Methodenartikel

Detectie van mitofagie in Caenorhabditis elegans en zoogdiercellen met behulp van organel-specifieke kleurstoffen

DOI:

10.3791/65337

⸱

19 mei 2023

 , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, Institute for Medical Research, Israel-Canada (IMRIC), The Hebrew University of Jerusalem

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het verkennen van mitofagie door middel van elektronenmicroscopie, genetische sensoren en immunofluorescentie vereist dure apparatuur, geschoold personeel en een aanzienlijke tijdsinvestering. Hier demonstreren we de werkzaamheid van een commerciële fluorescentiekleurstofkit bij het kwantificeren van het mitofagieproces in zowel Caenorhabditis elegans als een leverkankercellijn.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn essentieel voor verschillende biologische functies, waaronder energieproductie, lipidenmetabolisme, calciumhomeostase, heembiosynthese, gereguleerde celdood en de generatie van reactieve zuurstofsoorten (ROS). ROS zijn van vitaal belang voor belangrijke biologische processen. Wanneer ze echter niet onder controle zijn, kunnen ze leiden tot oxidatieve schade, waaronder mitochondriale schade. Beschadigde mitochondriën geven meer ROS af, waardoor cellulair letsel en de ziektetoestand worden geïntensiveerd. Een homeostatisch proces genaamd mitochondriale autofagie (mitofagie) verwijdert selectief beschadigde mitochondriën, die vervolgens worden vervangen door nieuwe. Er zijn meerdere mitofagieroutes, met als gemeenschappelijk eindpunt de afbraak van de beschadigde mitochondriën in lysosomen.

Verschillende methodologieën, waaronder genetische sensoren, antilichaamimmunofluorescentie en elektronenmicroscopie, gebruiken dit eindpunt om mitofagie te kwantificeren. Elke methode voor het onderzoeken van mitofagie heeft zijn voordelen, zoals specifieke weefsel/cel targeting (met genetische sensoren) en detail (met elektronenmicroscopie). Deze methoden vereisen echter vaak dure middelen, getraind personeel en een lange voorbereidingstijd voor het eigenlijke experiment, zoals voor het maken van transgene dieren. Hier presenteren we een kosteneffectief alternatief voor het meten van mitofagie met behulp van in de handel verkrijgbare fluorescerende kleurstoffen gericht op mitochondriën en lysosomen. Deze methode meet effectief mitofagie in de nematode Caenorhabditis elegans en menselijke levercellen, wat de potentiële efficiëntie in andere modelsystemen aangeeft.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn essentieel voor alle aerobe dieren, inclusief mensen. Ze zetten de chemische energie van biomoleculen om in adenosinetrifosfaat (ATP) via oxidatieve fosforylering1, synthetiseren heem2, breken vetzuren af door β oxidatie3, reguleren calcium4 en ijzer5 homeostase, controleren celdood door apoptose6 en genereren reactieve zuurstofsoorten (ROS), die een vitale rol spelen bij redoxhomeostase7. Twee complementaire en tegengestelde processen handhaven de integriteit en de juiste functie van de mitochondriën: de synthese van nieuwe mitochondriale componenten (biogenese) en de selectieve verwijdering van beschadigde componenten door mitochondriale autofagie (d.w.z. mitofagie)8.

Verschillende mitofagieroutes worden gemedieerd door enzymen, zoals PINK1 / Parkin, en receptoren, waaronder FUNDC1, FKBP8 en BNIP/ NIX 9,10. Met name de selectieve afbraak van mitochondriale componenten kan onafhankelijk van de autofagosoommachinerie plaatsvinden (d.w.z. door mitochondriale blaasjes)11. De eindpunten van de verschillende selectieve mitofagieroutes zijn echter vergelijkbaar (d.w.z. mitochondriale afbraak door lysosomale enzymen)12,13. Om deze reden zijn verschillende methoden voor het identificeren en meten van mitofagie afhankelijk van de colokalisatie van mitochondriale en lysosomale markers 14,15,16,17 en verlaagde niveaus van mitochondriale eiwitten / mitochondriaal DNA 18.

Hieronder volgt een beknopte beschrijving van de bestaande experimentele methoden voor het meten van mitofagie in dierlijke cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie, met de nadruk op de mitofagie eindpuntfase.

Mitofagie biosensoren
Mitochondriale afbraak vindt plaats in de zure omgeving van het lysosoom19. Daarom ervaren mitochondriale componenten, waaronder eiwitten, een verschuiving van een neutrale naar een zure pH op het eindpunt van het mitofagieproces. Dit patroon ondersteunt het werkingsmechanisme van verschillende mitofagie biosensoren, waaronder mito-Rosella18 en tandem mCherry-GFP-FIS114. Deze sensoren bevatten een pH-gevoelig groen fluorescentie-eiwit (GFP) en een pH-ongevoelig rood fluorescentie-eiwit (RFP). Daarom daalt op het eindpunt van mitofagie de groen-rode fluorescentieverhouding aanzienlijk als gevolg van het blussen van de GFP-fluorofoor. De belangrijkste beperkingen van deze sensoren zijn (1) mogelijke Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen de fluoroforen; (2) de differentiële rijpingssnelheid van GFP en RFP; (3) dissociatie tussen de GFP en RFP als gevolg van proteolytische splitsing van het polypeptide dat hen verbindt; (4) overlapping tussen fluorescentie en emissie; en (5) differentiële fluorofoorhelderheid en blussing15,16.

Een sensor die een aantal van deze beperkingen overwint is de Keima mitochondriale sensor17. De mt-Keima-sensor (afgeleid van het koraaleiwit Keima) geeft een enkele emissiepiek (620 nm) weer. De excitatiepieken zijn echter pH-gevoelig. Als gevolg hiervan is er een overgang van een groene excitatie (440 nm) naar een rode (586 nm) bij het verschuiven van een hoge pH naar een zure pH16,17. Een recentere mitofagiesensor, Mito-SRAI, heeft het veld vooruit geholpen door metingen in vaste biologische monsters mogelijk te maken20. Ondanks de vele voordelen van genetische sensoren, zoals het vermogen om ze tot expressie te brengen in specifieke weefsels / cellen en ze te richten op verschillende mitochondriale compartimenten, hebben ze echter ook beperkingen. Een beperking is dat de genetische sensoren tot expressie moeten komen in cellen of dieren, wat tijdrovend en arbeidsintensief kan zijn.

Bovendien kan de expressie van de sensoren in mitochondriën zelf de mitochondriale functie beïnvloeden. Bijvoorbeeld, het tot expressie brengen van mitochondriale GFP (mtGFP) in de C. elegans worm lichaamswandspieren breidt het mitochondriale netwerk uit21. Dit fenotype is afhankelijk van de functie van de stress-geactiveerde transcriptiefactor ATFS-1, die een essentiële rol speelt bij de activering van ongevouwen eiwitrespons in mitochondriën (UPRmt)21. Daarom, hoewel genetisch gecodeerde mitochondriën / mitofagie biosensoren uiterst nuttig zijn voor het monitoren van mitochondriale homeostase in vivo, kunnen ze het proces beïnvloeden waarvoor ze zijn ontworpen om te meten.

Mitochondriën/lysosoom-specifieke antilichamen en kleurstoffen
Een andere strategie voor het testen van mitochondriale / lysosoom colocalisatie is het gebruik van antilichamen tegen mitochondriale / lysosomale eiwitten, zoals het mitochondriale buitenmembraaneiwit TOM20 en lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 1 (LAMP1) 22. In de meeste gevallen worden secundaire antilichamen die geconjugeerd zijn aan een fluorofoor gebruikt om het fluorescentiesignaal via microscopie te detecteren. Een andere strategie is om genetische constructen te combineren met mitochondriale/lysosomale kleurstoffen, zoals het tot expressie brengen van een LAMP1::GFP-fusieconstruct in cellen terwijl ze worden gekleurd met een rode mitochondriale kleurstof (bijv. Mitotracker Red)16. Deze methodologieën, hoewel effectief, vereisen specifieke antilichamen en omvatten vaak het werken met vaste monsters of het genereren van cellen / transgene dieren die fluorescerend gelabelde mitochondriën / lysosomen tot expressie brengen.

Hier schetsen we het gebruik van een commerciële lysosoom / mitochondriën / nucleaire kleuringskit voor het beoordelen van de mitofagie-activerende eigenschappen van synthetische diamine O, O (octaan-1,8-diyl) bis (hydroxylamine), hierna VL-85023 genoemd, in C. elegans-wormen en de menselijke kankercellijn Hep-3B (figuur 1). De kleuringskit bevat een mengsel van lysosomale / mitochondriale / nucleair gerichte kleurstoffen die specifiek deze organellen kleuren23. We hebben deze kit eerder gebruikt om de mitofagie-activiteit van 1,8 diaminooctaan (hierna VL-004 genoemd) in C. elegans23 aan te tonen. Belangrijk is dat we de resultaten van de kleuringskit hebben gevalideerd met de mito-Rosella biosensor en qPCR-metingen van het mitochondriale: nucleaire DNA-gehalte23. Deze beitskit biedt de volgende voordelen. Ten eerste is het niet nodig om transgene dieren of cellen te genereren die een mitochondriale biosensor tot expressie brengen. Daarom kunnen we ongewijzigde wilde dieren of cellen bestuderen en zo veel tijd, geld en arbeid besparen. Bovendien, zoals vermeld, kan het tot expressie brengen van mitochondriale biosensoren de mitochondriale functie veranderen. Ten tweede is de kit kosteneffectief, gemakkelijk te gebruiken en snel. Ten derde, hoewel we de methode demonstreren in C. elegans en menselijke cellen, kan deze worden aangepast voor andere celtypen en organismen.

Dat gezegd hebbende, zoals elke methode, heeft het protocol van de kleuringskit nadelen. De incubatie van de wormen met het reagens wordt bijvoorbeeld uitgevoerd in afwezigheid van voedsel (we hebben gezien dat zelfs dode bacteriën de kleuringsefficiëntie aanzienlijk verminderen). Hoewel de incubatietijd relatief kort is, is het mogelijk dat zelfs in dit tijdsbestek homeostatische reacties kunnen worden veranderd, waaronder mitofagie. Bovendien kan de binding van de kleurstoffen aan de ER/mitochondriale/nucleaire eiwitten en andere biomoleculen de activiteiten van deze organellen beïnvloeden. Bovendien werken we, in tegenstelling tot mitofagiemeting met genetische sensoren, met wormen en cellen die chemische fixatie hebben ondergaan. Daarom is het onmogelijk om dezelfde wormen/cellen op verschillende tijdstippen te blijven monitoren. Daarom raden we aan om verschillende methodologieën te combineren om de functie van mitofagie in een bepaald fysiologisch proces te valideren. Hieronder presenteren we nieuwe gegevens die aantonen dat VL-850 robuuste mitofagie induceert in C. elegans-wormen en Hep-3B-cellen. Daarom ondersteunen deze gegevens verder de hypothese dat VL-850 de levensduur van C. elegans verlengt en C. elegans beschermt tegen oxidatieve schade door de inductie van gezonde mitofagie . We hebben het proton ionofoorcarbonylcyanide 4-(trifluoromethoxy)fenylhydrazone (FCCP), een krachtige mitofagie inductor24, gebruikt als een positieve controle.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Voor het gemak van de lezers hebben we het protocol in twee delen verdeeld: één richt zich op het protocol voor het meten van mitofagie in C. elegans en de andere richt zich op het protocol voor het meten van mitofagie in levercellen. De lijst met materialen is te vinden in de bijgeleverde materiaaltabel .

1. Het C. elegans-protocol

  1. Voorbereiding van de nematode groeimedium (NGM) platen en Escherichia coli OP50 bacteriële voorraad
    OPMERKING: Ter verduidelijking, terwijl we standaardprotocollen volgden voor de bereiding van de NGM-platen en OP50-bacterievoorraad25,26, erkennen we dat er variaties in deze protocollen kunnen zijn tussen verschillende laboratoria. Daarom hebben we de volledige protocollen opgenomen om een nauwkeurige replicatie van het experiment te garanderen.
    1. Maak een kaliumfosfaatbuffer van 1 M, pH 6, door ~150 ml 1 M K 2 HPO 4 toe te voegenaan 500 ml 1 M KH2PO4-oplossing totdat pH 6 is bereikt. Steriliseer de buffer door deze door een vacuümfilter/opslagsysteem van 0,22 μm te leiden.
    2. Maak 0,1 M calciumchloride (CaCl 2) en magnesiumsulfaat (MgSO4) en steriliseer ze met een spuitfilter van0,2 μm.
    3. Bereid 5 mg / ml cholesterol in absolute ethanol.
      OPMERKING: Aangezien het cholesterol wordt bereid in ethanol, moet u het niet filteren.
    4. Bereid NGM-agar door 1,5 g natriumchloride (NaCl), 1,25 g pepton en 8,5 g agar op te lossen in 500 ml dubbel gedestilleerd water (DDW). Autoclaaf en laat afkoelen tot ~55 °C.
    5. Voeg onder steriele omstandigheden 12,5 ml kaliumfosfaatbuffer (pH 6), 0,5 ml 0,1 M CaCl2, 0,5 ml 0,1 M MgSO4 en 1 ml 5 mg / ml cholesterol toe. Meng goed na elke toevoeging.
    6. Voeg 4 ml van de gesmolten NGM-agar toe aan elke plaat van 35 mm. Laat de gerechten een nacht stollen bij kamertemperatuur (RT, ~21 °C).
    7. Om Luria-Bertani (LB) agarplaten te maken, lost u 5 g NaCl, 5 g trypton, 2,5 g gistextract en 7,5 g agar op in 400 ml gedestilleerd, gedeïoniseerd water (DDW), stelt u de pH van de oplossing in op 7,0, brengt u het volume op 500 ml met DDW en autoclaaf. Zodra de oplossing is afgekoeld tot 55 °C, giet u 25 ml van het mengsel in elke petrischaal van 90 mm en laat u de platen 2 dagen drogen bij kamertemperatuur. Streep vervolgens OP50-bacteriën uit de gedroogde LB-platen uit de glycerolvoorraad en incuber 's nachts bij 37 ° C om enkele kolonies te verkrijgen.
    8. Bereid 2x gist trypton (YT) door 8 g trypton, 5 g gistextract en 2,5 g natriumchloride (NaCl) op te lossen in 0,5 l DDW. Stel de pH in op 7 en autoclaaf.
    9. Ent bij afkoeling een OP50-bacteriekolonie uit de vers gestreepte LB-plaat in 50 ml 2x YT-medium in een Erlenmeyer van 250 ml. Schud bij 37 °C en 250 tpm tot een optische dichtheid (OD600) van ongeveer 0,6.
  2. Voorbereiding van het voertuig en experimentele platen
    1. Voeg 100 μL OP50-bacteriën toe aan het midden van elke 35 mm NGM-agarplaat. Droog een nacht bij RT (kamertemperatuur, 21 °C).
    2. Bereid 0,5 M VL-850 in DMSO en verdun tot 10 mM VL-850 met behulp van M9-buffer (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7 en1 mM MgSO 4)26. Controleer of de pH 7,0 is (zo niet, titreer dan met 0,1 M HCl) en filter de oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm. Bereid het voertuig voor zoals hierboven beschreven, maar zonder het medicijn (in dit geval VL-850). Maak 50 mM FCCP in DMSO, verdun tot 1 mM FCCP met M9-buffer en filter de oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm.
    3. Voeg 25 μL medium (negatieve controle), FCCP (positieve controle; 5 μM) of VL-850 (experimentele behandeling; 62,5 μM) toe aan afzonderlijk gezaaide NGM-platen op het bacteriële gazon.
    4. Bedek de platen met aluminiumfolie en laat ze drogen bij RT (kamertemperatuur, 21 °C). Gebruik de platen na ~16 uur.
  3. Het verkrijgen van gesynchroniseerde jongvolwassen C. elegans hermafrodieten
    1. Maak 1 L M9-buffer met 22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO4 en 86 mM NaCl. Steriliseer door autoclaveren en laat het afkoelen. Voeg na afkoeling 1 ml 1 ml 1 mM MgSO4 toe (0,22 μm filtergesteriliseerd).
    2. Meng 0,8 ml 2,5 N natriumhydroxide en 1 ml van een 5% oplossing van natriumhypochloriet met 2,2 ml DDW om een alkalische hypochlorietoplossing van 4 ml te creëren (eindconcentratie van 0,5 N voor natriumhydroxide en 1,25% voor natriumhypochloriet).
    3. Verzamel de wormen (gravid hermafrodieten) in een conische buis van 15 ml door de NGM-platen 3x te wassen met 1 ml M9-buffer om ervoor te zorgen dat alle moeders in de buis zijn verzameld.
    4. Bezink de wormen door centrifugeren bij 500 × g gedurende 1 minuut en gooi het supernatant weg totdat een volume van 1 ml overblijft.
    5. Voeg 1 ml alkalische hypochlorietoplossing toe en meng door de buis 5x om te keren. Draai de buis voorzichtig gedurende 3 minuten om het vrijkomen van eieren te helpen en observeer de toestand van wormen onder een ontleedstereoscoop.
    6. Wanneer ongeveer 50% van de wormen is gebroken, voegt u 5 ml M9-buffer toe en bezinkt u de eieren onmiddellijk door gedurende 1 minuut te centrifugeren bij 500 × g.
    7. Verwijder het supernatant voorzichtig zonder de pellet te verstoren. Voeg 5 ml M9-buffer toe en herhaal de wasprocedure 2x.
    8. Verwijder het supernatant totdat er 2 ml overblijft en draai de buis (360 ° rotatie) bij 20 tpm gedurende ~ 16 uur (RT, 21 ° C) om gesynchroniseerde L1-larven te verkrijgen. Neem uit deze buis een druppel van 5 μL op een glasplaat, tel het aantal larven onder een stereoscoop, herhaal deze stap 3x, neem een gemiddelde van de drie tellingen en schat het aantal wormen per microliter (μL). Voeg op basis van deze berekeningen ~ 200 larven toe per NGM-plaat bezaaid met OP50-bacteriën.
    9. Laat de L1-larven gedurende ~48 uur groeien bij 21 °C tot het jongvolwassen stadium.
  4. Medicamenteuze behandeling en microscopieprocedure
    1. Leg 100 wormen op elk van de experimentele of controleplaten. Zorg ervoor dat de negatieve, positieve en experimentele platen het voertuig, respectievelijk 5 μM FCCP en 62,5 μM VL-850, bevatten. Incubeer bij 21 °C gedurende 6 uur.
    2. Gebruik 1 ml M9-buffer om de wormen van elke plaat in een microcentrifugebuis van 1,7 ml te wassen. Draai de buis kort (~3 s) in een minicentrifuge. Gooi vervolgens het supernatant weg door de M9-buffer voorzichtig uit te pipetteren zonder de wormkorrel te verstoren. Herhaal deze wasstap 2x en verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant zonder de wormkorrel te verstoren.
    3. Voeg 200 μL M9-buffer, die 0,1% v/v Poloxameer 188, 0,1% v/v Pluronic F127 en 2 μL van het kleuringskitreagens bevat, toe aan de wormpellet. Laat het mengsel draaien bij 20 rpm (360° rotatie) gedurende 1 uur bij RT (kamertemperatuur, 21 °C). Om de kleurstoffen tegen licht te beschermen, bedek de buizen met aluminiumfolie.
    4. Draai de wormen voorzichtig, zoals beschreven in stap 1.3.4. Verwijder vervolgens de kleuringsoplossing zonder de wormkorrel te verstoren. Was vervolgens de wormen zoals beschreven in stap 1.3.2 en breng ze over in een gezaaide NGM-agarplaat met de juiste behandeling - wormen die met FCCP zijn behandeld, worden bijvoorbeeld overgebracht naar een plaat met FCCP. Bedek de platen met aluminiumfolie omdat het vlekreagens lichtgevoelig is.
      OPMERKING: We hebben de wormen overgebracht naar kweekplaten met bacteriën en het bijbehorende behandelingsmiddel om het achtergrondgeluid als gevolg van overtollige kleurstof te minimaliseren. Wormen die met FCCP waren behandeld, werden bijvoorbeeld overgebracht naar met FCCP aangevulde platen, enzovoort.
    5. Was de wormen van de platen in verse microcentrifugebuizen met behulp van 1 ml M9-buffer; Was de wormen 2x op dezelfde manier. Bevestig vervolgens de wormen met 1% formaldehyde op ijs gedurende 30 minuten en was de wormen met 1 ml M9-buffer 3x om resterende formaldehyde te verwijderen. Na de wasbeurten spint u de wormen tot een pellet en zuigt u de maximale hoeveelheid supernatant op, waarbij de wormpellet intact blijft in 10 μL M9.
    6. Om 2,5% agarose te bereiden, weegt u 0,125 g agarose in een 10 ml borosilicaatglazen reageerbuis, voegt u 5 ml M9-buffer toe en lost u de agarose op door de buis voorzichtig te verwarmen met een Bunsen-brander. Breng de gesmolten agarose over in een droogbad van 75 °C en leg met behulp van een punt van 1 ml 100 μL van de gesmolten agarose op een Deckgläser-microscoopafdekglas (24 mm x 60 mm). Plaats onmiddellijk een andere dia loodrecht op de agarose-druppel en vorm een kruisvorm. Wacht ~ 2 minuten en scheid de dia's voorzichtig door (voorzichtig) op het glas van de bovenste afdekking te duwen, waardoor het agarose-kussen op de onderste afdekschuif blijft.
      OPMERKING: Wees voorzichtig tijdens het verwarmen van de agarose in de buis en zorg ervoor dat de buis uit de buurt van het lichaam wordt gehouden. Snijd de rand van de punt van 1 ml om de stolling van de agarose te minimaliseren.
    7. Breng de wormen over op het agarosepad met een Pasteur-glazen pipet (d.w.z. de volledige hoeveelheid in de buis, ~ 10 μL). Verwijder de overtollige vloeistof met een lont gemaakt van een laboratoriumdoekje en bedek de wormen vervolgens met een kleinere afdekschuif (24 mm x 40 mm). Breng transparante nagellak aan op de rand van de kleinere afdekplaat om verdamping te voorkomen. Plaats de dia in een donkere doos om hem te beschermen tegen licht.
    8. Gebruik een confocale microscoop om de wormen binnen 24 uur op de juiste golflengten (zie hieronder) in beeld te brengen met behulp van een 60x vergrotingslens.
      1. Plaats de dia op het microscooppodium.
      2. Open de beeldbewerkingssoftware en klik met de rechtermuisknop op het grijze gebied van de software. Open Acquisitie | Ti2 Full Pad ND Acquisitie | LUTs door te klikken op de opties op de pop-up die verschijnt als gevolg van de klik met de rechtermuisknop.
      3. Selecteer onder Ti2 Full Pad de optie 60x.
      4. Selecteer onder Acquisitie de optie Oculair DIA en breng de wormen in beeld met behulp van de microscoopknop voor fijnscherpstelling. Selecteer onder Acquisitie de optie Draaiende schijf en kies de optie 16-bits - Geen binning. Stel voor elk fluorescentiefilter de belichtingstijd in op 500 ms en 20 ms voor Brightfield. Zodra deze parameters zijn ingesteld, selecteert u Nu uitvoeren en wacht u tot de uitvoerafbeelding is gegenereerd als een ND2-bestand.
        OPMERKING: De belichtingstijd moet experimenteel worden bepaald, omdat verschillende beeldopstellingen verschillende kenmerken hebben. Gebruik opzoektabellen (LUTs) om de fluorescentie-intensiteit voor elke golflengte te onderzoeken.
  5. Beeldanalyse
    1. Open de confocale beelden (hier, Nikon ND2-bestanden) in ImageJ27 met de colocalisatie-plug-in. Elk ND-bestand bevat beeldvlakken genomen op drie golflengten (met behulp van DAPI, GFP/FITC [groen] en Texas Red [rood] filters) en zichtbaar licht. Als u deze afbeeldingen wilt openen, opent u het ND-bestand op de ImageJ-server en selecteert u Afbeeldingen splitsen in het dialoogvenster. Werk met brightfield (BF), groene kanaal en rode kanaalafbeeldingen.
    2. Genereer duplicaten van deze afbeeldingen om de originele afbeelding onaangeroerd te houden door op Afbeelding | Dupliceer of gebruik de sneltoets Shift + D.
    3. Om de achtergrond te verkleinen, genereert u nog een duplicaat van de afbeelding, zoals hierboven vermeld. Trek de achtergrond af met een voortschrijdende straal van 100 en selecteer de optie Achtergrond maken (niet aftrekken) om een afbeelding te genereren met de achtergrond van de gegeven afbeelding. Ga vervolgens naar Proces | Afbeeldingscalculator en trek de eerste gedupliceerde afbeelding af van de tweede gedupliceerde afbeelding. Gebruik de resulterende afbeeldingen voor de colokalisatieanalyse.
    4. Als u de plug-in voor colocalisatie wilt gebruiken, converteert u de afbeeldingen van het groene kanaal en het rode kanaal naar 8-bits. Klik hiervoor op Afbeelding | Soort | 8 bit.
    5. Klik op Plugins | Colocalisatie. Om de colocalisatie van mitochondriën en lysosoomsignalen te meten met behulp van de colocalisatieplug-in (zie hierboven), gebruikt u de volgende parameters: Ratio = 75%, Threshold rood kanaal = 80,0, Threshold groen kanaal = 50,0. De uitvoer is een 8-bits binaire afbeelding met gecolokaliseerde puncta en een combinatie van de drie 8-bits afbeeldingen (groen, rood en de gecolokaliseerde afbeelding) in een RGB-afbeelding.
    6. Focus op de puncta in de hoofdlichaamwandspier van de wormen door dit gebied handmatig te selecteren en een masker te maken door op Bewerken | Selectie | Masker maken, waarmee het gewenste gebied wordt geselecteerd (afbeelding 2A, B). Verwijder selectief andere gekleurde entiteiten (bijvoorbeeld de faryngeale spieren) om het spiergebied van de hoofdwand te analyseren.
    7. Als u de deeltjes in het gewenste gebied (ROI) wilt selecteren, selecteert u de gecolokaliseerde 8-bits en maskeert u afbeeldingen met behulp van de afbeeldingscalculator. Gebruik vervolgens de bewerking AND (Figuur 3A) om de puncta in de ROI te selecteren. Dit genereert een afbeelding met puncta in de ROI (figuur 3B).
    8. Als u het gebied van de gecolokaliseerde mitochondriën en lysosomen wilt analyseren, selecteert u Analyseren | Analyseer deeltjes en meet de som van de puncta tussen 0,1625 μm 2 en 4 μm2.

2. Het Hep-3B kankercelprotocol

  1. Het bereiden van de medicijnvoorraadoplossing
    1. Bereid 100 mM VL-850 voor in DMSO. Verdun het tot 5 mM met 0,5 M HEPES-buffer, pH 7,3, en steriliseer de oplossing met een spuitfilter van 0,22 μm. Bereid vervolgens het voertuig voor zoals eerder beschreven, maar zonder het medicijn (in dit geval VL-850).
  2. Het kweken van Hep-3B-cellen voor het experiment, medicamenteuze behandeling en microscopieprocedure
    1. Kweek Hep-3B-cellen in weefselkweekplaten van 10 cm die Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bevatten, aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 2% L-glutamine en 1% tetracycline (hierna volledige DMEM genoemd). Incubeer de cellen bij 37 °C en 5% CO2.
    2. Kies een plaat van Hep-3B-cellen met 70% -80% celconfluentie (logaritmische groeifase), verwijder het medium en was de plaat met 5 ml voorverwarmde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de PBS en incubeer de cellen met 1 ml voorverwarmd 0,25% trypsine / 0,02% EDTA gedurende ~ 3 minuten bij 37 ° C; observeer de cellen onder een weefselkweekmicroscoop (10x). Stop de trypsinevertering wanneer de cellen rond worden en beginnen te dissociëren van de plaat door 5 ml volledige DMEM toe te voegen. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten op 1.000 × g , verwijder het supernatant en resuspensie van de cellen in 5 ml volledige DMEM.
    3. Bepaal de celconcentratie. Meng 50 μL van de celsuspensie met 50 μL trypan blauw. Tel de cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of met behulp van een hemocytometer 5x, en neem een gemiddelde van deze tellingen om de nauwkeurigheid van de tellingen te garanderen.
    4. Zaai 42.000 Hep3G-cellen in elke 8-well μ-slide in 400 μL complete DMEM (zoals hierboven beschreven). Incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2.
    5. Verwijder na 24 uur bij ~80%-85% confluentie 250 μL medium uit elk van de putten en voeg 50 μL medium toe met de juiste behandeling of het juiste medium. Om dit protocol te volgen, behandelt u de cellen met 100 μM VL-850, 5 μM FCCP en een voertuig als controle.
    6. Voeg na de incubatie van 6 uur met de verbindingen 50 μL medium toe aan elke put met het kleuringsreagens (0,5 μL kleurstof voor 250 μL in elk putje). Incubeer de cellen met de kleurstof gedurende 30 minuten bij 37 °C en 5% CO2.
      OPMERKING: Aangezien het kleuringsreagens lichtgevoelig is, minimaliseert u de blootstelling aan licht door de monsters te bedekken met aluminiumfolie en te werken in een omgeving met weinig licht (indien mogelijk).
    7. Verwijder met behulp van een pipet van 200 μL voorzichtig al het medium (250 μL) uit elk putje en was de cellen vervolgens met 200 μL voorverwarmde PBS.
    8. Bevestig de cellen met 200 μL fixatieoplossing met 4% formaldehyde en 2,5% glutaaraldehyde bereid in PBS gedurende 15 minuten bij RT.
    9. Decanteer de fixatieve oplossing en was kort met 200 μL PBS.
    10. Voeg 200 μL PBS toe, houd de cellen bedekt en beschermd tegen licht bij 4 °C en beeld binnen 24 uur.
      OPMERKING: We gebruikten de confocale microscoop van de draaiende schijf in vier kanalen, waaronder DIC, TRITC, FITC en DAPI, zoals in stap 1.4.8. We hebben ~300 cellen per behandeling in beeld gebracht.
  3. Beeldanalyse
    1. Voer stap 1.5.1-1.5.5 uit. Om de ROI van de cellen te verkrijgen, genereert u een afbeelding die het gebied van cellen markeert. Kies hiervoor een afbeelding met gelokaliseerde punten (RGB) (afbeelding 4A). Als u het volledige celgebied wilt selecteren, selecteert u Verwerken | Binair | Maak masker om een binaire afbeelding te verkrijgen (figuur 4B). Als u het gebied van de cel wilt analyseren, selecteert u Analyseren | Analyseer deeltjes en meet alle deeltjes in de afbeelding van 0 tot oneindig, wat de standaardinstelling is voor Deeltjes analyseren.
    2. Om het gebied van de gecolokaliseerde mitochondriën en lysosomen te analyseren, selecteert u een gecolokaliseerde 8-bits afbeelding, converteert u deze naar binair door Proces selecteren | Binair | Binair maken, selecteer Analyseren | Analyseer deeltjes en meet de som van puncta tussen 0,1625 μm 2 en 4 μm2. Om de gecolokaliseerde puncta te meten, deelt u het gebied van de gecolokaliseerde mitochondriën en lysosomen door het totale celoppervlak.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inductie van een robuuste mitofagierespons in zowel C. elegans-wormen als Hep-3B-cellen met VL-850
VL-850 beschermt C. elegans , wormen en menselijke keratinocyten (HaCaT-cellen) tegen oxidatieve stress23. Om het werkingsmechanisme verder te onderzoeken, onderzochten we of VL-850 mitofagie induceert in C. elegans en andere menselijke cellen. Om dit te testen, stelden we C. elegans-wormen (jonge volwassenen, 3 dagen na L1) gedurende 6 uur bloo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meerdere mitofagieroutes omvatten verschillende eiwitten en biomoleculen (bijv. Cardiolipine29). Het eindpunt van deze routes is echter vergelijkbaar - de afbraak van mitochondriën door lysosomale enzymen12,13. Inderdaad, verschillende methoden gebruiken dit eindpunt om mitofagie te kwantificeren. Sommige methoden, zoals elektronenmicroscopie, vereisen echter toegang tot dure apparatuur, getrainde experts en een langere voorbereidingstijd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de leden van het Gross-laboratorium voor het kritisch lezen van het manuscript en hun commentaar en advies. We danken het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door het National Institutes of Health Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440), voor het leveren van enkele van de stammen. Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van Vitalunga Ltd en de Israel Science Foundation (subsidie nr. 989/19). De grafische abstracte figuur (figuur 1) werd gegenereerd met BioRender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens of hulpbron
Analytische balansMettler-Toledo
Bacto AgarBD-Difco214010
Bacto PeptoneBD-Difco211677
Bacto TryptoneBD-Difco211705
Bacto Gist extractBD-Difco212750
Calcium chlorideSigmaC1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)SigmaC2920
Chemicaliën
CholestrolThermo FisherC/5360/48
DMEM hoge glucoseBiological Industries01-055-1A
Dubbel gedestilleerd water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
FBS inactief door verhittingInvitrogenM7514
Gluteraldehyde (25%)SigmaG5882
HEPES Buffer 1 MBiological Industries03-025-1B
L-glutamineBiological Industries03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter ReagentAbcamab139487
Magnesium SulfateSigmaM7506
Nonidet P 40Sigma74385
Paraformaldehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15720
Poloxamer 188 oplossingSigmaP5556
KaliumdiwaterstoffosfaatMillipore1.04873.1000
Kaliumfosfaat dibasischSigmaP3786
SeaKem LE AgaroseLonza50004
NatriumchlorideBio-Lab1903059100
NatriumhydroxideGadot1310732
Natriumfosfaat dibasisch dodecahydraatSigma4273
Tetracycline hydrochlorideSigma87128-25G
Trypsine-EDTABiological Industries03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octaanGepatenteerd
Glas/Kunststof Wegwerpartikelen
0.22 μm spuitfilterMillex GVSLGV033RS
1,7 mL MicrocentrifugebuizenLifegeneLMCT1.7B-500
10 cm Petri schotelsCorning430167
1.000 mL Erlenmeyer kolfIsoLab, Duitsland
15 mL steriele polypropyleen buisLifegeneLTB15-500
35 mm Petri schotelsBar NaorBN9015810
500 mL vacuümfilter/opslagfles systeem, 0.22 μmLifegeneLG-FPE205500S
50 mL steriele polypropyleen buisLifegeneLTB50-500
Deckgläser Microscoop dekglas 24 x 60 mmMarienfeld101152
Glas testbuisjes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicaat glasPyrex99445-13
iBiDi 8 wel μ-slidesiBiDi80826
Microscoop dekglas 24 x 40 mmBar NaorBN1052421ECALN
Platinum iridium 0,25 mM draadWorld Precision InstrumentsPT1002
Instrumenten
Celteller CellDrop BFDeNovixCellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400BiosanBS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocale microscoop met DAPI, FITC en TRITC filters en bright-field, met een 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (luchtlens) en NIS-Elements softwareNikonCSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscoopOlympusSZ61
pH meterMettler-ToledoMT30019032
Revolver Instelbare Lab RotatorLabnetH5600

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
  2. Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
  3. Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
  4. Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
  5. Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
  6. Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
  7. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
  8. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
  10. Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
  11. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64(2017).
  12. Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
  13. Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
  14. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  15. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  16. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  17. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
  18. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  19. Yim, W. W. -Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6(2020).
  20. Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
  21. Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479(2021).
  22. Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706(2022).
  23. Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
  24. Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
  25. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).
  26. Wood, W. B. The Nematode Caenorhabditis Elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1988).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
  29. Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van mitofagiemitochondriale autofagieconfocale microscopiecolocalisatieanalyselysosoomkleuringmitochondri nkleuringImageJ colocalisatie

Gerelateerde artikelen