Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65329

⸱

9 februari 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Protein Chemistry and Biochemistry, Department of Cell Biology, University of Brasilia, 2Institute of Physics, University of Brasilia

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol bevat een reeks neutrofiele functionele assays die kunnen worden gebruikt als screeningsmethode om functies van verschillende signaalroutes te dekken. Het protocol omvat een eerste en eenvoudige evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, zuiverheid, productie van reactieve zuurstofsoorten, real-time migratie, fagocytose en een voorlopige suggestie van extracellulaire neutrofiele vallen.

Samenvatting

Neutrofielen staan bekend als een van de eerste verdedigingslinies in de aangeboren immuunrespons en kunnen veel specifieke cellulaire functies uitvoeren, zoals chemotaxis, omgekeerde migratie, fagocytose, degranulatie van cytotoxische enzymen en metabolieten en afgifte van DNA als neutrofiele extracellulaire vallen (NET's). Neutrofielen hebben niet alleen zelf een strak gereguleerde signalering, maar nemen ook deel aan de regulatie van andere componenten van het immuunsysteem. Aangezien verse neutrofielen terminaal gedifferentieerd zijn, van korte duur zijn en zeer variabel zijn tussen individuen, is het belangrijk om het meeste uit de verzamelde monsters te halen. Onderzoekers moeten vaak screeningstests uitvoeren om een overzicht te krijgen van de vele neutrofiele functies die kunnen worden beïnvloed door specifieke omstandigheden die worden geëvalueerd. Om aan deze behoefte te voldoen, werd een reeks tests ontwikkeld na een enkel isolatieproces van neutrofielen met normale dichtheid, waarbij werd gezocht naar een evenwicht tussen snelheid, volledigheid, kosten en nauwkeurigheid. De resultaten kunnen worden gebruikt om diepgaande vervolgstudies te beredeneren en te begeleiden. Deze procedure kan worden uitgevoerd in een gemiddelde tijd van 4 uur en omvat de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), real-time migratie en fagocytose van gist op glasplaatjes, waardoor er voldoende cellen overblijven voor meer gedetailleerde benaderingen zoals omics-studies. Bovendien omvat de procedure een manier om gemakkelijk een voorlopige suggestie van NET waar te nemen na snelle panoptische kleuring waargenomen door lichtmicroscopie, met een gebrek aan specifieke markers, zij het voldoende om aan te geven of verdere inspanningen op die manier de moeite waard zouden zijn. De diversiteit aan geteste functies combineert gemeenschappelijke punten tussen tests, waardoor de analysetijd en -kosten worden verminderd. De procedure kreeg de naam NeutroFun Screen, en hoewel het beperkingen heeft, brengt het de bovengenoemde factoren in evenwicht. Bovendien is het doel van dit werk niet een definitieve testset, maar eerder een richtlijn die gemakkelijk kan worden aangepast aan de middelen en eisen van elk lab.

Inleiding

Neutrofielen zijn de meest voorkomende aangeboren immuuncellen in menselijk bloed en het is bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij infectie en ontsteking, omdat ze de eerste responders zijn die op de plaats van weefselbeschadiging aankomen1. In de afgelopen jaren is er een groeiende erkenning van de cruciale rol die neutrofielen spelen bij een verscheidenheid aan ziekten en bij het ondersteunen van homeostase2. Neutrofielen hebben niet alleen zelf een strak gereguleerde signalering, maar nemen ook deel aan de regulatie van andere componenten van het immuunsysteem 3,4,5. Daarom is het onderzoeken van neutrofielen en hun vele ongebruikelijke cellulaire functies, zoals chemotaxis, omgekeerde migratie6, fagocytose7, respiratoire uitbarsting8 en het vrijkomen van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's)7, absoluut noodzakelijk in tal van onderzoekscontexten waar het noodzakelijk is om de potentiële neutrofiele functionele, morfologische of moleculaire veranderingen te beoordelen die worden veroorzaakt door specifieke omstandigheden die worden geanalyseerd.

Pas geïsoleerde neutrofielen zijn terminaal gedifferentieerd, kortlevend, zeer dynamisch en gemakkelijk te activeren9. Een efficiënte opslagmethode die geen invloed heeft op de neutrofielenresponsen is echter nog niet bereikt, waardoor het een uitdaging is om meerdere tests uit te voeren die ononderbroken moeten zijn. Bovendien zijn eerder beschreven functionele analyses 10,11, gebaseerd op tests die cytometrie en/of fluorescerende kleuring vereisen, mogelijk geen haalbare keuze wanneer een brede en eerste evaluatie van de neutrofielen nodig is.

Om deze problemen aan te pakken, beschrijft dit protocol een reeks tests die kunnen worden uitgevoerd na een enkel isolatieproces, waaronder de evaluatie van de levensvatbaarheid van cellen, de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), real-time migratie en fagocytose van Saccharomyces cerevisiae, waarvan de resultaten kunnen worden gebruikt om diepgaande vervolgstudies te redeneren. Deze procedure, NeutroFun Screen genaamd, is ontworpen om de belangrijkste effectoractiviteiten te omvatten, behalve degranulatie, en kan worden voltooid in een gemiddelde tijd van 4 uur, inclusief 1 uur activering. Bovendien kunnen de resterende cellen worden gebruikt voor meer gedetailleerde benaderingen zoals omics-studies. Het voordeel van deze methode ligt in de balans tussen snelheid, volledigheid, kosten en nauwkeurigheid.

Bovendien is er een manier om gemakkelijk een voorlopige suggestie van NET waar te nemen, zonder specifieke markers, maar voldoende om aan te geven of verdere inspanningen in die richting de moeite waard zouden zijn. De diversiteit aan geteste functies is bedoeld om gemeenschappelijke punten tussen tests te combineren, waardoor de analysetijd en -kosten worden verminderd. Het belangrijkste doel van deze methode is om een evenwichtige, functionele analyse te bieden met betrekking tot snelheid, volledigheid, kosten en nauwkeurigheid die een overzicht mogelijk maakt van de respons van de neutrofielen, waardoor het een nuttige eerste stap is in het onderzoeken van de effecten van nieuwe stimuli op neutrofielen met normale dichtheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten volgden strikt de ethische richtlijnen die zijn opgesteld door de institutionele beoordelingsraad van de Universiteit van Brasilia (proces 13364819.0.0000.5558), en monsters werden geïdentificeerd door codes om de anonimiteit van de donor te waarborgen. De cellen werden verkregen van normale gezonde mannelijke donoren in de leeftijd van 18-35 jaar, die de geïnformeerde toestemming ondertekenden en voldeden aan de volgende geschiktheidscriteria: niet-rokers/vapers, geen chronische gezondheidsproblemen en geen voorgeschiedenis van ontstekingsaandoeningen in de afgelopen 14 dagen.

1. Bloedafname

  1. Plaats aseptisch 0,3 ml heparine van 5.000 IE/ml (zie materiaaltabel) in een steriele spuit van 20 ml om het te hepariniseren.
  2. Breng een veneuze tourniquet ongeveer 4 inch boven de prikplaats aan en identificeer de mediane cubitale of cephalische ader voor venapunctie.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de totale tourniquettijd niet langer is dan 1 minuut.
  3. Reinig de prikplaats met 70% alcohol en voer de venapunctie uit.
  4. Keer de spuit drie of vier keer voorzichtig om nadat u het bloed hebt verzameld om het bloed en de heparine goed te mengen.

2. Isolatie van neutrofielen

OPMERKING: Polymorfonucleaire leukocyten (PMN's) worden geïsoleerd door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie gevolgd door hypotone lysis van de resterende rode bloedcellen (RBC), zoals eerder beschreven11 met enkele veranderingen. Deze methode is niet verplicht om de screeningstests uit te voeren en kan worden vervangen zolang de gekozen methode resulteert in een levensvatbaarheid van >97%, priming of activering van <3% van de PMN's en voldoende cellen oplevert voor alle tests, replicaten en omstandigheden. Het uitvoeren van deze stappen onder aseptische omstandigheden en het gebruik van endotoxinevrije oplossingen zijn verplicht om celactivering te voorkomen.

  1. Maak verdunningen van 12 ml van 60% en 70% scheidingsmedia (in de handel verkrijgbaar; zie Materiaaltabel) in conische buisjes van 50 ml.
  2. Bereid de gradiënt van onder naar boven voor door 4 ml per keer de 60% verdunning over de 70% verdunning toe te voegen met behulp van een pipet van 5 ml. Doe dit voorzichtig om te voorkomen dat de interface wordt verwisseld.
  3. Leg voorzichtig 12 ml gehepariniseerd bloed bovenop de dichtheidsgradiënt. Centrifugeer op 200 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Vanaf deze stap, tot aan de activering van PMN, moeten alle gebruikte reagentia en buizen in een koeler gevuld met ijs worden bewaard.
  4. Gooi de plasma-/mononucleaire cellaag weg en breng de laag boven de erytrocytenpellet voorzichtig over in twee conische buisjes van 15 ml met elk ongeveer 7,5 ml. Vul het buisvolume aan met Hank's uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS; zie Tabel met materialen).
  5. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 19 °C.
  6. Was de celkorrel met HBSS.
    1. Gooi het supernatans weg door de buis te gieten en resuspendeer de pellet voorzichtig in 7 ml HBSS.
    2. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij 19 °C om alle scheidingsmedia te verwijderen.
  7. Voer hypotone lysis uit van de resterende rode bloedcellen.
    1. Gooi het supernatans weg en combineer de pellets in een enkele buis.
    2. Resuspendeer de RBC/PMN-pellet in 3 ml steriele H2O en voeg binnen 25 s 3 ml HBSS (2x) toe om de osmolariteit te herstellen. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 300 x g bij 19 °C.
    3. Herhaal stap 2.8.1 en 2.8.2 voor een witte, erytrocytenvrije pellet.
      OPMERKING: Het supernatans moet zo snel mogelijk worden verwijderd om het contact van neutrofielen met RBC-afbraakproducten tot een minimum te beperken. Als alternatief kan de tweede hypotone lysis worden vervangen door de resterende RBC-laag voorzichtig te resuspenderen en al het supernatant te verwijderen, aangezien de resterende RBC's boven de PMN-pellet zullen bezinken.
  8. Gooi het supernatans weg door de buis te gieten, resuspendeer de PMN's voorzichtig in de resterende buffer en breng ze over naar een ijskoude microbuis.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat u het volume annoteert terwijl u de geresuspendeerde cellen overbrengt met een micropipet.
  9. Breng 3 x 1 μl van de celsuspensie over op een schoon glasplaatje (drie putjes van elk 1 μl) en kleur met snelle panoptiek (zie materiaaltabel) voor morfologie en zuiverheidsevaluatie12.
    1. Om te kleuren met snelle panoptiek, dompelt u het objectglaasje vijf keer onder in panoptisch fixatiemiddel nr. 1, zes keer in eosine nr. 2 en tweemaal in hematoxyline nr. 3, waarbij elke onderdompeling 1 s duurt.
    2. Was het objectglaasje voorzichtig met gedestilleerd water.
    3. Laat uitlekken en aan de lucht laten drogen.
  10. Observeer onder een microscoop en tel 300 willekeurige cellen in elk putje, waardoor de neutrofielen worden onderscheiden van andere granulocyten.
  11. Breng 1 μL van de celsuspensie over naar 49 μL 0,2% trypanblauwe kleurstof13 en tel de cellen met behulp van een Neubauer-kamer, waarbij onderscheid wordt gemaakt tussen dode en levensvatbare cellen.
  12. Pas de celconcentratie aan tot 6.667 cellen/μL met behulp van een oplossing van 50% autoloog plasma en 50% HBSS aangevuld met calcium en magnesium. Verdeel de suspensie van 6,667 cellen/μl gelijkmatig over de microbuisjes die overeenkomen met de te testen omstandigheden, inclusief de negatieve controle.
    OPMERKING: Elke celconcentratie die vergelijkbaar is met de circulerende neutrofielen in het modelorganisme kan worden gebruikt, maar het is belangrijk om in alle experimenten dezelfde celconcentratie te gebruiken voor reproduceerbaarheid.

figure-protocol-1
Figuur 1: Het neutrofielenisolatieprotocol. Twee concentraties van het scheidingsmedium (percoll) (A) worden gestapeld (B), waarna het bloed bovenop de scheidingsgradiënt (C) wordt gelegd. Na het centrifugeren bevindt de PMN zich in de centrale laag (D), die is verdeeld in twee buisjes van 15 ml (E). De celsuspensie wordt tweemaal gewassen in HBSS en gecentrifugeerd (G-I) om de media te verwijderen, vervolgens worden de cellen opnieuw gesuspendeerd en worden resterende RBC's onderworpen aan twee rondes van hypotone lysis (J-M). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Voorbereiding voor activering van neutrofielen

  1. Bereid in microbuisjes van 1,5 ml een activeringssysteem voor elke aandoening voor, zodat de uiteindelijke celconcentratie 6.600 cellen/μL is. Om bijvoorbeeld de effecten van 100 nM fMLP (N-formyl-methionyl-leucyl-fenylalanine; zie Materiaaltabel) te testen, voegt u 5 μL 10 μM fMLP toe aan 495 μL van de 6,667 cel/μL suspensie. Voeg voor de negatieve (niet-gestimuleerde) controle HBSS toe metCa 2+ en Mg2+.
    OPMERKING: Om deze methodologie te demonstreren, werden de volgende eindconcentraties van de stimuli gebruikt: 100 nM fMLP, 16 μM fallaxine, een natuurlijk voorkomend antimicrobieel peptide14 en 100 nM PMA (phorbol 12-myristaat 13-acetaat) (zie Tabel met materialen).
  2. Incubeer bij 37 °C zonder rotatie.
    OPMERKING: Alle aliquots voor functionele assays zijn afkomstig van deze celsuspensie, hierna het activeringssysteem genoemd.

4. Nitrotetrazoliumblauwchloride (NBT)-test voor het evalueren van de ROS-productie

  1. Bereiding van de NBT-werkoplossing: Bereid voor elke experimentele omstandigheid een NBT-werkoplossing (zie Materiaaltabel) van 6 mM met behulp van de volgende stappen:
    1. Los 0,0005 g NBT op in 10 μL dimethylsulfoxide (DMSO) en draai gedurende ten minste 15 minuten.
    2. Voeg 90 μL HBSS Ca2+Mg2+ toe en draai tot 2 min.
      NOTITIE: Alle stappen met betrekking tot NBT moeten in het donker worden uitgevoerd.
  2. Voer de NBT-objectglaasjestest uit.
    1. Na 20 minuten celactivatie mengt u de celsuspensie voorzichtig en brengt u voorzichtig 2 μL PMN over op een schoon objectglaasje. Incubeer gedurende 20 minuten in een bevochtigde kamer bij 37 °C.
      NOTITIE: Spreid de celophanging niet te veel over de slede; anders kan het vóór de incubatie uitdrogen.
    2. Voeg 1 μL van de NBT-werkoplossing toe aan de cellen en incubeer verder gedurende 20 minuten beschermd tegen licht.
    3. Droog het glaasje af met hete lucht en fixeer het met een druppel methanol in elk putje gedurende 1 minuut. Kleuring met 0,03% safranine (zie Materiaaltabel) gedurende 1 min.
    4. Was het objectglaasje voorzichtig met gedestilleerd water.
    5. Laat het objectglaasje aan de lucht drogen en observeer het onder een microscoop.
    6. Tel 100 willekeurige cellen in elk putje en onderscheid neutrofielen met en zonder formazaanse afzettingen.
  3. Voer een NBT-spectrofotometrietest uit.
    1. Na 40 minuten celactivatie mengt u de celsuspensie voorzichtig en brengt u 90 μL PMN's over van het activeringssysteem naar een schone microbuis. Voeg vervolgens voorzichtig 20 μL van de 6 mM NBT-oplossing toe. Incubeer in het donker gedurende 20 minuten bij 37 °C.
    2. Voeg 100 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS; zie materiaaltabel) en vortex toe.
    3. Sonicaat met behulp van een tip-sonicator met een amplitude van 60%, vijf cycli van elk 15 s met intervallen van 15 s. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 5 min.
    4. Breng 60 μl van het supernatans over naar een plaat met 96 putjes met heldere bodem en meet de absorptie van het formazanproduct bij 570 nm.

5. Fagocytose-test

  1. Bereid een suspensie van 33.000 gisten/μL voor elke toestand, zoals hieronder beschreven:
    1. Voeg ongeveer 0,75 mg droge gist (Saccharomyces cerevisiae; zie materiaaltabel) toe aan 200 μl HBSS Ca2+Mg2+ en incubeer in een thermomixer bij 100 °C met 500 tpm gedurende ten minste 15 min.
    2. Homogeniseer het mengsel door vortexen en breng 5 μL gistsuspensie over op 45 μL 0,2% trypanblauwe kleurstof. Tel de gisten met behulp van een Neubauer-kamer.
    3. Pas de concentratie van de initiële suspensie aan tot 33.000 gistcellen/μL met HBSS Ca2+Mg2+. Bewaar de suspensie op ijs tot gebruik.
  2. Na 20 minuten celactivatie mengt u de celsuspensie voorzichtig en brengt u 5 μL van het activeringssysteem over naar 5 μL van de 33.000 gist/μL Saccharomyces cerevisiae-suspensie in een nieuwe steriele microbuis.
    OPMERKING: De verhouding tussen neutrofielen en gist is 1:5 (PMN:gist).
  3. Breng onmiddellijk 6 μL van de PMN/gistsuspensie over in drie putjes van een schoon objectglaasje (elk 2 μL) en incubeer het objectglaasje gedurende 40 minuten in een bevochtigde kamer.
    NOTITIE: Spreid de celophanging niet te veel over de slede; anders kan het uitdrogen voordat het wordt uitgebroed.
  4. Droog het glaasje onder hete lucht en beits het met snelle panoptiek, zoals beschreven in stap 2.9 hierboven.
    OPMERKING: De derde stap van de snelle panoptische kleuring is van cruciaal belang voor de microscopie-analyse van het objectglaasje. Het kleuren van het objectglaasje gedurende ≥3 s in deze stap kan het ongeschikt maken voor analyse, omdat het moeilijk zal zijn gist te onderscheiden van neutrofiele kernkwabben.
  5. Bekijk de objectglaasjes onder de microscoop, tel 100 willekeurige neutrofielen van elk putje en maak onderscheid tussen PMN's positief en negatief voor fagocytose.
    OPMERKING: Ten minste één gistdeeltje in of in direct contact met het PMN-celmembraan duidt op een PMN-positief voor fagocytose. Als je geïnteresseerd bent in de gist/neutrofielenverhouding, tel dan ook het aantal gistdeeltjes dat wordt verzwolgen.

6. PMN-chemotaxis-test in real time

OPMERKING: De migratietest wordt op dezelfde manier uitgevoerd als het eerder beschreven protocol15, met de volgende aanpassingen:

  1. Bereid de chemotactische gradiënt voor door 160 μL chemolokstof (bijv. fMLP, IL-8, C5 of LTB4; zie Materiaaltabel) toe te voegen aan de onderste kamer van een op impedantie gebaseerde real-time cell analyzer (RTCA)-plaat. Voeg voor negatieve controles en blanco's 160 μL HBSS Ca2+Mg2+ toe.
  2. Bevestig de bovenste kamer en voeg 25 μL HBSS Ca2+Mg2+ toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur om de chemotactische gradiënt te vormen.
  3. Na 60 minuten celactivatie mengt u de celsuspensie voorzichtig en plaatst u 60 μL celsuspensie in de bovenste kamer. Voeg 60 μL HBSS Ca2+Mg2+ toe aan de blanco.
  4. Plaats de RTCA-plaat en programmeer de RTCA-software om gedurende 2 uur elke 60 s de celindex (CI) te meten.
    OPMERKING: De RTCA-platen kunnen worden gewassen voor hergebruik zoals eerder beschreven16. Samenvattend, was de RTCA-kamers en elektroden drie keer met fosfaat-buferred saline (PBS) en vervolgens twee keer met type I ultrapuur water. Incubeer de onderste en bovenste kamer met 0,25% trypsine 0,53 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) gedurende 40 minuten. Driemaal wassen met ultrapuur water.

7. NETTO suggestieve test

  1. Meng na 10 minuten celactivering voorzichtig de celsuspensie en breng 4 μL PMN's over van elk te evalueren activeringssysteem, verdeeld over twee putjes van een schoon glasplaatje. Incubeer in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 30 min.
  2. Voeg 1 μL DNAse I toe aan een van de putjes en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C (in een natte kamer).
  3. Droog het glaasje en de vlek af met snelle panoptiek, zoals eerder beschreven in stap 2.9 van het hoofdstuk "neutrofielenisolatie".
  4. Evalueer de objectglaasjes onder een microscoop.
    OPMERKING: Zoek naar enige indicatie van NET-release, gekenmerkt door de aanwezigheid van webachtige structuren. Eenmaal geïdentificeerd, bevestigen of de DNAse I-behandeling in staat was om dergelijke structuren te verwijderen. Deze test wijst op NET-vorming, aangezien aanvullende tests nodig zijn om hun aanwezigheid te bevestigen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De op dichtheid gebaseerde isolatiemethode die in deze studie werd gebruikt (figuur 1) voldeed aan de criteria voor de voorgestelde experimenten. Neutrofielenparameters die met deze methode werden verkregen, waren onder meer levensvatbaarheid ≥98%, zuiverheid ≥94% en celopbrengst ≥1,5 x 107, zonder activering die door de screeningstests kon worden gedetecteerd. Twee relevante stappen in de isolatie van PMN's zijn antistolling en verwijdering van rode bloedcellen. Door de antigecoa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Neutrofielen zijn zeer dynamische en responsieve cellen die van korte duur zijn en nog niet kunnen worden gecryopreserveerd19, waardoor onderzoek naar hun biologie een uitdaging is. Daarom is het essentieel om zorgvuldige stappen te volgen om levensvatbare, verrijkte en rustende neutrofielen te verkrijgen 11,20. Deze studie maakte gebruik van een op dichtheid gebaseerde isolatietechniek die de nadruk legt op zachte en minimale manipulatie,...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de volgende financieringsinstanties: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP en FINATEC.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
CIM-Plate 16Agilent 5665825001
CLARIOstar Plate Reader BMG LABTECHUS Patent Number 9,733,124
Productdetails: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxideDinâmica1582
DNAse ISigma - AldrichDN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrateSigma - AldrichE5134
Fast panoptic stainLaborclin620529
Glass slideExacta7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.Sigma - Aldrich55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.Sigma - AldrichH4641
HeparinBlau 7896014655229
Laminar flow cabinetVecoVLFS-12
MicroscopeZeiss415501-0101-002Productdetails: Primostar 1
Mixing BlockBIOERMB-102
Neubauer improved bright-linedNew Optik1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanineSigma - AldrichF3506
Nitroblue tetrazoliumNeonCAS 298-83-9
PercollCytiva17089101scheidingsmedia
Phorbol 12-myristate 13-acetateSigma - AldrichP8139
Phosphate buffered saline tabletSigma - AldrichP4417
ROTOFIX 32 AHettich1206
Saccharomyces cerevisiaeFleischmann
SafraninSigma - Aldrich50240
Sodium dodecyl sulfateCytiva17-1313-01
SonicatorQsonicaQ125
Trypan blue solutionVetecC.I. 23850
Vortex Genie 2Scientific Industries, Inc.0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)Agilent 380601050Productdetails: RTCA systeem, bestaande uit detectiehardware, celplaten en software

Referenties

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
  3. Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345(2017).
  4. Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
  5. Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147(2019).
  6. de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
  7. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  8. El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
  9. Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
  10. Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770(2021).
  11. Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
  12. Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
  14. Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
  15. Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
  16. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
  17. Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
  18. Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
  19. Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
  20. Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837(2021).
  21. Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991(2021).
  22. Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41(2019).
  23. Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316(2019).
  24. Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
  25. Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153(2019).
  26. Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
  27. Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637(2021).
  28. Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
  29. Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
  30. Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
  31. Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
  32. Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106(2021).
  33. Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27(2021).
  34. Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582(2020).
  35. Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337(2017).
  36. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  37. de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
  38. Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
  39. Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
  40. Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
  41. Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
  42. Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
  43. Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790(2020).
  44. Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
  45. Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825(2021).
  46. Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
  47. Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Neutrofielscreeningcellevensvatbaarheidreactieve zuurstofverbindingenfagocytose-assayreal-time migratieneutrofiele extracellulaire trapsisolatie via dichtheidsgradiëntNBT-assaychemotaxis-assay
Een reeks screeningstechnieken voor een snel overzicht van de neutrofielenfunctie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.