Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Normothermische geïsoleerde leverperfusie bij varkens

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65336

⸱

9 juni 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Laboratory of Abdominal Transplantation, KU Leuven, 2Department of Abdominal Transplant Surgery and Coordination, University Hospitals Leuven

In dit artikel

Samenvatting

Het varkensmodel van normotherme machineperfusie (NMP) in de lever, dat hier wordt beschreven, kan met succes worden gebruikt om NMP te bestuderen als een conserveringsstrategie, een hulpmiddel voor levensvatbaarheidsbeoordeling en een platform voor orgaanherstel. Het heeft een hoge translationele waarde, maar het is technisch uitdagend en arbeidsintensief.

Samenvatting

Varkensmodellen van lever ex situ normotherme machineperfusie (NMP) worden steeds vaker gebruikt in transplantatieonderzoek. In tegenstelling tot knaagdieren staan varkenslevers anatomisch en fysiologisch dicht bij de mens, met een vergelijkbare orgaangrootte en galsamenstelling. NMP bewaart het levertransplantaat onder bijna fysiologische omstandigheden door een warm, zuurstofrijk en met voedingsstoffen verrijkt perfusaat op basis van rode bloedcellen door het levervaatstelsel te recirculeren. NMP kan worden gebruikt om ischemie-reperfusieschade te bestuderen, een lever ex situ te behouden vóór transplantatie, de functie van de lever te beoordelen voorafgaand aan implantatie en een platform te bieden voor orgaanherstel en regeneratie. Als alternatief kan NMP met een perfusaat op basis van volbloed worden gebruikt om transplantatie na te bootsen. Toch is dit model arbeidsintensief, technisch uitdagend en brengt het hoge financiële kosten met zich mee.

In dit NMP-model bij varkens gebruiken we warme ischemische beschadigde levers (overeenkomend met donatie na dood van de bloedsomloop). Eerst wordt algemene anesthesie met mechanische beademing gestart, gevolgd door de inductie van warme ischemie door de thoracale aorta gedurende 60 minuten vast te klemmen. Canules die in de abdominale aorta en poortader worden ingebracht, maken het mogelijk de lever weg te spoelen met een koudeconserveringsoplossing. Het uitgespoelde bloed wordt gewassen met een celbeschermer om geconcentreerde rode bloedcellen te verkrijgen. Na een hepatectomie worden canules ingebracht in de poortader, de leverslagader en de infrahepatische vena cava en aangesloten op een gesloten perfusiecircuit dat is geprimed met een plasmaexpander en rode bloedcellen. Een holle vezeloxygenator is opgenomen in het circuit en gekoppeld aan een warmtewisselaar om een pO2 van 70-100 mmHg bij 38 °C te behouden. NMP wordt bereikt door een continue stroom rechtstreeks door de slagader en via een veneus reservoir door de poortader. Stromen, drukken en bloedgaswaarden worden continu gecontroleerd. Om de leverbeschadiging te evalueren, worden perfusaat en weefsel bemonsterd op vooraf gedefinieerde tijdstippen; Gal wordt opgevangen via een canule in het gemeenschappelijke galkanaal.

Inleiding

Levertransplantatie is de enige definitieve behandeling voor leverfalen in het eindstadium; Het succes ervan wordt echter beperkt door een aanhoudende onbalans tussen patiënten op de wachtlijst en de beschikbaarheid van potentiële donororganen1. Om het donorbestand te vergroten, zijn de donorcriteria de afgelopen tien jaar geleidelijk uitgebreid, waaronder oudere donorleeftijd, leversteatose en donatie na overlijden van de bloedsomloop (DCD)2,3. Tijdens een DCD-procedure lijdt de lever steevast aan een periode van warme ischemie tussen het staken van de levensondersteunende therapie, de verklaring van overlijden en in situ koeling en conservering, waardoor ischemie-reperfusieschade (IRI) verergert4. Als gevolg hiervan worden DCD-levers geassocieerd met een verhoogde incidentie van vroege allotransplantaatdisfunctie en galcomplicaties 5,6.

Voor deze hoog-risico donorlevers biedt conventionele conservering met statische koude opslag onvoldoende bescherming tegen IRI. Tot nu toe hebben alternatieve conserveringsstrategieën zoals normotherme machineperfusie (NMP) aanzienlijk aan populariteit gewonnen. Tijdens normotherme machineperfusie wordt de lever ex situ aangesloten op een geïsoleerd circuit en bij lichaamstemperatuur geperfundeerd met een zuurstofrijk en met voedingsstoffen verrijkt perfusaat. Klinische onderzoeken suggereren dat NMP hepatocellulair letsel vermindert, zoals weerspiegeld door verminderde afgifte van piektransaminase en vroege disfunctie van transplantaten7. Er is echter weinig bekend over de biologie van levercellen tijdens NMP8.

Diermodellen zijn cruciaal geweest in de evolutie van levertransplantatie. In tegenstelling tot knaagdiermodellen wordt het varken beschouwd als een hogere translationele waarde, aangezien de varkenslever anatomisch en fysiologisch dicht bij de mens staat, met een vergelijkbare orgaangrootte en galsamenstelling. Desalniettemin zijn levertransplantatiemodellen bij varkens arbeidsintensief, moeilijk te standaardiseren en brengen ze aanzienlijk hogere financiële kosten met zich mee.

Varkenslever NMP kan voor verschillende doeleinden worden gebruikt. Het kan worden toegepast om transplantatie ex situ na te bootsen bij gebruik van een perfusaat op basis van volbloed, om een donorlever te bewaren in een beschermende omgeving met een leukocytenverarmd perfusaat op basis van rode bloedcellen, om potentiële biomarkers te beoordelen die de leverfunctie ex situ voorspellen voorafgaand aan transplantatie, of als een platform om regeneratieve therapie te onderzoeken 9,10,11.

De toepassing van NMP-modellen in de varkenslever is een uitdaging, terwijl chirurgische en perfusiegerelateerde technische aspecten nauwelijks worden beschreven. In ons onderzoekslaboratorium hebben we de NMP-opstelling toegepast die oorspronkelijk werd beschreven door Butler et al.12 om een 24-uurs ex situ geïsoleerd leverperfusiemodel bij varkens te ontwikkelen en te valideren dat kan worden gebruikt om zowel een levertransplantaat te bewaren voor transplantatie als om een transplantatie na te bootsen. Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol; Een methodologisch kader en mogelijke valkuilen worden elders gepubliceerd9.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd na goedkeuring van de dierenbeschermingscommissie van de KU Leuven en in overeenstemming met de Europese richtlijnen.

1. Informatie over dieren

OPMERKING: Voor dit onderzoeksprotocol worden mannelijke TOPIGS TN70-varkens van 3 maanden oud, met een lichaamsgewicht van ongeveer 30 kg en een levergewicht van 600-700 g gebruikt.

  1. Houd de dieren onder een dag/nachtritme van 12 uur in eengezinshokken met vrije toegang tot voedsel en kraanwater en visueel, olfactorisch en auditief contact tussen hen.
  2. Zorg ervoor dat de dieren ten minste 2 dagen voor de operatie arriveren om aan hun omgeving te wennen. Vast de varkens 12 uur voor de operatie met vrije toegang tot water.
    OPMERKING: Anesthesie wordt gehandhaafd met isofluraan en analgesie met fentanyl. Tijdens de anesthesie worden het elektrocardiogram, de pulsoximetrie, de capnografie en de bloeddruk continu gecontroleerd. De experimenten zijn terminaal; Varkens worden geëuthanaseerd door verbloeding terwijl de lever wordt verkregen onder voortdurende algemene anesthesie en analgesie.

2. Voorbereiding van de perfusie-opstelling

  1. Installatie van de wegwerpperfusiekit
    1. Fixeer het reservoir op een vaste hoogte die ongeveer 15 cm hoger is dan de leverrecipiënt.
    2. Sluit de pompkop aan op de daarvoor bestemde sleuf op de centrifugaalpomp. Sluit de zuurstofslang aan op de oxygenator. Sluit de in- en uitstroomslangen van de verwarming/koeler aan op de daarvoor bestemde sleuven op de oxygenator.
    3. Installeer een knijpklep op de uitstroomslang onder het reservoir. Installeer de tweede knijpklep op de instroomslang naar het reservoir na de Y-verbinding, waar de andere slang de leverslagader zal voeden.
      OPMERKING: De eerste knijpklep regelt de instroom in de poortader. Door de tweede knijpklep te sluiten, neemt de doorstroming toe, en dus ook de druk in de leverslagader.
    4. Installeer de debietsensor distaal vanaf de eerste knijpklep op de uitstroomslang van het reservoir. Installeer de tweede debietsensor op de toevoerslang naar de pompkop.
      NOTITIE: De eerste flowsensor meet de stroom naar de poortader. De tweede flowsensor meet de uitstroom uit de vena cava.
    5. Snijd de uitstroomslang van de oxygenator af en plaats het arteriële filter in de juiste richting.
      NOTITIE: Knip de slang af tot niet langer dan 2 cm na de oxygenator; als het te lang wordt bewaard, zal het knikken wanneer de slang zachter wordt wanneer het wordt geperfundeerd met een perfusaat van 37 °C. Als het nog steeds knikt, ondersteun dan het arteriële filter door het vast te binden aan de steun van het reservoir.
  2. Installatie van de lekrecirculatieslang
    1. De perfusiekit bevat twee buizen met een 3/16 uiteinde en een 1/16 uiteinde. Verbind de twee buizen met elkaar door het 1/16 uiteinde in het 3/16 uiteinde te steken. Sluit het 3/16 uiteinde aan op het reservoir.
    2. Installeer de slang in de rolpomp, rekening houdend met de draairichting. Stel de juiste slangdiameter in en stel de snelheid in op 15-18 omwentelingen per minuut (rpm). Plaats het 1/16 uiteinde in de leverrecipiënt en fixeer indien nodig.
  3. Continue kalibratie van inline bloedgasanalyse
    1. Schakel de gasanalysator in en selecteer Kalibreren.
    2. Controleer het juiste serienummer op de verpakking van de sensor en druk op OK.
    3. Haal de arteriële sensorhouder uit de cassette en sluit de sensor hierop aan met een blauwe dop aan de bovenkant en een wit filter aan de onderkant.
    4. Draai de witte dop onder het filter los en verwijder deze; Schroef het filter zelf niet los. Draai de blauwe ontluchtingsdop aan de bovenkant los, verwijder deze niet. Plaats de sensor en sensorhouder stevig in de kalibratiecassette.
    5. Start de kalibratie. Wanneer de kalibratie is voltooid, verwijdert u de sensor en sensorhouder uit de kalibratiecassette. Verwijder het witte filter aan de onderkant en draai de blauwe ontluchtingsdop aan de bovenkant vast.
    6. Plaats de sensor in de bemonsteringsleiding van de perfusiekit. Begin pas met gasanalyse als het perfusiecircuit is gevuld.
  4. Priming van het circuit
    1. Steek een infuuslijn in een zak van 500 ml plasma-expander en bevestig deze aan het reservoir. Plaats een buisklem op de uitstroomleiding van het reservoir en vul het reservoir met 300 ml plasma-expander.
    2. Verwijder de buisklem en laat de plasma-expander het circuit vullen
    3. Ontlucht de pompkop en oxygenator. Het circuit is nu geprimed. Schakel de verwarming/koeler in en stel deze in op 38 °C
  5. Bereiding van de infuuslijnen
    1. Zuig 5 ml (25.000 E) van een heparineoplossing van 5 E/ml op in een spuit van 50 ml. Zuig nog eens 25 ml 0,9% NaCl-oplossing op om een totaal volume van 30 ml heparineoplossing te verkrijgen (infusiesnelheid: 1 ml/uur).
    2. Los 5 g natriumtaurocholaat op in 50 ml 0,9% NaCl en trek het op in 450 ml 0,9% NaCl om een concentratie van 1% te bereiken. Een totaal volume van 168 ml is nodig (infusiesnelheid: 7 ml/uur).
    3. Zuig 2 ml (200 E) van een insulineoplossing van 100 E/ml op in een spuit van 50 ml. Zuig nog eens 28 ml 0,9% NaCl-oplossing op om een totaal volume van 30 ml insulineoplossing te verkrijgen (infusiesnelheid: 1 ml/uur).
    4. Trek 10 ml glycinebuffer (verdunningsmiddel) op en voeg dit toe aan de injectieflacon van 0,5 mg epoprostenol. Gebruik het microbiële filter dat in de epoprostenol-kit zit en zuig 5 ml op uit de injectieflacon met de met glycinebuffer gereconstitueerde epoprostenol in een spuit van 50 ml. Zuig nog eens 25 ml 0,9% NaCl-oplossing op om een totaal volume van 30 ml epoprostenoloplossing te verkrijgen (infusiesnelheid: 1 ml/uur).

3. Inductie van anesthesie

  1. Sedatie
    1. Maak een spuit met 2 mg/kg xylazine en 8 mg/kg Zoletil (4 mg/kg tiletamine en 4 mg/kg zolazepam), een spuit met 10 ml 0,9% NaCl, een driewegklep, een verlenglijn en een intramusculaire naald van 21 G.
    2. Plaats de naald in de bilspier, injecteer het mengsel van xylazine en tiletamine en spoel de verlenglijn met de 0,9% NaCl. Na 15 minuten wordt het varken verdoofd.
    3. Weeg het varken en transporteer het naar de operatiekamer.
  2. Anesthesie
    1. Zet de ventilator aan
    2. Plaats het varken in rugligging op de operatietafel en fixeer de ledematen.
    3. Pre-oxygeneer met een ventilatiemasker met 1,5 L Ø2, 1,5 L lucht en 1% isofluraan.
    4. Bevestig een verzadigingssonde aan de staart of het oor. Sluit de drie elektrocardiogramdraden aan voor continue bewaking.
    5. Breng een 22 G-katheter in een oorader in, sluit deze aan op een driewegklep en start een infuus van intraveneuze (IV) vloeistoffen (plasmalyt) met een snelheid van 400 ml/uur.
    6. Plaats een spuit van 60 ml met 50 μg/ml fentanyl in een automatische spuit. Geef een bolus van 1 ml en start een continue infusie met een snelheid van 0,16 ml/kg/uur.
    7. Verwijder het beademingsmasker en breng de laryngoscoop in, waarbij de epiglottis wordt opgetild. Steek een endotracheale tube in de luchtpijp en blaas de ballon op om luchtlekkage te voorkomen. Bevestig de buis met tape aan de snuit van het varken.
      NOTITIE: Sluit het isofluraan af wanneer u het ventilatiemasker verwijdert.
    8. Sluit de endotracheale tube aan op het beademingsapparaat.
      OPMERKING: Instellingen ventilator: 0,4 L ademvolume; 0,5 kPa gemiddelde luchtwegdruk; 2,5 kPa luchtwegdruk; 0,5 kPa positieve eindexpiratoire druk; Frequentie van 15/min; 4,7-5,3 kPa eindgetijde CO2.
    9. Sluit de capnograaf aan op de endotracheale tube.

4. Operatie

  1. Diep veneuze katheter en arteriële lijn
    1. Desinfecteer het operatieveld met betadine en plaats gordijnen aan beide zijden van de middellijn.
    2. Maak een 7 cm lange incisie vanaf de linkerkant van de bovenkant van het borstbeen lateraal tot aan de sternocleidomastoïde spier en plaats een orthostatisch oprolmechanisme.
    3. Ontleed het onderhuidse weefsel van de spier in laterale richting en identificeer de uitwendige halsader. Ontleed de ader en ligeer zijtakken indien aanwezig.
    4. Plaats twee 2/0 ligaturen rond de uitwendige halsader en bind de craniale ligatuur af.
    5. Snijd de ader caudaal open van de vastgebonden ligatuur en breng een 12 Franse veneuze katheter in.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de veneuze katheter wordt doorgespoeld met gehepariniseerde zoutoplossing voordat u deze inbrengt.
    6. Fixeer de katheter met de tweede ligatuur. Als de veneuze katheter in de oorader kwetsbaar of te klein is, schakel dan de IV-vloeistof- en fentanyllijnen over op de diep veneuze katheter. Gebruik het anders niet totdat er bloed is afgenomen bij de celbeschermer.
    7. Ontleed de mediale rand van de sternocleidomastoïde spier en vervang de orthostatische retractor die het vlak opent tussen de sternocleidomastoïde spier aan de laterale zijde en de luchtpijp aan de mediale zijde.
    8. Verwijder de thymus om de halsslagader bloot te leggen. Herhaal stap 4.1.4 voor de slagader.
    9. Breng de arteriële lijn in de halsslagader in caudale richting in en fixeer. Sluit de arteriële lijn aan op de lijn van de drukmonitor.
  2. Dissectie van de aorta en vena cava
    1. Voer een laparotomie op de middellijn uit van de xiphoid tot het schaambeen.
      OPMERKING: Bij mannelijke varkens, caudaal vanaf de penis, snijd 1 cm lateraal vanaf de middellijn in om beschadiging van de onderhuidse urethra te voorkomen.
    2. Transecteer de navelstreng. Plaats een buikoprolmechanisme. Trek de darmen lateraal en craniaal naar links om de aorta en vena cava zichtbaar te maken.
      OPMERKING: De darm van varkens is niet-geroteerd; Daarom is er geen mobilisatie van de dikke darm nodig om toegang te krijgen tot het retroperitoneum.
    3. Ontleed ongeveer 3 cm van de aorta net craniaal van de darmbeensplitsing vrij en plaats twee ligaturen rond de aorta.
      OPMERKING: Er is een groot lymfevat in de buurt van de aorta; Pas op dat u het niet beschadigt, omdat dit het operatieveld vertroebelt en dissectie bemoeilijkt.
    4. Ontleed de vena cava op dezelfde hoogte als de aorta en plaats twee ligaturen.
  3. Dissectie van het gastroduodenale ligament
    1. Begin de dissectie aan de laterale zijde van het gastroduodenale ligament, ontleed het gemeenschappelijke galkanaal en omcirkel met een vaatlus.
    2. Trek het galkanaal terug naar de mediale zijde, waardoor de poortader bloot komt te liggen. Verwijder een grote lymfeklier aan de laterale zijde van de poortader
    3. Maak de poortader naar de alvleesklier vrij; Er is vaak een tak van de maag en alvleesklier die moeten worden afgebonden en doorgesneden. Omcirkel de poortader met een vaatlus aan de zijkant van de lever en een ligatuur aan de zijkant van de alvleesklier. Trek de poortader zijdelings in en zorg ervoor dat deze niet wordt afgesloten.
    4. Identificeer de gemeenschappelijke leverslagader en omcirkel deze met een vaatlus.
  4. Thoracale aortadissectie
    1. Trek aan de caudale lever en open het centrale peesgedeelte van het middenrif ventraal vanuit de suprahepatische vena cava. Trek de slokdarm terug naar de rechterkant, waardoor de thoracale aorta bloot komt te liggen.
    2. Ontleed vrij van het omringende weefsel en pas op dat u de azygos-ader niet beschadigt.
      OPMERKING: Het is niet nodig om de thoracale aorta te omcirkelen; De dissectie moet voldoende worden verlengd om een vaatklem te plaatsen.
  5. Voorbereiding van de cell saver
    1. Hang het reservoir in de zwarte ring, verwijder de dop van de enkele poot van de adapter en bevestig de slang aan de 3/8 inch uitlaatpoort aan de onderkant van het bloedafnamereservoir.
    2. Verwijder de dop van de zuig-/antistollingsbuis en sluit deze aan op een van de 1/4 inch bloedinlaatpoorten aan de bovenrand van het bloedafnamereservoir.
    3. Plaats de kom van de wasset door te draaien; Zorg ervoor dat er een klik te horen is.
    4. Plaats de slang in de rolpomp en de buisverdeler.
    5. Hang een citraatfosfaat dextrose adenine (CPDA)-1 bloedafnamezak aan de paal en zorg ervoor dat de verbinding goed vastzit.
      OPMERKING: CPDA-1 samenstelling van de bloedzak (63 ml): 2,99 g/l watervrij citroenzuur; 26,3 g/L dyhidrous natriumcitraat; 2,22 g/L monohysraat natriumfosfaat; 31,9 g/L dextrose monohydraat; 0,275 g/L adenine.
    6. Hang de afvalzak aan de zijkant van de machine (zorg ervoor dat deze goed gesloten is) en sluit deze aan op de wasset (gele dop).
    7. Sluit beide Y-vormige buisjes (witte doppen) aan op een zakje van 3 L 0,9% NaCl.
    8. Bevestig het slangetje met de blauwe dop aan het adapterslangetje op de bodem van het bloedafnamereservoir. Schakel het autotransfusiesysteem in.
  6. Cannulatie van de aorta en vena cava
    1. Dien 500 IE/kg heparine toe en laat het 2 minuten circuleren. Bind de caudale ligatuur rond de aorta en breng een canule van 20 French in de aorta en fixeer. Dezelfde procedure wordt herhaald voor de vena cava.
  7. Om een DCD-procedure na te bootsen, wordt warme ischemie geïnduceerd door de thoracale aorta gedurende een bepaalde periode, in dit geval 60 minuten, af te klemmen.
    OPMERKING: Tijdens warme ischemie worden de cavale en halsdrainage geopend en wordt begonnen met het afnemen van bloed naar de celbeschermer. Dit resulteert in verbloeding van het varken.
  8. De lever spoelen
    1. Start aan het einde van warme ischemie een koude spoeling met 2 l ijskoude (4-6 °C) conserveringsoplossing door de aortacanule en koel de buik af met een plaatselijke toepassing van smeltend ijs.
      OPMERKING: Tijdens de cold flush wordt al het resterende bloed weggespoeld en verzameld naar de cell saver.
    2. Wanneer de eerste 2 L is doorgespoeld, verwijdert u de canule uit de aorta, bindt u de ligatuur vast aan de poortader en cannuleert u de poortader. Bevestig het vervolgens met de vaatlus.
    3. Spoel de lever via de poortader met nog eens 2 L ijskoude (4-6°C) conserveringsoplossing.
  9. Hepatectomie
    1. Verwijder het ijs uit de buik. Transecteer het galkanaal dicht bij de alvleesklier.
    2. Verwijder de portaalcanule en verdeel de poortader. Trek de darmen naar links terug om de infrahepatische vena cava bloot te leggen.
    3. Ontleed de vena cava vrij van het retroperitoneum en scheid alleen de craniale van de nieraders. Ontleed de gemeenschappelijke leverslagader tot aan de coeliakie en de oorsprong van de aorta.
      OPMERKING: Het snijden van de juiste diafragmatische crus kan de belichting verbeteren.
    4. Verdeel de gastroduodenale slagader en snijd de coeliakie weg met een stukje van de aorta. Transecteer het kleine omentum dicht bij de maag craniaal tot aan de slokdarm
    5. Mobiliseer de linker lever door het linker driehoekige ligament door te snijden. Snijd het middenrif aan de linkerkant van de vena cava af.
    6. Mobiliseer de rechterlever door het rechtermiddenrif van ventrale naar dorsale te verkleinen, eindigend net caudaal vanaf de infrahepatische vena cava-transsectie.
    7. Snijd de suprahepatische vena cava door en knip alle resterende aanhechtingen door. De lever is nu vrij; Verwijder het en plaats het in een kom met ijswater.
  10. Achtertafel procedure
    1. Weeg de lever. Cannuleer de poortader met een 25 Franse canule en zet deze vast met ligaturen. Canuleer de leverslagader met een 14 Franse versterkte canule en fixeer met ligaturen.
    2. Kanuleer de infrahepatische vena cava en plaats de punt van de canule op het niveau waar de leveraders in de vena cava weglopen. Fixeer met ligaturen.
    3. Doe een taskoord rond de rand van het middenrif om bloedingen uit de aderen van het middenrif te voorkomen en bind de suprahepatische vena cava af.
    4. Ontlucht de portaalcanule en spoel de poortader met 250 ml koude plasma-expander. Controleer op eventuele lekken.
      OPMERKING: Controleer of er voldoende uitstroom is door de cavale canule.
    5. Plaats na de portaalspoeling een slangklem op de portaalcanule en zorg ervoor dat er geen lucht in de canule en de poortader komt.
    6. Ontlucht de arteriële canule en spoel 250 ml koude plasmaexpander door de leverslagader. Controleer op lekken en knip eventuele zijtakken af. Plaats een slangklem op de arteriële en cavale canule.

5. Normothermische machineperfusie

  1. Perfusaat
    1. Voeg tijdens de voorbereiding van de achtertafel de door de celbesparing geproduceerde, gewassen rode bloedcellen toe aan het circuit om de gewenste hematocriet van 30% te verkrijgen. Start de pomp om de rode bloedcellen te mengen met de plasma-expander. Start de continue gasanalysator.
      OPMERKING: De formule voor het volume van rode bloedcellen om het gewenste hematocriet te verkrijgen: (levergewicht + priming-volume) x gewenst hematocriet/hematocriet na het wassen. De continue gasanalysator geeft ook feedback over de perfusietemperatuur, die normaal gesproken overeenkomt met de instelling van de kachel op 38 °C.
    2. Voeg 10 ml 10% calciumgluconaat, 2 ml heparine (10.000 IE) en 750 mg cefuroxim in 10 ml 0,9% NaCl toe aan het perfusaat. Stel de handmatige gasblender in op 0,5 l/min FiO2 van 21%.
  2. Initiatie van perfusie
    1. Schakel de druksensoren, debietsensoren en rolpomp in voor lekrecirculatie.
    2. Plaats de lever in de recipiënt. Plaats de buisklemmen op het portaal en de arteriële instroombuis en de cavale uitstroombuis van het circuit en knip de Y-connector uit.
    3. Sluit de canules aan op hun respectievelijke in- en uitstroomslangen met daartussen een T-verbindingsstuk. Voorkom dat er lucht in het circuit komt.
    4. Installeer driewegkranen op de T-verbindingsstukken en sluit er drukleidingen op aan. Druk op de leidingen en start met continue drukbewaking.
    5. Stel de knijpkleppen in en sluit ze bijna volledig, om suprafysiologische stromen en endotheliale stress te voorkomen.
    6. Start de perfusie door de slangklemmen uit de portaalinstroom te verwijderen. Direct nadat de portaalinstroom is gestart, verwijdert u de klemmen van de cavale uitstroom en start u de pomp. Het pomptoerental is drukgeregeld, dus streef naar een druk in de cavale uitstroom tussen -5 mmHg en -2 mmHg. Streef naar een portale stroom van 0,75 ml/min/g lever.
    7. Wanneer de portale perfusie stabiel is en de cavale druk voldoende is, verwijdert u de klemmen uit de arteriële buis. Streef naar een druk van ongeveer 55-60 mmHg en een debiet van ongeveer 0,25 ml/min/g lever.
  3. Behoud van stabiele perfusiehemodynamica
    1. Bedek de lever met een glazen koepel of plasticfolie om warmteverlies van het oppervlak te voorkomen.
    2. Als de portaalstroom te hoog is, sluit u de knijpklep op de portaalinstroomslang.
    3. Als de cavale druk te negatief wordt, neemt het risico op het ontstaan van een vacuüm in de vena cava toe. Te hoge onderdruk kan worden tegengegaan door de pompsnelheid te vertragen. Als alternatief vermindert het verhogen van de instroom door de poortader de negatieve uitstroomdruk door meer volume aan de vena cava te geven.
    4. Als de arteriële druk te laag is, kan deze worden verhoogd door de pompsnelheid te verhogen of door de knijpklep in de richting van het portaalreservoir te sluiten om meer stroom door de arteriële instroomslang te duwen.
  4. Monsterneming
    1. Verkrijg de perfusaatmonsters uit de cavale uitstroomklep of een aangewezen bemonsteringsleiding tussen de oxygenator en het portaalreservoir.
    2. Verkrijg naaldbiopten tijdens de perfusie. Naaldgaten moeten worden gehecht omdat er geen coagulatie optreedt als gevolg van de heparinisatie van het circuit.
    3. Verzamel gal door een canule van 8 French in het galkanaal te fixeren. Zorg ervoor dat u het cystische kanaal ligateert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gepresenteerde perfusieprotocol maakt gebruik van de zelfregulatie van de bloedstroom van de lever om stabiele hemodynamische omstandigheden tot 24 uur te bereiken en de fysiologische verdeling van de bloedstroom in de poortader en de leverslagader te simuleren. Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van het perfusiecircuit. Figuur 2A toont een consistente verdeling van de bloedstroom, waarbij de poortader en de leverslaga...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier hebben we onze ervaring met NMP van varkenslever in detail beschreven. De voordelen van deze techniek zijn onder meer een hoge translationele waarde en veelzijdigheid. NMP van varkenslever kan worden toegepast om deze verbeterde conserveringstechniek te onderzoeken en beter te begrijpen, of om transplantatie na te bootsen. Deze opstelling maakt handmatige controle over elk aspect van de perfusie mogelijk, waardoor zowel de portale als de arteriële druk en stroming op verschillende m...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs danken alle onderzoeksstudenten van de faculteit geneeskunde van de KU Leuven die betrokken zijn bij deze experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alaris GH Plus spuitpompBD Care Fusion80023 UN 01-G
AnesthesieapparaatDräägerTitus
Arteriele katheter Cavafix CertoBraun, Melsungen, DuitslandBRAU4152557
BloedgasanalysatorRadiometerABL815
Calciumgluconaat 10%Braun, Melsungen, Duitsland570/13596667/1214
CapnograafDräägerScio
CelbesparingsapparaatMedtronicAutoLog
Centrifugaalpomp BiomedicusMedtronic85315 REV 3.0
Centrifuge Rotina 420R HettichVWR521-1156
Op maat gemaakte perfusiecircuitMedtronicM323901C
Wegwaarpset celbesparingsapparaatMedtronicATLS24
DLP Single stage veneuze canule, recht 20FMedtronic66120
EpoprostenolGlaxoSmithKline Belgium, Wavre, BelgiëFlolan
Fentanyl-Janssen 0,05 mg/mLJanssenHK-08700
Flowsensor BioPro TTEm-Tec12271
Formaldehyde 4%VWRVWRK4078.9005
Diepvrieskast -80 °CNew Brunswick ScientificU570-86
KoelkastLiebherrCUP 3513
GeloplasmaFresenius-Kabi, Bad Homburg, Duitslandfreeflex
VerwarmingskoelerStöckert-Shiley, Sorin group16-02-1950
Heparine 5000 IE/mLLeo Pharma, Ballerup, DenemarkenHeparinLeo
Hepatische arterie canuleMedtronicBIO-MEDICUS 12F
IGL-1 orgaanbewaaroplossingInstitut Georges LopezIGL-1/1000/D
In-line bloedgasanalysatorTERUMOCalibrator 3MCDI 540/CDI 500
Insulin 200 IU ActrapidNovo Nordisk, Dagsvaerd, DenemarkenMEDI-00018
Isofluran 1000 mg/g InhalatiedampChanelle PharmaIso-Vet
IV katheter BD Insyte-W 20 GBD381334
Vloeibaar stikstoftankKGW IsothermS22
Mersilene 250CM M3 USP2/0 niet-genaaide ligapakJNJ medicalF4503
Mersilene 250CM M3.5 USP0 niet-genaaide ligapakJNJ medicalF4504
Mersilene 5X70CM M3.5 USP0 niet-genaaidJNJ medicalEH6935H
Mersilene 6X45CM M3 USP2/0 niet-genaaidJNJ medicalEH6734H
Micro pipetten 1000 µLSocorex82,51,000
BewakingSiemensSC 8000
Plasmalyte ViafloBaxterPlasmalyte Viaflo
Poortveneuze canuleCALMED LABS18F RV-40018
DruksensorStöckert-Shiley, Sorin group22-06-2000
DrukregelaarMedtronicBM 9505-2
Prolene 4-0JNJ medicalEH7151H
RollerpompCobe Century USA468048-000 REV C
Natriumbicarbonaat 8,4%Braun, Melsungen, Duitsland362 2339
NatriumtaurocholaatSigma Aldrich, Burlington, VS86339
Chirurgisch scalpel nr 24Swann Morton0211
Veneuze canule, 3-lumen; 12FRARROWAK-12123-F
Vicryl Vio 250CM M2 USP3/0 niet-genaaide gigapakJNJ medicalV1205G
Xylazin 2%VMD Livestock pharmaXYL-M 2%
Zinacef Cefuroxim 750 mgGlaxoSmithKline Belgium, Wavre, BelgiëNDC 0173-0353-32
Zoletil 100VirbacZoletil 100

Referenties

  1. Dunson, J. R., Bakhtiyar, S. S., Joshi, M., Goss, J. A., Rana, A. Intent-to-treat survival in liver transplantation has not improved in 3 decades due to donor shortage relative to waitlist growth. Clinical Transplantation. 35 (10), e14433(2021).
  2. Monbaliu, D., Pirenne, J., Talbot, D. Liver transplantation using donation after cardiac death donors. Journal of Hepatology. 56 (2), 474-485 (2012).
  3. Croome, K. P., Taner, C. B. The changing landscapes in DCD liver transplantation. Current Transplantation Reports. 7 (3), 194-204 (2020).
  4. Coffey, J. C., et al. The influence of functional warm ischemia time on DCD liver transplant recipients' outcomes. Clinical Transplantation. 31 (10), (2017).
  5. Meurisse, N., et al. Outcomes of liver transplantations using donations after circulatory death: A single-center experience. Transplantation Proceedings. 44 (9), 2868-2873 (2012).
  6. Ruck, J. M., et al. Temporal trends in utilization and outcomes of DCD livers in the United States. Transplantation. 106 (3), 543-551 (2022).
  7. Nasralla, D., et al. A randomized trial of normothermic preservation in liver transplantation. Nature. 557 (7703), 50-56 (2018).
  8. Blondeel, J., Monbaliu, D., Gilbo, N. Dynamic liver preservation: Are we still missing pieces of the puzzle. Artificial Organs. 47 (2), 248-259 (2022).
  9. Gilbo, N., et al. Porcine liver normothermic machine perfusion: Methodological framework and potential pitfalls. Transplantation Direct. 8 (1), e1276(2021).
  10. Maione, F., et al. Porcine isolated liver perfusion for the study of ischemia reperfusion injury: A systematic review. Transplantation. 102 (7), 1039-1049 (2018).
  11. Gilbo, N., et al. Coagulation factors accumulate during normothermic liver machine perfusion regardless of donor type and severity of ischemic injury. Transplantation. 106 (3), 510-518 (2021).
  12. Butler, A. J., et al. Successful extracorporeal porcine liver perfusion for 72 hr. Transplantation. 73 (8), 1212-1218 (2002).
  13. Eshmuminov, D., et al. An integrated perfusion machine preserves injured human livers for 1 week. Nature Biotechnology. 38 (2), 189-198 (2020).
  14. Xu, J., Buchwald, J. E., Martins, P. N. Review of current machine perfusion therapeutics for organ preservation. Transplantation. 104 (9), 1792-1803 (2020).
  15. Martins, P. N., Turco, S. D., Gilbo, N. Organ therapeutics during ex-situ dynamic preservation. a look into the future. European Journal of Transplantation. 1, 63-78 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Normothermische machineperfusievarkensleverperfusielevertransplantatiemodelischemie reperfusieschadeex situ leverbewaringhepatische bloedstroomsamenstelling van het perfusaatgalgangcannulatievasculaire weerstandregeneratieve therapie
Normothermische geïsoleerde leverperfusie bij varkens
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.