt gefinancierd door het La Caixa Banking Foundation Junior Leader-project (LCF / BQ / PI19 / 11690001), LR wordt gefinancierd door een AGAUR FI-beurs (2019FI-B00017) en LT-D wordt gefinancierd door een FPI Fellowship (PRE2019-088005). We danken het biochemie en moleculaire biologie PhD-programma van de Universitat Autònoma de Barcelona voor zijn steun. Geen van de financiers was op enig moment betrokken bij het experimentele ontwerp of het schrijven van manuscripten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.4 mM Biotin-14-dATPInvitrogen19524-016
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9260G
1 M Tris pH 8.0InvitrogenAM9855G
10x NEBuffer 2New England BiolabsB7002SReferenced as restriction buffer 2 in the manuscript
10x PBSFisher ScientificBP3994
10x T4 DNA ligase reaction bufferNew England BiolabsB0202S
16% formaldehyde solution (w/v), methanol-freeThermo Scientific28908
20 mg/mL Bovine Serum AlbuminNew England BiolabsB9000S
5 M NaClInvitrogenAM9760G
5PRIME Phase Lock Gel Light tubesQiuantabio2302820For phenol-chloroform purification in section 4 (DNA purification). Phase Lock Gel tubes are a commercial type of tubes specially designed to maximize DNA recovery after phenol-chloroform purifications while avoiding carryover of contaminants in the organic phase by containing a resin of intermediate density which settles between the organic and aqueous phase and isolates them. PLG tubes should be spun at 12,000 x g for 30 s before use to ensure that the resin is well-placed at the bottom of the tube
Adapters and PCR primers for library amplificationIntegrated DNA Technologies-Bought as individual primers with PAGE purification for NGS
Cell scrappersNunc179693Or any other brand
Centrifuge (fixed-angle rotor for 1.5 mL tubes)Any brand
CHiCAGO R package1.14.0
CleanNGS beadsCleanNACNGS-0050
dATP, dCTP, dGTP, dTTPPromegaU120A, U121A, U122A, U123AOr any other brand
DNA LoBind tube, 1.5 mLEppendorf30108051
DNA LoBind tube, 2 mLEppendorf30108078
DNA polymerase I large (Klenow) fragment 5000 units/mLNew England BiolabsM0210L
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 beadsInvitrogen65002For biotin pull-down of the pre-captured library in section 8 (biotin pull-down)
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 beadsInvitrogen65602For biotin pull-down of the post-captured library in section 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
DynaMag-2Invitrogen12321DOr any other magnet suitable for 1.5 ml tubeL
Ethanol absoluteVWR20821.321
FBS, qualifiedGibco10270-106Or any other brand
GlycineFisher BioReagentsBP381-1
GlycoBlue CoprecipitantInvitrogenAM9515Used for DNA coprecipitation in section 4 (DNA purification)
HiCUP0.8.2
HindIII, 100 U/µLNew England BiolabsR0104T
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50ML
Klenow EXO- 5000 units/mLNew England BiolabsM0212L
Low-retention filter tips (10 µL, 20 µL, 200 µL and 1000 µL)ZeroTipPMT233010, PMT252020, PMT231200, PMT252000
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Micro TUBE AFA Fiber Pre-slit snap cap 6 x 16 mm vialsCovaris520045For sonication in section 6 (sonication)
NheI-HF, 100 U/µLNew England BiolabsR3131M
Nuclease-free molecular biology grade waterSigma-AldrichW4502
PCR primers for quality controlsIntegrated DNA Technologies-
PCR strips and capsAgilent Technologies410022, 401425
Phenol: Chloroform: Isoamyl Alcohol 25:24:1, Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTASigma-AldrichP3803
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF BufferNew England BiolabsM0531LFor amplification of the library in sections 9 (dATP-tailing, adapter ligation and PCR amplification)
and 11 (biotin pull-down and PCR amplification)
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free)Roche11873580001
Proteinase K, recombinant, PCR gradeRoche3115836001
Qubit 1x dsDNA High Sensitivity kitInvitrogenQ33230For DNA quantification after precipitation in section 4 (DNA purification)
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
rCutsmart bufferNew England BiolabsB6004S
RPMI Medium 1640 1x + GlutaMAXGibco61870-010Or any other brand
SDS - Solution 10% for molecular biologyPanReac AppliChemA0676
Sodium acetate pH 5.2Sigma-AldrichS7899-100ML
SureSelect custom 3-5.9 Mb libraryAgilent Technologies5190-4831Custom designed mouse or human capture system, used for the capture
SureSelect Target Enrichment Box 1Agilent Technologies5190-8645Used for the capture
SureSelect Target Enrichment Kit ILM PE Full AdapterAgilent Technologies931107Used for the capture
T4 DNA ligase 1 U/µLInvitrogen15224025For ligation in section 3 (ligation and decrosslink)
T4 DNA ligase 2000000/mLNew England BiolabsM0202T

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hatton, C. S., et al. α-thalassemia caused by a large (62 kb) deletion upstream of the human α globin gene cluster. Blood. 76 (1), 221-227 (1990).
  2. Toikkanen, S., Helin, H., Isola, J., Joensuu, H. Prognostic significance of HER-2 oncoprotein expression in breast cancer: A 30-year follow-up. Journal of Clinical Oncology. 10 (7), 1044-1048 (1992).
  3. Church, C., et al. Overexpression of Fto leads to increased food intake and results in obesity. Nature Genetics. 42 (12), 1086-1092 (2010).
  4. Bhatia, S., et al. Disruption of autoregulatory feedback by a mutation in a remote, ultraconserved PAX6 enhancer causes aniridia. American Journal of Human Genetics. 93 (6), 1126-1134 (2013).
  5. Herranz, D., et al. A NOTCH1-driven MYC enhancer promotes T cell development, transformation and acute lymphoblastic leukemia. Nature Medicine. 20 (10), 1130-1137 (2014).
  6. Carter, D., Chakalova, L., Osborne, C. S., Dai, Y. F., Fraser, P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. Nature Genetics. 32 (4), 623-626 (2002).
  7. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  8. Schoenfelder, S., Fraser, P. Long-range enhancer-promoter contacts in gene expression control. Nature Reviews Genetics. 20 (8), 437-455 (2019).
  9. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  10. Zentner, G. E., Tesar, P. J., Scacheri, P. C. Epigenetic signatures distinguish multiple classes of enhancers with distinct cellular functions. Genome Research. 21 (8), 1273-1283 (2011).
  11. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  12. McPherson, C. E., Shim, E. Y., Friedman, D. S., Zaret, K. S. An active tissue-specific enhancer and bound transcription factors existing in a precisely positioned nucleosomal array. Cell. 75 (2), 387-398 (1993).
  13. He, A., Kong, S. W., Ma, Q., Pu, W. T. Co-occupancy by multiple cardiac transcription factors identifies transcriptional enhancers active in heart. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5632-5637 (2011).
  14. Dogan, N., et al. Occupancy by key transcription factors is a more accurate predictor of enhancer activity than histone modifications or chromatin accessibility. Epigenetics and Chromatin. 8, 16(2015).
  15. Whyte, W. A., et al. transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  16. Hnisz, D., et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 155 (4), 934-947 (2013).
  17. He, H. H., et al. Nucleosome dynamics define transcriptional enhancers. Nature Genetics. 42 (4), 343-347 (2010).
  18. Song, L., et al. Open chromatin defined by DNaseI and FAIRE identifies regulatory elements that shape cell-type identity. Genome Research. 21 (10), 1757-1767 (2011).
  19. De Santa, F., et al. A large fraction of extragenic RNA Pol II transcription sites overlap enhancers. PLoS Biology. 8 (5), e1000384(2010).
  20. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465 (7295), 182-187 (2010).
  21. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  22. Wu, H., et al. Tissue-specific RNA expression marks distant-acting developmental enhancers. PLoS Genetics. 10 (9), e1004610(2014).
  23. Banerji, J., Rusconi, S., Schaffner, W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell. 27 (2), 299-308 (1981).
  24. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Developmental Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  25. Shi, J., et al. Role of SWI/SNF in acute leukemia maintenance and enhancer-mediated Myc regulation. Genes and Development. 27 (24), 2648-2662 (2013).
  26. Lettice, L. A., et al. A long-range Shh enhancer regulates expression in the developing limb and fin and is associated with preaxial polydactyly. Human Molecular Genetics. 12 (14), 1725-1735 (2003).
  27. Tuvikene, J., et al. Intronic enhancer region governs transcript-specific Bdnf expression in rodent neurons. eLife. 10, e65161(2021).
  28. Tasic, B., et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 10 (1), 21-33 (2002).
  29. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Levine, M. Multiple enhancers ensure precision of gap gene-expression patterns in the Drosophila embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (33), 13570-13575 (2011).
  30. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
  31. Fullwood, M. J., et al. An oestrogen-receptor-α-bound human chromatin interactome. Nature. 462 (7269), 58-64 (2009).
  32. Mumbach, M. R., et al. HiChIP: Efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).
  33. Sati, S., et al. HiCuT: An efficient and low input method to identify protein-directed chromatin interactions. PLoS Genetics. 18 (3), e1010121(2022).
  34. Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
  35. Schoenfelder, S., Javierre, B. M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  36. Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
  37. Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
  38. Schoenfelder, S., et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome. Nature Genetics. 47 (10), 1179-1186 (2015).
  39. Zhang, N., et al. Muscle progenitor specification and myogenic differentiation are associated with changes in chromatin topology. Nature Communications. 11 (1), 6222(2020).
  40. Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
  41. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178(2015).
  42. Martin, P., et al. Identifying causal genes at the multiple sclerosis associated region 6q23 using capture Hi-C. PLoS One. 11 (11), e0166923(2016).
  43. Burren, O. S., et al. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes. Genome Biology. 18 (1), 165(2017).
  44. Choy, M. K., et al. Promoter interactome of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes connects GWAS regions to cardiac gene networks. Nature Communications. 9 (1), 2526(2018).
  45. Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
  46. Law, P. J., et al. Association analyses identify 31 new risk loci for colorectal cancer susceptibility. Nature Communications. 10 (1), 2154(2019).
  47. Speedy, H. E., et al. Insight into genetic predisposition to chronic lymphocytic leukemia from integrative epigenomics. Nature Communications. 10 (1), 3615(2019).
  48. Li, T., et al. Epigenomics and transcriptomics of systemic sclerosis CD4+ T cells reveal long-range dysregulation of key inflammatory pathways mediated by disease-associated susceptibility loci. Genome Medicine. 12 (1), 81(2020).
  49. Orlando, G., et al. Promoter capture Hi-C-based identification of recurrent noncoding mutations in colorectal cancer. Nature Genetics. 50 (10), 1375-1380 (2018).
  50. Cornish, A. J., et al. Identification of recurrent noncoding mutations in B-cell lymphoma using capture Hi-C. Blood Advances. 3 (1), 21-32 (2019).
  51. Madsen, J. G. S., et al. Highly interconnected enhancer communities control lineage-determining genes in human mesenchymal stem cells. Nature Genetics. 52 (11), 1227-1238 (2020).
  52. Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
  53. Tomás-Daza, L., et al. Low input capture Hi-C (liCHi-C) identifies promoter-enhancer interactions at high-resolution. Nature Communications. 14 (1), 268(2023).
  54. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. 62 (62), e3923(2012).
  55. Bronner, I. F., Quail, M. A. Best practices for Illumina library preparation. Current Protocols in Human Genetics. 102 (1), 86(2019).
  56. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000Research. 4, 1310(2015).
  57. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16 (1), 175(2015).
  58. Cairns, J., et al. CHiCAGO: Robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biology. 17 (1), 127(2016).
  59. Freire-Pritchett, P., et al. Detecting chromosomal interactions in Capture Hi-C data with CHiCAGO and companion tools. Nature Protocols. 16 (9), 4144-4176 (2021).
  60. Kihm, A. J., et al. An abundant erythroid protein that stabilizes free α-haemoglobin. Nature. 417 (6890), 758-763 (2002).
  61. Feng, L., et al. Molecular mechanism of AHSP-mediated stabilization of α-hemoglobin. Cell. 119 (5), 629-640 (2004).
  62. Favero, M. E., Costa, F. F. Alpha-hemoglobin-stabilizing protein: An erythroid molecular chaperone. Biochemistry Research International. 2011, 373859(2011).
  63. Li, D., et al. WashU Epigenome Browser update 2022. Nucleic Acids Research. 50 (W1), W774-W781 (2022).
  64. Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
  65. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502 (7469), 59-64 (2013).
  66. Tan, L., Xing, D., Chang, C. H., Li, H., Xie, X. S. 3D genome structures of single diploid human cells. Science. 361 (6405), 924(2018).
  67. Ramani, V., et al. Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods. 14 (3), 263-266 (2017).
  68. Díaz, N., et al. Chromatin conformation analysis of primary patient tissue using a low input Hi-C method. Nature Communications. 9 (1), 4938(2018).
  69. Lu, L., Jin, F. Easy Hi-C: A low-input method for capturing genome organization. Methods in Molecular Biology. 2599, 113-125 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Promoter Capture Hi CLow Input Capture Hi Cspatiotemporele genoomarchitectuurchromatinorganisatiegenregulatie3D genoomorganisatiedistale regulatoire elementenchromatininteractieDNA bibliotheekbereiding

Gerelateerde artikelen