Shear Assay Protocol voor de bepaling van eencellige materiaaleigenschappen

Summary

Dit protocol schetst de kwantificering van de mechanische eigenschappen van kankerachtige en niet-kankerachtige cellijnen in vitro. Geconserveerde verschillen in de mechanica van kankercellen en normale cellen kunnen fungeren als een biomarker die implicaties kan hebben voor de prognose en diagnose.

Abstract

Onregelmatige biomechanica is een kenmerk van kankerbiologie die uitgebreid wordt bestudeerd. De mechanische eigenschappen van een cel zijn vergelijkbaar met die van een materiaal. De weerstand van een cel tegen stress en spanning, de ontspanningstijd en de elasticiteit zijn allemaal eigenschappen die kunnen worden afgeleid en vergeleken met andere soorten cellen. Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van kankerachtige (kwaadaardige) versus normale (niet-kwaadaardige) cellen stelt onderzoekers in staat om de biofysische fundamenten van deze ziekte verder te ontdekken. Hoewel bekend is dat de mechanische eigenschappen van kankercellen consequent verschillen van de mechanische eigenschappen van normale cellen, ontbreekt een standaard experimentele procedure om deze eigenschappen af te leiden van cellen in cultuur.

Dit artikel schetst een procedure om de mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen in vitro te kwantificeren met behulp van een vloeistofschuiftest. Het principe achter deze test omvat het toepassen van vloeistofschuifspanning op een enkele cel en het optisch monitoren van de resulterende cellulaire vervorming in de loop van de tijd. Celmechanische eigenschappen worden vervolgens gekarakteriseerd met behulp van digitale beeldcorrelatie (DIC) -analyse en het aanpassen van een geschikt visco-elastisch model aan de experimentele gegevens die uit de DIC-analyse worden gegenereerd. Over het algemeen is het hier beschreven protocol gericht op het bieden van een effectievere en gerichtere methode voor de diagnose van moeilijk te behandelen kankers.

Introduction

Het bestuderen van de biofysische verschillen tussen kankercellen en niet-kankercellen biedt nieuwe diagnostische en therapeutische mogelijkheden¹. Inzicht in hoe verschillen in biomechanica / mechanobiologie bijdragen aan tumorprogressie en behandelingsresistentie zal nieuwe wegen onthullen voor gerichte therapie en vroege diagnose².

Hoewel bekend is dat de mechanische eigenschappen van kankercellen verschillen van normale cellen (bijv. Visco-elasticiteit van het plasmamembraan en de nucleaire envelop)^3,4,5, ontbreken robuuste en reproduceerbare methoden voor het meten van deze eigenschappen in levende cellen 6. De shear assay-methode wordt gebruikt om de mechanische eigenschappen van cellen te kwantificeren door afzonderlijke cellen te onderwerpen aan vloeistofschuifspanning en hun individuele reacties en weerstand tegen de toegepaste spanning^{te analyseren} 3,4,5,7,8,9. Hoewel verschillende methoden en technieken zijn gebruikt om de mechanische eigenschappen van afzonderlijke cellen te karakteriseren, hebben deze de neiging om de eigenschappen van het celmateriaal te beïnvloeden door i) het celmembraan te perforeren / beschadigen als gevolg van de inkepingsdiepte, complexe tipgeometrieën of substraatverstijving geassocieerd met atoomkrachtmicroscopie (AFM) ^10,11, ii) het induceren van cellulaire fotoschade tijdens optische overvulling ^{12, 13}, of iii) het induceren van complexe stresstoestanden geassocieerd met micropipetaspiratie^14,15. Deze externe effecten gaan gepaard met aanzienlijke onzekerheden in de nauwkeurigheid van celvisco-elasticiteitsmetingen 6,16,17.

Om deze beperkingen aan te pakken, biedt de hier beschreven afschuiftestmethode een zeer controleerbare en eenvoudige benadering om de fysiologische stroming in het lichaam te simuleren zonder de eigenschappen van cellulair materiaal in het proces te beïnvloeden. Vloeistofschuifspanningen in deze test vertegenwoordigen mechanische spanningen die door cellen in het lichaam worden ervaren, hetzij door vloeistoffen in het tumorinterstitium of in het bloed tijdens circulatie^18,19,20. Verder bevorderen deze vloeistofspanningen verschillende kwaadaardige gedragingen in kankercellen, waaronder progressie, migratie, metastase en celdood 19,21,22,23 die variëren tussen tumorogene en niet-tumorigene cellen. Bovendien stellen de veranderde mechanische kenmerken van kankercellen (d.w.z. ze zijn vaak "zachter" dan normale cellen in hetzelfde orgaan) hen in staat om te blijven bestaan in vijandige tumormicro-omgevingen, omliggende normale weefsels binnen te dringen en uit te zaaien naar verre locaties^24,25,26. Door een pseudo-biologische omgeving te creëren waar cellen fysiologische niveaus van vloeistofschuifspanning ervaren, wordt een proces bereikt dat fysiologisch relevant is en niet destructief voor de cel. De cellulaire reacties op deze toegepaste vloeistofschuifspanningen stellen ons in staat om celmechanische eigenschappen te karakteriseren.

Dit artikel biedt een afschuiftestprotocol voor de uitgebreide studie van de mechanische eigenschappen en het gedrag van kankercellen en niet-kankercellen onder toegepaste schuifspanning. Cellen reageren op externe krachten op een elastische en stroperige manier en kunnen daarom worden geïdealiseerd als een visco-elastisch materiaal³. Deze techniek is onderverdeeld in: (i) celcultuur van gedispergeerde afzonderlijke cellen, (ii) gecontroleerde toepassing van vloeistofschuifspanning, (iii) in situ beeldvorming en observatie van cellulair gedrag (inclusief weerstand tegen stress en vervorming), (iv) spanningsanalyse van cellen om de mate van vervorming te bepalen, en (v) karakterisering van de visco-elastische eigenschappen van afzonderlijke cellen. Door deze mechanische eigenschappen en gedragingen te onderzoeken, kan complexe cellulaire mechanobiologie worden gedestilleerd tot kwantificeerbare gegevens. Een protocol dat deze methode beschrijft, maakt het mogelijk om verschillende kwaadaardige en niet-kwaadaardige celtypen te catalogiseren en te vergelijken. Het kwantificeren van deze verschillen heeft het potentieel om diagnostische en therapeutische biomarkers vast te stellen.

Protocol

1. Voorbereiding voor de eencellige afschuiftest

1. Celkweek
   1. Zaai ongeveer 50.000 gesuspendeerde enkele cellen in een petrischaal van 35 mm x 10 mm met 2 ml kweekmedia.
      OPMERKING: Vortex de gesuspendeerde cellen voorafgaand aan het zaaien om celaggregaten uit elkaar te halen.
   2. Incubeer de cellen bij 37 °C en laat tussen 10 en 48 uur voor celaanhechting en volledige cytoskeletale eiwitvorming.
      OPMERKING: Overweeg de duur van cellulaire hechting, evenals proliferatie en groeisnelheden, om voldoende cellulaire groei en hechting te garanderen terwijl celaggregatie wordt vermeden. Deze parameters variëren per celtype.

2. Shear assay experiment

1. Bereiding van afschuifassay viskeuze stromingsmedia
   1. Om een licht viskeus stromingsmedium (0,015-0,02 Pa·s) te garanderen, meet en voeg 0,05 wt% niet-toxische en niet-allergene methylcellulose (4 Pa·s) toe aan de kweekmedia.
   2. Om een homogeen mengsel te garanderen, verwarmt u de basiscultuurmedia gedurende ~10-20 minuten bij een temperatuur van ~60-70 °C voor met een magnetische roerder/hete plaat. Terwijl u voortdurend de media roert, voegt u de methylcellulose voorzichtig toe, zodat deze zich snel verspreidt, om coagulatie van de methylcellulosedeeltjes te voorkomen. Laat dit proces ~ 15-24 uur doorgaan om een duidelijke oplossing van media + cellulose te garanderen.
      OPMERKING: Vermijd overmatige verwarming van de oplossing.
   3. Om de viscositeit van de stroommedia te meten, test u ~ 0,5-1 ml van de representatieve stroommedia met behulp van een rheometer. Bepaal uit de uitlezing de vloeistofviscositeit en gebruik deze waarde om de viscositeit van het afschuifvloeistofmedium (μ) weer te geven om de schuifspanning te berekenen met behulp van vergelijking (2).
2. Afschuifapparatuur instellen
   1. Stel het afschuiftestsysteem in van dubbele spuiten (60 ml of 100 ml) die zijn aangesloten op een programmeerbare spuitpomp voor infusie en opzuigen van de viskeuze kweekmedia (figuur 1).
   2. Bevestig beide spuiten aan de stroomkamer via 1/16 inch slang- en buisconnectoren.
   3. Bevestig een rubberen pakking voor een gecontroleerde, uniforme stroom op afzonderlijke cellen langs het stroompad (figuur 1). De rubberen pakking is verkrijgbaar in verschillende maten, afhankelijk van het te bereiken stromingsprofiel (laminair of turbulent) en het gewenste waarnemingsgebied (bijv. lengte van 22,5 mm, breedte van 2,5 mm en hoogte van 0,254 mm) (figuur 1).
   4. Programmeer de pomp om een bepaald volume vloeistof (bijv. 60 ml) met een bepaalde snelheid (bijv. 1 ml / min) te injecteren en op te zuigen en selecteer de bijbehorende spuiten (bijv. 60 ml).
      OPMERKING: Houd rekening met de maximale infusie- en opzuigvolumevoorinstellingen om vastlopen of storingen te voorkomen. Gebruik vergelijking (2) voor de berekening van de vereiste pompafschuifsnelheid (ervan uitgaande dat de vereiste spanning en viscositeit bekend zijn).
3. Pre-shear setup
   1. Vul de spuit met de voorbereide viskeuze stroommedia.
   2. Bevestig de spuit, gevuld met 60 of 100 ml (of indien nodig) viskeuze stroommedia, en een lege spuit van 60 ml op hun respectieve locaties op de programmeerbare spuitpomp. Verbind via slang- en buisconnectoren beide spuiten met de stroomkamer.
   3. Om een eenvoudige identificatie van afzonderlijke cellen en een bevestigde verbinding tussen de stroomkamer en de petrischaal te garanderen, bevestigt u de rubberen pakking aan de stroomkamer.
   4. Zuig de celkweekmedia op uit de petrischaal met de cellen van belang.
   5. Was dode cellen en losjes gehechte cellen af met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
   6. Zuig de PBS op.
   7. Plaats en bevestig de stroomkamer en rubberen pakking (~ 34 mm x 9 mm) op de petrischaal (35 mm x 10 mm) met de aangesloten cellen.
   8. Plaats de aangebrachte microfluïdische stroomkamer + cellen op een gekweekte schaal op een omgekeerde microscoop, met een microscoopobjectief dat hoog genoeg is om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen met hoge pixelwaarden (meestal tussen 40x en 63x vergroting) en een beeldscherm.
   9. Selecteer de optie live beeld (time-lapse op sommige software) in de microscoopsoftware op de beeldscherm. Zorg ervoor dat de microscoopsoftware op de pc een t-functionaliteit (time-lapse) heeft of video-opnamen kan maken.
   10. Focus het microscoopobjectief en zorg voor voldoende contrast en duidelijke celranden. Dit is nodig voor de beeldanalyse post-shear. Verplaats het microscoopstadium om ervoor te zorgen dat de cellen duidelijk zichtbaar zijn op het beeldscherm en live beelden zijn.
   11. Selecteer een cel of meerdere afzonderlijke cellen binnen het beeldvormings-/stroompad van de aangebrachte stroomkamer + petrischaal (het gebied/pad dat ontstaat door de pakking op de stroomkamer aan te sluiten).
4. Afschuiving en beeldvorming
   1. Om een continue uniforme stroom te behouden, selecteert u vergelijkbare infusie- en opzuigsnelheden en zorgt u voor laminaire stroming van de vloeistof, meestal tussen 1 ml / min en 5 ml / min. Voor lage laminaire stromingsregimes, zorg voor een Reynold's aantal Re < 100.
   2. Klik op Uitvoeren op de afschuifpomp om de schuifvloeistof (voorbereide viskeuze media) continu te injecteren en op te zuigen. Zorg ervoor dat er geen bubbels zijn tijdens vloeistofinfusie, omdat dit externe niet-geregistreerde stress op de cellen kan veroorzaken.
   3. Begin met het opnemen van een video door op opnemen in de microscoopsoftware te klikken voordat de geïnfundeerde schuifvloeistof contact maakt met de cel (en) van belang onder de microscoop.
   4. Blijf opnemen gedurende 7 minuten, of voor de gewenste duur van stressblootstelling, of totdat de cel (en) van belang de bodem van de schaal afscheert. Klik op stoppen met opnemen op de microscoopsoftware wanneer de run naar wens is voltooid.
   5. Sla de opname op en pak ze uit als .tiff bestanden. Extraheer bij voorkeur afbeeldingen met 1 frame per seconde voor eenvoudige analyse.

3. Gegevensverwerking

1. Procedure voor digitale beeldcorrelatie (beeldanalyse)
   1. Als de opname van de microscoop is geëxtraheerd als een videobestand, converteert u deze naar beeldframes (bij voorkeur .tiff bestandsindeling).
   2. Importeer de beelden die zijn afgeleid van de afschuiftestopname naar Davis 10.1.2-software (DIC-software) om de beweging van de natuurlijk patroonstructuren van de cel te volgen door elk blok pixel (subset) van het referentiebeeld in de respectieve nieuwe afbeeldingen (vervormde afbeeldingen) te lokaliseren (figuur 2).
   3. Gebruik voor een geoptimaliseerde correlatie een subsetgrootte van 31 x 31 pixels, een stapgrootte (vervormingsafstand van elke subset) van 20 pixels en de som van de differentiaaltrackoptie , die de vervorming van een nieuwe afbeelding ten opzichte van de laatste afbeelding bijhoudt. Het resultaat van deze correlatie is een rektijdplot (figuur 3) die kan worden geëxporteerd als een .csv-bestand voor verdere analyse in MATLAB.
   4. Breng het interessegebied voor een gekozen enkele cel in kaart. Selecteer willekeurige punten in de toegewezen cel om vervorming bij te houden. Voor een onregelmatige vorm, zoals de cel, gebruikt u een veelhoekmasker om de geometrie van de cel in kaart te brengen.
   5. Kies na het in kaart brengen specifieke punten op de cel (kern of cytoplasma) die moeten worden geanalyseerd door op spanningsmeter toevoegen te klikken en individuele rekstrookjes uit te tekenen op punten binnen de gedefinieerde cellulaire grens.
   6. Klik op Uitvoeren om de stamverwerking te starten en stam- versus tijdgegevens te verkrijgen.
   7. Dubbelklik (of klik met de rechtermuisknop) op de gegenereerde stamtijdplot en selecteer gegevens exporteren als spreadsheet.

4. Karakterisering van mechanische eigenschappen

1. Visco-elastische eigenschapskarakterisering
   1. Sla het .csv bestand met de stamtijdgegevens van de DIC-software op in een aparte map voor eenvoudige leesbaarheid door MATLAB.
   2. Voer MATLAB uit en klik op het editortabblad om een editorpagina te openen om een code te schrijven die de spreadsheet cel voor cel leest.
   3. Wijzig het MATLAB-pad (het mappad dat toegang heeft tot het gewenste bestand) om toegang te krijgen tot de map met de te analyseren gegevens, bijvoorbeeld Gebruikers / Gebruikersnaam / Bureaublad / gegevens.
   4. Open op de MATLAB-editorpagina de spreadsheetgegevens met behulp van de aangepaste code. Bijvoorbeeld: a1= xlsread('data','run1','A4:A183'), waarbij a1 de identifier vertegenwoordigt, xlsread de MATLAB-functie die het .csv bestand leest (in dit geval als spreadsheet), data de bestandsnaam is, run1 de bladnaam en A4:A183 het bereik van gegevens is dat van belang is in cel A van de spreadsheetgegevens die moeten worden geanalyseerd. Voor een volledige pasvorm analyseer je x en y (respectievelijk tijd en spanning). Bijvoorbeeld:
      a1=xlsread('data','run1','A4:A183');
      b1=xlsread('data','run1','B4:B183');
      a1 = x (tijd) en b1 = y (spanning).
   5. Klik in MATLAB op Apps | Curve Fitter Aangepaste vergelijking. Wis de representatieve aangepaste vergelijking en voer de visco-elastische modelvergelijking [vergelijking (1)] in, waarbij ε de x-variabele vertegenwoordigt en t de y-variabele.
      (1)
      Hier vertegenwoordigt ε de spanning, σ de schuifspanning, η₁ de viscositeit vertegenwoordigt, E de elasticiteit vertegenwoordigt, t de tijd vertegenwoordigt en τ de ontspanningstijd vertegenwoordigt, die de maximale tijd karakteriseert die nodig is voor de cel om terug te keren naar zijn oorspronkelijke vorm na primaire vervorming. Het wordt uitgedrukt als τ = , waarbij η₂ de secundaire viscositeitsterm is voor de tweede dashpot (figuur 4).
   6. Wijs nieuwe variabelen opnieuw toe aan de visco-elastische parameters binnen de aangepaste vergelijkingsinterface. (ε, η₁, E, σ, t en τ = ) staat voor respectievelijk (x, a, b, K, y en c). Hier zijn x en y respectievelijk de onafhankelijke en afhankelijke variabelen. Schuifspanning (σ) kan worden bepaald met behulp van vergelijking (2):
      (2)
      Hier vertegenwoordigt μ de viscositeit van het afschuifvloeistofmedium, Q is het pompdebiet en b en h zijn de breedte en hoogte van het stroomkanaal weergegeven in respectievelijk figuur 1C.
   7. Klik op Gegevens selecteren om de tijd (a1) en spanning (b1) voor elke set gegevens te selecteren.
   8. Zorg ervoor dat het selectievakje Automatisch aanpassen is ingeschakeld. Hiermee wordt de fit automatisch uitgevoerd wanneer gegevens (x en y) zijn geselecteerd.
   9. Selecteer de montagemethoden om de randvoorwaarden aan te scherpen. Klik op Geavanceerde opties onder de categorie Methoden en selecteer Niet-lineaire kleinste kwadraten. Selecteer onder Robuust de optie Uit en onder Algoritme de optie Vertrouwensregio. Laat elke andere parameter zoals deze is.
   10. De nieuwe variabelen na het passen (a, b en c) vertegenwoordigen respectievelijk de visco-elastische eigenschappen, viscositeit, elasticiteit en relaxatietijd (η₁, E, EQUAT) van de cel (figuur 5).
   11. Zoek naar een hoge R-kwadraatwaarde van de pasvorm (R² > 80%) om ervoor te zorgen dat de gegevensuitvoer kan worden beschouwd als een echte pasvorm van het visco-elastische model (figuur 3)

Results

Het afschuiftestprotocol in combinatie met deformatieanalyse met behulp van DIC en een visco-elastisch model is succesvol in het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van een enkele cel in vitro. Deze methode is getest op menselijke en muizencellijnen, waaronder normale menselijke borstcellen (MCF-10A)^3,4,9, minder gemetastaseerde triple-negatieve borstkankercellen (MDA-MB-468)3, triple-negatieve borstkankercellen (MDA-MB-231)3, menselijke osteosarcoomcellen

Discussion

De shear assay-methode, die het opzetten van een pseudo-mechanobiologische omgeving omvat om de interactie van cellen met de omringende mechanische micro-omgeving en hun reacties op mechanische spanningen te simuleren, heeft een catalogus van cellulaire mechanische eigenschappen geproduceerd, waarvan de patronen geconserveerde fysieke atypie tonen onder kankerachtige cellijnen 3,4,5,7,8

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CEL CULTUUR
.25% Trypsin, 2,21 mM EDTA, 1x[-] natriumbicarbonaat	Corning	25-053-ci	Voor cellulaire loslating van substraat in celcultuur
15 mL Centrifugeerbuisjes	Falcon by Corning	05-527-90
35 mm Petri-schalen	Corning	430165
50 mL Centrifugeerbuisjes	Falcon by Corning	14-432-22
Centrifuge	elke		Voor steriele celcultuur
Dulbecco's Aanpassing van Eagle's Medium (DMEM) 1x	Corning	10-013-cv	Of enig ander medium voor het kweken van cellen. DMEM werd gebruikt voor het kweken van U87-cellen
Handschoenen	elke		Voor steriele celcultuur
Heracell Vios 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51033770	Voor incubatie tijdens celcultuur
Afzuigkap	elke		Voor steriele celcultuur
Micropipet	elke		Voor steriele celcultuur
Micropipet tips	elke		Voor steriele celcultuur
Microscoop	Leica/elke		Voor steriele celcultuur
Fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder calcium en magnesium PBS, 1x	Corning	21-040-CM
Pipetman	elke		Voor steriele celcultuur
Pipet tips	elke		Voor steriele celcultuur
Precision GP 10 vloeistof incubator	Thermo Scientific	TSGP02
T25 Kolf	Corning	430639
T75 Kolf	Corning	430641U
SCHEUR ASSAY
100 mL beker	elke		Voor het maken van DMEM + methylcellulose stroperige scheurmedia
DMEM	Corning
Flow kamer + rubberen afdichting	Glycotech	31-001	Circulaire flowkamer Kit (voor 35 mm weefsel kweek schotels)
Hybride Reometer	HR-2 Discovery Hybrid Reometer		Voor bepaling van scheurvloeistof viscositeit
Magneet roerlat	elke		Voor het maken van DMEM + methylcellulose stroperige scheurmedia
Magneet roerplaat	elke		Voor het maken van DMEM + methylcellulose stroperige scheurmedia
Methylcellulose	elke		Om de viscositeit van DMEM in stromingsmedia te verhogen
Spuitpomp	KD Scientific Geminin 88 plus	788088	Voor programmeren van vloeistof infusie en terugtrekking
Spuiten, slangen en connectoren			Voor instelling van scheurapparaat
SOFTWARE
ABAQUS software	Simulia
Digitaal beeldcorrelatie software	LaVision, Duitsland	DAVIS 10.1.2
Beeldverwerkingssoftware	Leica/elke microscoopsoftware
MATLAB	MATLAB	MATLAB_R2020B