Dit protocol presenteert een unieke manier om celculturen van het centrale zenuwstelsel te genereren uit embryonale dag 17 muizenhersenen voor neuro(immuno)logisch onderzoek. Dit model kan worden geanalyseerd met behulp van verschillende experimentele technieken, waaronder RT-qPCR, microscopie, ELISA en flowcytometrie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het opzetten van gemengde neuronale en gliale celculturen van embryonale muizenhersenen om infectie en aangeboren immuniteit te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Modellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) moeten het complexe netwerk van onderling verbonden cellen in vivo samenvatten.Het CZS bestaat voornamelijk uit neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en microglia. Vanwege de toenemende inspanningen om het gebruik van dieren te vervangen en te verminderen, zijn er verschillende in vitro celkweeksystemen ontwikkeld om aangeboren celeigenschappen te onderzoeken, die de ontwikkeling van therapieën voor CZS-infecties en pathologieën mogelijk maken. Hoewel bepaalde onderzoeksvragen kunnen worden aangepakt door op mensen gebaseerde celkweeksystemen, zoals (geïnduceerde) pluripotente stamcellen, heeft het werken met menselijke cellen zijn eigen beperkingen met betrekking tot beschikbaarheid, kosten en ethiek. Hier beschrijven we een uniek protocol voor het isoleren en kweken van cellen uit embryonale muizenhersenen. De resulterende gemengde neurale celculturen bootsen verschillende celpopulaties en interacties na die in vivo in de hersenen worden aangetroffen. In vergelijking met de huidige equivalente methoden bootst dit protocol de kenmerken van de hersenen beter na en verzamelt het ook meer cellen, waardoor meer experimentele omstandigheden van één zwangere muis kunnen worden onderzocht. Verder is het protocol relatief eenvoudig en zeer reproduceerbaar. Deze culturen zijn geoptimaliseerd voor gebruik op verschillende schalen, waaronder 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analyse en 6-well culturen voor flow cytometrie en reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analyse. Deze kweekmethode is een krachtig hulpmiddel om infectie en immuniteit te onderzoeken binnen de context van een deel van de complexiteit van het CZS met het gemak van in vitro methoden.
Inleiding
Het verbeteren van ons begrip van het centrale zenuwstelsel (CZS) is van cruciaal belang om de therapeutische opties voor veel neuro-inflammatoire en neurodegeneratieve ziekten te verbeteren. Het CZS, een complex netwerk van onderling verbonden cellen in de hersenen, het ruggenmerg en de oogzenuwen, bestaat uit neuronen, oligodendrocyten, astrocyten en hun aangeboren immuuncellen, de microglia1. Een in vitro aanpak kan vaak het aantal muizen dat nodig is om zinvol onderzoek uit te voeren drastisch verminderen; de complexe aard van het CZS maakt het echter onmogelijk om de in vivo situatie samen te vatten met behulp van cellijn....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven voldeden aan de lokale wetten en richtlijnen voor diergebruik en werden goedgekeurd door de lokale ethische beoordelingscommissie van de Universiteit van Glasgow. Dieren werden gehuisvest in specifieke pathogeenvrije omstandigheden in overeenstemming met de UK Animals Scientific Procedures Act 1986, onder auspiciën van een UK Home Office Project License. Voor deze studie werden in-house gefokte volwassen C57BL/6J muizen gebruikt. Het gebruik van jonge vrouwen (8-12 weken) wordt aanbevolen vanwege het hogere slagingspercentage van de zwangerschap; Mannetjes kunnen worden hergebruikt voor meerdere fokrondes. Figuur 1 geeft ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Microscopie
Culturen gekweekt op glazen dekplaten zijn ideaal om te analyseren door middel van microscopie. Om de ontwikkeling van de culturen te visualiseren, werden de coverslips gefixeerd in 4% paraformaldehyde (PFA) op meerdere tijdstippen van DIV0 (zodra cellen waren bevestigd) tot DIV28. De culturen werden gekleurd voor immunofluorescentiebeeldvorming zoals eerder beschreven5 met behulp van drie verschillende kleurcombinaties: NG2 (onrijpe oligodendrocyten) en nestine (ne.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het CZS is een complex netwerk dat zich uitstrekt van de hersenen tot aan het ruggenmerg en bestaat uit vele celtypen, voornamelijk neuronen, oligodendrocyten, astrocyten en microglia1. Omdat elke cel een belangrijke rol speelt bij het handhaven van homeostase en het genereren van passende reacties op uitdagingen in het CZS 9,10,11, is een kweeksysteem dat al deze celtypen bevat een nuttig en veelzijdig hulpmiddel om te onderzo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen graag de leden van de Edgar- en Linington-laboratoria bedanken, in het bijzonder prof. Chris Linington, dr. Diana Arseni en dr. Katja Muecklisch, voor hun advies, nuttige opmerkingen en hulp bij het voeden van de culturen terwijl we deze culturen opzetten. Speciale dank gaat uit naar Dr. Muecklisch voor het leveren van de uitgangspunten voor de Cell Profiler-pijplijnen. Dit werk werd ondersteund door de MS Society (subsidie 122) en de Yuri en Lorna Chernajovsky stichting aan MP; Financiering van de Universiteit van Glasgow aan JC en MP; en Wellcome Trust (217093/Z/19/Z) en Medical Research Council (MRV0109721) aan GJG.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10x Trypsin | Sigma | T4549-100ML | Om weefsel te verteren |
| 140 mm TC Dish | Fisher | 11339283 | Plaats 8 35 mm schalen per 1 140 mm schaal |
| 15 mL Falcon | Sarstedt | 62554502 | Om cellen te verzamelen in pellet voor resuspendering in beplatingsmedium |
| 18 G naald | Henke Sass Wolf | 4710012040 | Voor trituratie van monster |
| 21 G naald | BD | 304432 | Voor trituratie van monster |
| 23 G naald | Henke Sass Wolf | 4710006030 | Voor trituratie van monster |
| 35 mm TC Dish | Corning | 430165 | Plaats 3 PLL gecoate deksels per 1 35 mm schaal |
| 5 mL spuit | Fisher | 15869152 | Voor trituratie van monster |
| 6 wel plate | Corning | 3516 | Om cellen uit te plateren voor RT-qPCR en flowcytometrie |
| 7 mL Bijoux | Fisher | DIS080010R | Om hersenen in te plaatsen |
| 96 wel plate | Corning | 3596 | Om cellen uit te plateren voor high-throughput testen |
| ACSA-2 Antilichaam, anti-muis, PE | Miltenyi | 130-123-284 | Voor flowcytometrie kleuring van astrocyten |
| Gebogen pincet | Dumont | 0108-5/45-PO | Voor dissectie |
| Biotine | Sigma | B4501 | Voor DM+/- |
| Boorzuur | Sigma | B6768-500G | Voor boorzuur buffer |
| Brilliant Violet 421 anti-muis CD24 Antilichaam, clone M1-69 | Biolegend | 101825 | Voor flowcytometrie kleuring van neuronen en astrocyten |
| Brilliant Violet 605 anti-muis CD45 Antilichaam, clone 30-F11 | Biolegend | 103139 | Voor flowcytometrie kleuring van microglia |
| Brilliant Violet 785 anti-muis/mens CD11b Antilichaam, clone M1/70 | Biolegend | 101243 | Voor flowcytometrie kleuring van microglia |
| BSA Fractie V | Sigma | A3059-10G | Voor SD Remmer |
| CNP | Abcam | AB6319 | Volwassen oligodendrocyten |
| Deksel | VWR | 631-0149 | Om cellen uit te plateren voor microscopie |
| Dissectie schaar | Sigma | S3146-1EA | Voor dissectie |
| DMEM Hoge glucose, natriumpyruvaat, L-Glutamine | Gibco | 21969-035 | Voor DM+/-, en voor beplatingsmedium |
| DNase I | Thermofisher | 18047019 | Voor SD Remmer, kan dit of de andere Dnase van Sigma gebruiken |
| DNase I | Sigma | D4263 | Voor SD Remmer, kan dit of de andere Dnase van Thermofisher gebruiken |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780 | Thermofisher | 65-0865-14 | Live / Dead kleuring |
| Fijne pincet | Dumont | 0102-SS135-PO | Voor dissectie |
| GFAP | Invitrogen | 13-0300 | Astrocyten |
| HBSS met Ca Mg | Sigma | H9269-500ML | Voor beplatingsmedium |
| HBSS zonder Ca Mg | Sigma | H9394-500ML | Voor hersenen om toe te voegen |
| Paardenserum | Gibco | 26050-070 | Voor beplatingsmedium |
| Hydrocortison | Sigma | H0396 | Voor DM+/- |
| Iba1 | Alpha-Laboratories | 019-1971 | Microglia |
| Insulin | Sigma | I1882 | Voor DM+ |
| Leibovitz L-15 | Gibco | 11415-049 | Voor SD Remmer |
| MBP | Bio-Rad | MCA409S | Myeline |
| Mouse CCL5/RANTES DuoSet ELISA Kit | BioTechne | DY478-05 | ELISA kit voor het kwantificeren van de concentratie van CCL5 in supernatanten van 96 wel plate |
| N1 media supplement | Sigma | N6530-5ML | Voor DM+/- |
| Nestin | Merck | MAB353 | Neurale stam/voorlopercellen |
| NeuN | Thermofisher | PA578499 | Neuronaal cellichaam |
| NG2 | Sigma | AB5320 | Onvolwassen oligodendrocyten |
| O4 Antilichaam, anti-mens/muis/rat, APC | Miltenyi | 130-119-155 | Voor flowcytometrie kleuring van oligodendrocyten |
| Pen/Strep | Sigma | P0781-100ML | Voor DM+/-, en voor beplatingsmedium |
| Poly-L-Lysinehydrobromide | Sigma | P1274 | Voor boorzuur / poly-L-lysine oplossing om deksels te coaten |
| SMI31 | BioLegend | 801601 | Axonen |
| Natriumtetraboraat | Sigma | 221732-100G | Voor boorzuur buffer |
| Trizol | Thermofisher | 15596026 | Voor het lyseren van cellen voor RT-qPCR |
| Trypsine remmer uit sojabonen | Sigma | T9003-100MG | Voor SD Remmer |
Referenties
- Kovacs, G. G. Cellular reactions of the central nervous system. Handbook of Clinical Neurology. 145, Elsevier. 13-23 (2018).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Techniques. 1, Methuen. (1959).
- Hubrecht, R. C., Carter, E.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
