Method Article

Evaluatie van de impact van een nieuw koelcelprocessorsysteem op de faciliteit voor het isoleren van eilandjescellen

DOI:

10.3791/65321

⸱

August 11th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Qatar Metabolic Institute, Hamad Medical Corporation, 2Univ-Lille, Inserm, CHU Lille, Institute Pasteur Lille, U1190 - EGID F-59000 Lille, 3Department of Nephrology, Leiden University Medical Center (LUMC)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol hier beschrijft een aangepast koelcel-processorsysteem dat compatibel is met een schone ruimte met goede fabricagepraktijken (GMP) om de cellevensvatbaarheid na verwerking te verbeteren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standaard apparatuur voor celtherapie, inclusief de gouden standaard celprocessor om menselijke eilandjes te zuiveren voor klinische transplantatie, wordt zelden gekoeld, waardoor cellen mogelijk worden blootgesteld aan verhoogde temperaturen tijdens de centrifugeerstap. Aangepaste koelsystemen hebben een directe invloed op de levensvatbaarheid en functie van menselijke eilandjes. Het huidige onderzoek werd ontworpen om de effectiviteit van een nieuw ontwikkeld, gemakkelijk verkrijgbaar gekoeld celprocessorsysteem te testen dat minimale aanpassingen vereist, en om de invloed ervan op de levensvatbaarheid van menselijke cellen en het GMP-schoonmaakruimte-omgeving te evalueren. Het koelsysteem, een mechanisch gekoelde warmtewisselaar ingesteld op -30 °C, werd gebruikt om gekoelde medische kwaliteit droge lucht aan de celprocessorkom te leveren via een gat in de centrifugedeklaag. Met de beperkte beschikbaarheid van pancreasdonoren in Qatar, werd systeemvalidatie uitgevoerd met continue dichtheidsgradiëntzuivering van gepoolde menselijke beenmerg buffy coat. Steriliteit, turbulentie en deeltjestelling werden gemeten in klasse C en klasse B schone ruimte omgevingen. Er ontwikkelde zich geen turbulentie rond de gekoelde celprocessor en er werden geen overtollige 0,5 µm en 5 µm luchtpartikels gegenereerd volgens de GMP-normen van de schone ruimte. Aan het begin en het einde van de verzamelstappen steeg de temperatuur respectievelijk tot 21,50 °C ± 0,34 °C en 21,93 °C ± 0,20 °C in de niet-gekoelde celprocessor en tot slechts 10,9 °C ± 0,17 °C en 11,16 °C ± 0,35 °C in de gekoelde celprocessor (p <0,05). De gekoelde celprocessor leidde tot zowel verbeterde herstel (98%) van de mononucleaire celfractie als levensvatbaarheid (100% ± 2%) na verwerking. Het nieuwe koelsysteem vermindert effectief de warmte geproduceerd door de celprocessor zonder deeltjesimpact op de GMP-schoonmaakruimte omgeving. De hier beschreven gekoelde celprocessor is een goedkope ($16.000 zonder belastingen, douane en transport) en minimaal invasieve methode om robuuste koeling te bieden. Momenteel wordt deze technologie in de GMP-celtherapiefaciliteit toegepast op menselijke eilandjescelisolatie en -transplantatie voor het klinische programma.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantatie van eilandjes voor ernstige type 1 diabetes kan de endogene insulinesecretie herstellen en is in een aantal landen de standaardzorg geworden1. Eilandje-isolatie is een meerfasenprocedure die warme enzymatische en mechanische vertering van de pancreas omvat, gevolgd door gekoelde fasen voor herstel van verteerd weefsel en eilandje-zuivering met continue of discontinue dichtheidsgradiënten op een celprocessor. Snel afkoelen vertraagt de enzymatische verteringsfase en beschermt eilandjes tegen spijsverteringsenzymen die worden vrijgegeven door verontreinigende acinar cellen. De celprocessor was oorspronkelijk ontworpen om cellulaire bloedcomponenten bij kamertemperatuur te scheiden2. In 1989 werd het hergebruikt om humane eilandjes van Langerhans te zuiveren3. Al drie decennia lang worden humane eilandjes gezuiverd voor klinische onderzoeken en, meer recent, voor de standaardzorg, hetzij in een celprocessor met discontinue gradiënten4 of continue dichtheidsgradiënten1 gemaakt met een gradiëntmaker1 of gelijkwaardige computergestuurde mixer5,6,7. Andere groepen hebben melding gemaakt van eilandje-zuivering van grote zoogdieren en mensen met behulp van grote cilindrische plastic flessen8,7,9, wat de effectiviteit van zuivering en eilandjeskwaliteit aanzienlijk heeft verbeterd.

Inderdaad, als we kijken naar de gouden standaard voor het zuiveren van humane eilandjes voor klinische transplantatie10,11, was de geproduceerde celprocessor zonder koeling. Als direct gevolg van het gebrek aan koeling, werden eilandjes blootgesteld aan toenemende temperaturen tijdens de zuiveringsstap. Tijdens centrifugatie treedt een ongecontroleerde temperatuurstijging op als gevolg van de mechanische wrijving van de rotor12,13. Celprocessors werden aangepast met een koelsysteem in eilandje-isolatiecentra dat statistisch glucose-geïnduceerde insulinesecretie en celviabiliteit verhoogde, wat het voordeel bevestigt van het houden van pancreaseilandjes op lage temperaturen tijdens de zuiveringsprocedure14,15.

Opgemerkt moet worden dat eind jaren tachtig 10 gekoelde prototypes werden gebouwd om eilandjesschade tijdens dichtheidsgradiëntzuivering te verminderen, maar deze kregen geen verdere aandacht. De prototypes van de celprocessor waren gebaseerd op spindel- en komkoeling met gekoeld polyethyleenglycol. In het bijzonder kunnen eilandje-zuiveringsoplossingen, inclusief orgaanbewaringsoplossingen en polysacharide dichtheidsgradiënten, schadelijk zijn voor eilandjesviabiliteit wanneer ze worden gebruikt bij of boven kamertemperatuur16,17,18. Een vergelijking van verschillende koelstrategieën van de celprocessor voor eilandjescelzuivering versus de originele niet-gekoelde celprocessor werd geëvalueerd om de ongecontroleerde temperatuurstijging die optreedt als gevolg van de wrijving van de rotor te bestrijden. Er zijn verschillende pogingen gedaan om de celprocessor af te koelen tijdens humane eilandje-zuivering. De celprocessor kan tijdelijk of permanent worden gehuisvest in een speciaal ontworpen koude ruimte om een temperatuur van 0-8 °C19 te handhaven tijdens de gradiëntcentrifugering die momenteel wordt gebruikt bij de eilandje-isolatiecentra aan de University of Illinois Chicago19, University of Miami14, University of Oxford faciliteiten15, en de University of San Francisco (de aangepaste koeleenheid omvat de celprocessor). Een andere aanpassing omvat kernkoeling van de celprocessorspindel met een koelsysteem met elektronisch gecontroleerde vloeibare stikstofkoeling in Genève, Zweden en de Tsjechische Republiek15,19. Een andere alternatief midden jaren 2000 was de kernkoeling van de celprocessor met een airconditioning-eenheid12 of door vloeistofkoeling van de as bij de University of Lille.

Koelmodificaties van de celprocessor zijn niet direct beschikbaar en brengen risico's met zich mee (luchtvochtigheid, ophoping van condensatie) in GMP-schoonruimomgevingen, inclusief verlies van garantie en weigering van de constructeur om de machine te onderhouden. Bijgevolg gebruiken sommige eilandjecentra, waaronder Milaan, Italië, Oslo, Noorwegen en Edinburgh, Schotland, geen koelsysteem voor celprocessors tijdens het eilandje-zuiveringsproces15.

Het huidige onderzoek is ontworpen om de effectiviteit van een nieuw ontwikkelde, gemakkelijk beschikbare koeler in combinatie met een minimaal aangepaste celprocessorsysteem te testen. Kort gezegd, de hier beschreven luchtgebaseerde koeler is een mechanisch gekoelde warmtewisselaar die de temperatuur van 1 standaard kubieke voet per minuut (SCFM) droog gas regelt tussen -40 °C tot -100 °C. Dit koelsysteem vereist een droge medische luchtvoorziening. De lucht stroomt door de lijn en warmtewisselaar en uit door de (7,9 mm) spuitmond. Een verwarming in de spuitmond levert warmte om de temperatuur van de luchtstroom te regelen. Een reserve deksel van massief plastic voor de centrifuge werd gekocht en er werden minimale aanpassingen gemaakt. Er werd een gat van 13,3 mm diameter in het deksel geboord en gekoelde lucht werd van de koelerspuitmond naar de celprocessor geleid via het gat in het centrifugedeksel. De gekoelde medische lucht werd met constante temperatuurregeling van de vloeistoffen of dichtheidsgradiënten in de centrifugeerkom van de celprocessor geïnjecteerd.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol gebruikte weggegooid volbloed dat niet geschikt was voor gebruik volgens de richtlijnen van de instelling. Goedkeuring door de IRB en geïnformeerde toestemming zijn niet van toepassing.

1. Instelling van de gekoelde celprocessor

OPMERKING: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een schone ruimte omgeving, en het personeel moet de procedures voor schone ruimtekleding respecteren.

  1. Aankoop van apparatuur
    1. Koop een reserve plexiglas deksel. Koop het koelsysteem, koeler met mechanisch gekoelde gasstroom temperatuurregelaar, luchtdroger, druk- en stroomregelaar, en de garantie (optioneel). Zie Tabel van materialen voor verwijzingen.
      OPMERKING: De totale kosten zijn $16.133 zonder verzend- of douanekosten.
    2. Bestel medische droge lucht, een gecomprimeerd medisch gas dat voldoet aan de standaard kwaliteit (Europese farmacopee referentie 1238) bij de plaatselijke leverancier van medische gassen. Koop 2 cilinders van 6,8 m3 (47 L: 23 cm x 153 cm; diameter x lengte).
  2. Installatie van de apparatuur (Figuur 1 en Figuur 2)
    1. Breng de apparatuur binnen in de GMP schone ruimte (ontsmet voor het betreden van de schone ruimte volgens GMP procedures).
    2. Voor de gecomprimeerde medische lucht, installeer een gasleiding in plaats van de gascilinder direct in de schone ruimte te plaatsen.
  3. Wijziging van de celprocessor voor koeling
    1. Verwijder eerst het plexiglas deksel. Bewaar het originele plexiglas deksel voor het geval er een probleem is met de garantie. Boor een gat in het reserve deksel van de celprocessor met een diameter om de buitendiameter van de koeldevice noppenkop te passen en te voorkomen dat het centrifugede klepje barst (13,3 mm aanbevolen).
    2. Bevestig beugels samen met een cirkelvormig stuk schuim. Dit wordt gedaan om breken en/of krassen van het deksel te voorkomen, om de koeler noppenkop boven de celprocessor op zijn plaats te houden, om het deksel te beschermen tegen overmatig buigen door de hoge druk van geïnjecteerde lucht, om het gewicht van de noppenkop te ondersteunen, en tenslotte om de maximale veiligheid voor de operator te garanderen om vrij en veilig toegang te hebben tot alle vereiste celprocessorfuncties tijdens de experimentele procedure.
    3. Verbind het koelsysteem met de celprocessor door de koelnoppenkop aan te sluiten op het gat in het plexiglas. Bevestig het met beugels en schuim kussens.
    4. Plaats de koelbehuizing tot 8 voet (2,44 m) van de noppenkop. Plaats de temperatuurregelaar in een aparte kast en plaats deze binnen 6 voet (1,83 m) van de koelbehuizing.
    5. Stel de koeler ingesteld op -40 °C voor het koelen van de luchtstroom op de koeler. De uitlaat luchttemperatuur wordt continu aangegeven op de digitale indicator met een resolutie van 0,1 °C. Stel de uitlaattemperatuur digitaal in op 0,1 °C met de temperatuurregelaar.
    6. Regel de druk en de stroomsnelheid van de luchttoevoer op de druk- en stroomsnelheidsmodule (Figuur 2) voordat deze naar de koeler wordt gevoerd. Stel ze in op 55 psi en 4 SCFM stroomsnelheden, respectievelijk, om de optimale omstandigheden op een luchtstroom te bereiken die gekoeld is op -30 °C ± 2 °C.
    7. Controleer of de medische gastoevoer gereguleerd is op een uitdrukking van 5 bar en minstens 90 min kan duren, omdat dit vereist is voor de gecomprimeerde lucht om -30 °C te bereiken.
      ​OPMERKING: Medische droge lucht is gecomprimeerd medisch gas, en volledig geperste droge lucht voldoet aan de standaardkwaliteit.
    8. Geef 5 bar af vanuit een koeler noppenkop verbonden met de celprocessor deksel door een gat geboord in het centrifugede klepje. Injecteer de gekoelde medische lucht in de centrifugatiekom van de celprocessor (Figuur 2). Selecteer de positie van de luchtinjectie zodanig dat de gekoelde lucht loodrecht op de aluminium rand van de centrifuge rotor is gericht.
    9. Wanneer de celprocessor wordt voorbereid, zorg ervoor dat de rotor op kamertemperatuur is (18 °C). Stel de automatische thermo-regelaar van het koelsysteem in op -30 °C en richt koude luchtinjecties direct op de rotor.
      OPMERKING: Er werden verschillende proefvoorwaarden getest om een optimale temperatuurgradiënt van +4 °C te bereiken, wat noodzakelijk is om de thermo-weerstand van het celscheidingssysteem van de celprocessor en het opwarmen van de rotor tijdens centrifugatie te overwinnen. De geprogrammeerde thermo-regelaar zal de optimale doeltemperatuur binnenin de celverwerkingsmachine tijdens de procedure handhaven, met name tijdens de centrifugatie, bij een schone ruimte temperatuur van +18 °C.
      1. Stel de celprocessor in met de eerste voorkoelfasen om de processor af te koelen (zonder de celprocessor kit) op +3 °C gedurende 30 tot 45 min, en de tweede voorkoelfasen van het uitvoeren van de celprocessor moet met de kit voorgekoeld op +4 °C bij 134 x g, gedurende 5 min zijn.

2. Aantal deeltjes in de lucht

  1. Beoordeel de naleving van het koelapparaat met de GMP schone ruimte omgeving volgens ISO 14644-1 standaard om de impact van hitteapparaten tijdens de werkingsfase te evalueren.
  2. Gebruik deeltjestelling monitoring om bewijs te leveren dat het vereiste niveau van reinheid is bereikt op kritieke controlepunten in rust en in werking.
    1. Het minimale aantal monsterlocaties hangt af van het gemeten gebied. Bereken dit met behulp van de vergelijking

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De impact van de gekoelde celprocessor op de GMP-schoonkamer werd als eerste gekwantificeerd. Gestandaardiseerde methoden gebruikten een deeltjesteller om de besmetting door luchtgedragen deeltjes te meten in een GMP-klasse C en klasse B schone kameromgeving op cruciale punten in de nabijheid van de celprocessor en het geperste luchtkoelsysteem. De resultaten toonden aan dat er geen turbulentie ontstond rond de apparatuur. De opgenomen gegevens lieten zien dat er geen teveel aan 0,5 µm en 5 µm luchtgedragen deeltjes was ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eilandjesisolatiefaciliteiten over de hele wereld hebben decennialang de zuivering van menselijke eilandjes in een herbestemde celprocessor geadopteerd. Hoewel sommige eilandjeproductiefaciliteiten eilandjes nog steeds in een niet-gekoelde celprocessor verwerken, gebruikt de meeste centra een gekoelde versie van de celprocessor10,11,15. Centra plaatsen de celprocessor ofwel in een koude ruimte die het grote nadeel heeft van bloo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen het Europese genomische instituut voor diabetes bedanken (ANR-10- LABEX-0046 naar FP) en Qatar metabool instituut - Hamad medische corporatie, Qatar. De auteurs bedanken ook het Medisch Onderzoekscentrum bij Hamad Medical Corporation voor  ondersteuning van artikelverwerkingskosten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Air particles counterLasair III 
AirJet XR40 SP ScientificFTS system XR40
Biosafety CabinetThermo ScientificEQ-1301
Circulating Cooling ChillerJulaboCF30
COBE 2991 Terumo BCT
Conical Cooling TrayBiorepCCT-01
Double jacketed gradient maker customized in house
KJT-Thermocouple ThermometerHanna InstrumentsHI93551NVoor het meten van de temperatuur van vloeistoffen
Magnetic stirrer Thermo Scientific88880014
Peristaltic pump MasterFlexMK-77921-79
Thermometer Extech InstrumentsRMS 430Voor COBE-temperatuur
Waterless Bead BathCole-Parmer10122-00
Materials and reagents
BD stem cell enumeration kitBD Biosciences 344563
COBE 2911 tubing kitTerumo BCT90819
Conical Tubes 250mlCorning430776
Gradient density 1.1Biochrom L6155
Graduated disposable bottlesThermo fisher382019-1000
Human albumin 20% Kedrion Biopharma 8091600
M199 washing solution Corning 99-784-CM 
Masterflex tubesMasterflex96400-6
Medical Dry AirLinde HealthcareMedi On 22
Pencillin-streptomycin Gibco 15140122
ThermoprobeBiorepTC-02Thermosensor
Trypan blue Sigma Aldrich15250061
University of Wisconsin Belzer (UW) Bridge of Life RM/N 4055Conservatiemiddel

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. The New England Journal of Medicine. 343 (4), 230-238 (2000).
  2. Vesilind, G. W., Simpson, M. B., Colman, R. E., Kao, K. J. Evaluation of a centrifugal blood cell processor for washing platelet concentrates. Transfusion. 28 (1), 46-51 (1988).
  3. Lake, S. P., et al. Large-scale purification of human islets utilizing discontinuous albumin gradient on IBM 2991 cell separator. Diabetes. 38, 143-145 (1989).
  4. Ricordi, C., et al. Human islet isolation and allotransplantation in 22 consecutive cases. Transplantation. 53 (2), 407-414 (1992).
  5. Friberg, A. S., Stahle, M., Brandhorst, H., Korsgren, O., Brandhorst, D. Human islet separation utilizing a closed automated purification system. Cell transplantation. 17 (12), 1305-1313 (2008).
  6. Bampton, T. J., et al. Australian experience with total pancreatectomy with islet autotransplantation to treat chronic pancreatitis. ANZ Journal of Surgery. 91 (12), 2663-2668 (2021).
  7. Doppenberg, J. B., Engelse, M., de Koning, E. J. P. PRISM: A Novel Human Islet Isolation Technique. Transplantation. 106 (6), 1271-1278 (2021).
  8. Shimoda, M., et al. Islet purification method using large bottles effectively achieves high islet yield from pig pancreas. Cell Transplantation. 21 (2-3), 501-508 (2012).
  9. Noguchi, H. Pancreatic Islet Purification from Large Mammals and Humans Using a COBE 2991 Cell Processor versus Large Plastic Bottles. Journal of Clinical Medicine. 10 (1), 10(2021).
  10. Shapiro, A. M., et al. International trial of the Edmonton protocol for islet transplantation. The New England Journal of Medicine. 355 (13), 1318-1330 (2006).
  11. Ricordi, C. National Institutes of Health-Sponsored Clinical Islet Transplantation Consortium Phase 3 Trial: Manufacture of a Complex Cellular Product at Eight Processing Facilities. Diabetes. 65 (11), 3418-3428 (2016).
  12. Swift, S., Kin, T., Mirbolooki, M., Wilson, R., Lakey, J. R. T. Comparison of cooling systems during islet purification. Cell Transplantation. 15 (2), 175-180 (2006).
  13. Rilo, H. L. R., et al. Comparison of islet number and viability obtained during purification on Euro-Collins-Ficoll gradients processed on a refrigerated or nonrefrigerated COBE 2991 cell separator. Transplantation Proceedings. 26 (6), 3430(1994).
  14. Chadwick, D. R., et al. Pancreatic islet purification using bovine serum albumin: The importance of density gradient temperature and osmolality. Cell Transplantation. 2 (4), 355(1993).
  15. Nano, R., et al. Heterogeneity of human pancreatic islet isolation around Europe: results of a survey study. Transplantation. 104 (1), 190-196 (2020).
  16. Chadwick, D. R., et al. Storage of pancreatic digest before islet purification. Transplantation. 58 (1), 99-104 (1994).
  17. Amrani, M., et al. Detrimental effects of temperature on the efficacy of the University of Wisconsin solution when used for cardioplegia at moderate hypothermia. Comparison with the St. Thomas Hospital solution at 4 degrees C and 20 degrees C. Circulation. 86, 280-288 (1992).
  18. Fremes, S. E., Li, R. K., Weisel, R. D., Mickle, D. A., Tumiati, L. C. Prolonged hypothermic cardiac storage with University of Wisconsin solution. An assessment with human cell cultures. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 102 (5), 666-672 (1991).
  19. Adewola, A., et al. Comparing cooling systems for the COBE 2991 cell separator used in the purification of human pancreatic islets of Langerhans. Cryo Letters. 31 (4), 310-317 (2010).
  20. Keymeulen, B., et al. Implantation of standardized beta-cell grafts in a liver segment of IDDM patients: graft and recipients characteristics in two cases of insulin-independence under maintenance immunosuppression for prior kidney graft. Diabetologia. 41 (4), 452-459 (1998).
  21. de Kort, H., de Koning, E. J., Rabelink, T. J., Bruijn, J. A., Bajema, I. M. Islet transplantation in type 1 diabetes. BMJ. 342, (2011).
  22. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84 (9), 1200-1203 (2007).
  23. Lemarie, C., et al. A new single-platform method for the enumeration of CD34+ cells. Cytotherapy. 11 (6), 804-806 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Islet Cell IsolationCooled Cell ProcessorDensity Gradient PurificationHuman Islet ViabilityCell Therapy EquipmentCleanroom GMP StandardsMononuclear Cell FractionCentrifugation StepAirborne Particle AssessmentCell Viability Measurement

Related Articles