Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Verrijking van mRNA en bisulfiet-mRNA-bibliotheekvoorbereiding voor sequencing van de volgende generatie

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65352

⸱

7 juli 2023

 , 
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol biedt een eenvoudig te volgen workflow voor het uitvoeren van poly(A) RNA-zuivering, bisulfietconversie en bibliotheekvoorbereiding met behulp van gestandaardiseerde apparatuur voor een biologisch monster van belang.

Samenvatting

RNA post-transcriptionele modificaties in verschillende soorten RNA-transcripten worden geassocieerd met diverse RNA-regulatie in eukaryote cellen. Afwijkende RNA 5-methylcytosinemodificaties en de ontregelde expressie van RNA-methyltransferasen blijken geassocieerd te zijn met verschillende ziekten, waaronder kanker. Transcriptoombrede bisulfiet-sequencing werd ontwikkeld om de posities en de kwantitatieve cytosinemethylatieniveaus in het bisulfiet-geconverteerde RNA te karakteriseren bij de basenpaarresolutie. Hierin presenteert dit protocol de procedures van twee rondes van poly(A) RNA-zuivering, drie cycli van bisulfietreactie en bibliotheekvoorbereiding in detail om het transcriptoombrede in kaart brengen van mRNA-5-methylcytosinemodificatieplaatsen mogelijk te maken. De beoordeling van de hoeveelheid en kwaliteit van RNA na de hoofdreactie is essentieel om de integriteit van RNA te bewaken en is een cruciale stap om sequencingbibliotheken van hoge kwaliteit te garanderen. Idealiter kunnen de procedures binnen drie dagen worden afgerond. Met dit protocol kan het gebruik van hoogwaardig totaal RNA als input praktisch robuuste bisulfiet-mRNA-bibliotheken opbouwen voor sequencing van de volgende generatie van het monster van belang.

Inleiding

Van de meer dan 150 soorten post-transcriptionele modificaties1 is 5-methylcytosine (m5C)-modificatie geïdentificeerd in verschillende soorten RNA's, waaronder ribosomaal RNA, transfer-RNA, boodschapper-RNA, micro-RNA, lang niet-coderend RNA, kluis-RNA, enhancer-RNA en kleine cajal lichaamsspecifieke RNA's2. Het RNA m 5 C wordt geassocieerd met diverse biologische en pathologische mechanismen, zoals het reguleren van de ontwikkeling van plantenwortels3, virale genexpressie4 en kankerprogressie5. Het doel van dit protocol is om gestroomlijnde pijplijnen te bieden om het transcriptoombrede mRNA m5C-modificatieprofiel van biologische monsters in verschillende ontwikkelingsstadia of in de ziekteomgeving te karakteriseren. Transcriptoombrede bisulfiet-sequencing werd ontwikkeld om de posities en de kwantitatieve cytosinemethylatieniveaus in het bisulfiet-geconverteerde RNA te karakteriseren bij basenpaarresolutie 6,7,8,9. Dit is vooral nuttig bij het bestuderen van de associatie van m5C met genexpressie en RNA-lot dat betrokken is bij de biologische regulerende mechanismen in cellen. In de zoogdiercel zijn er twee bekende m 5 C-lezers: ALYREF kan m 5 C in de kern herkennen en dient als een mRNA-kern-naar-cytosol-transporter10, terwijl YBX1 m5C in het cytoplasma kan herkennen ende mRNA-stabilisatiekan verhogen 11. Afwijkende m5C-mRNA's gerelateerd aan immuunroutes werden gerapporteerd in systemische lupus erythematosus CD4+ T-cellen12. Studies hebben een verband aangetoond tussen mRNA m5C-modificatie en modulatie van kankerimmuniteit en kankerprogressie13,14. Daarom kan het in kaart brengen van het m5C-modificatieprofiel op het mRNA cruciale informatie opleveren om de potentiële regulerende machinerie op te helderen.

Om de functionele rol van RNA m 5 C-modificatie onder bepaalde biologische omstandigheden te onderzoeken, kunnen de op bisulfietconversie gebaseerde (bsRNA-seq) en op antilichaamaffiniteitsverrijking gebaseerde benaderingen zoals m5 C-RIP-seq, miCLIP-seq en 5-Aza-seq worden gecombineerd met het high-throughput sequencing-platform om efficiënte detectie van gerichte regio's en sequenties te bieden met de m5C-modificaties op een transcriptoombredeschaal15, 16. okt. Het voordeel van dit protocol biedt het uitgebreide RNA m 5C-landschap met een resolutie van één basis, aangezien de op verrijking gebaseerde benadering van antilichaamaffiniteit afhankelijk is van de beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen en de resolutie van één fragment van m5C-methylatielandschap17 zou kunnen bereiken.

Alle RNA-monsters zullen worden verwerkt met twee rondes van mRNA-verrijking met behulp van oligo(dT)-kralen, drie cycli van bisulfietreactie en de voorbereiding van de sequentiebibliotheek. Om de RNA-kwaliteit te bewaken, zal elk RNA-monster worden onderzocht door middel van capillaire gelelektroforese voor en na de procedures van mRNA-zuivering en bisulfietreactie om de fragmentverdeling te beoordelen. De gezuiverde bibliotheken zullen worden onderzocht op hun PCR-ampliconkwaliteiten, DNA-grootteverdelingsfragmenten door capillaire gelelektroforese en hun totale hoeveelheden onderzocht door kwantitatieve tests op basis van fluorescentiekleurstoffen voordat ze worden gesequenced. Het systeem kan ook worden gebruikt om een breed spectrum van biologische monsters te analyseren, zoals landbouwproducten, geïsoleerde virionen, cellijnen, modelorganismen en pathologische monsters.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Poly(A) RNA-zuivering

OPMERKING: Gebruik het totale RNA dat is behandeld met DNase I en onderzoek de totale RNA-kwaliteit en -integriteit door middel van capillaire of conventionele gelelektroforesebeoordeling voordat u overgaat tot poly(A)-RNA-zuivering. Onderzoekers moeten in staat zijn om de 28S en 18S rRNA-ribosomale banden in het veld met hoog molecuulgewicht en de 5.8S rRNA-band in het veld met laag molecuulgewicht te identificeren zonder significante uitstrijkjes in het elektroferogram. De zuiveringsstappen volgen in wezen de instructies van de fabrikant met kleine wijzigingen die in de specifieke stappen worden aangegeven. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

  1. Voorbereiding
    1. Verwarm het reagens, de wasbuffer, de oligo(dT)-korrels en de lysisbuffer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur voordat u de volgende procedures uitvoert.
    2. Voor de isolatie van met poly(A) verrijkt RNA wordt 10-20 μg van een aliquot van hoogwaardig totaal RNA als uitgangsmateriaal bereid door een voldoende hoeveelheid RNA over te brengen in een nucleasevrije microcentrifugebuis van 1,5 ml. Incubeer gedurende 5 minuten in het warmteblok bij 70 °C en bewaar vervolgens 2 minuten op ijs.
      OPMERKING: De hoeveelheden totaal RNA als uitgangsmateriaal moeten op de juiste manier worden aangepast, afhankelijk van de gewenste hoeveelheid mRNA en de aard van de gebruikte cellen. Empirisch gezien kan het poly(A)-verrijkte RNA verantwoordelijk zijn voor 1-5% abundanties in het totale RNA. Een aliquot van 10 μg totaal RNA van hoge kwaliteit moet hoogwaardig poly(A)-verrijkt RNA opleveren in het bereik van 100-500 ng voor de stroomafwaartse bisulfietconversie.
    3. Resuspendeer intussen de oligo(dT) kralen volledig. Breng de benodigde hoeveelheden kralensuspensie over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml en plaats deze vervolgens 3 minuten op de magneet totdat de magnetische kralen een pellet vormen.
      OPMERKING: Gebruik oligo(dT)-korrels van 50 μl voor 10 μg totale RNA-input. Het volume van de kralen in deze stap kan verder worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de gebruikte cellen.
    4. Verwijder het supernatans en resuspendeer de oligo(dT)-korrels met gelijke hoeveelheden (het volume van de kralensuspensie gebruikt in stap 1.1.3.) lysisbuffer en plaats deze gedurende 3 minuten op de magneet voordat u het supernatant verwijdert.
      NOTITIE: Droog de kralen niet te veel; De gebruiker moet snel doorgaan naar stap 1.2.1.
  2. De eerste zuiveringsronde
    1. Voeg lysisbuffer toe aan de RNA-monsterbuis (volumeverhouding 4:1) en meng grondig voordat u het overbrengt naar de oligo(dT)-korrels.
      OPMERKING: Als het RNA-monstervolume 20 μL is, voeg dan 80 μL lysisbuffer toe.
    2. Resuspendeer het RNA: lysisbuffermix en oligo(dT) kralen volledig door minimaal 10x te pipetteren.
    3. Laat de monsters gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur continu incuberen.
    4. Plaats het monster gedurende 5 minuten op de magneet of totdat het supernatans helder is; Gooi de supernatant weg.
    5. Voeg 600 μL wasbuffer 1 toe aan de korrels en meng voorzichtig om de korrels opnieuw te suspenderen.
    6. Plaats de buis gedurende 5 minuten op de magneet of totdat het supernatans helder is, gooi het supernatant weg en herhaal wasstap 1.2.5 eenmaal.
    7. Was de kralen door 300 μL wasbuffer 2 toe te voegen en laat de kralen voorzichtig resuspenderen.
    8. Plaats de buis gedurende 5 minuten op de magneet of totdat het supernatans helder is, gooi het supernatant weg en herhaal wasstap 1.2.7 eenmaal.
    9. Voeg 30 μL koude 10 mM Tris-HCl (elutiebuffer) toe aan het monsterbuisje en incubeer gedurende 5 minuten bij 70 °C.
    10. Breng de buis snel over op de magneet en wanneer de suspensie na 20 s of langer helder is, breng dan het supernatans met geëlueerd poly(A)-verrijkt RNA over naar de nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  3. De tweede zuiveringsronde
    1. Voeg 120 μL (4x het volume van het geëlueerde monster) lysisbuffer toe aan het geëlueerde RNA-monster en meng grondig.
    2. Was de kralen die in de eerste zuiveringsronde zijn gebruikt met een gelijke hoeveelheid lysisbuffer als stap 1.1.4, pipet 10x om de kralen te resuspenderen, en plaats ze vervolgens 5 minuten op de magneet voordat u de supernatant weggooit.
    3. Breng het RNA: lysisbuffermengsel over op de gewassen korrels en meng grondig door minimaal 10x te pipetteren.
    4. Incubeer het monster met continue rotatie gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Herhaal stap 1.2.4 tot en met 1.2.8 om zout en andere RNA-subtypen te verwijderen.
      OPMERKING: Het volume van de wasbuffer kan worden teruggebracht tot 300 μL wasbuffer 1 en 150 μL wasbuffer 2.
    6. Voeg 25 μL (gewenst volume) koude 10 mM Tris-HCl (elutiebuffer) toe aan de monsterbuis en incubeer gedurende 5 minuten bij 70 °C.
    7. Breng de buis snel over op de magneet en wanneer de suspensie na 20 s of meer helder is, breng dan het supernatans met geëlueerd poly(A)-verrijkt RNA over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    8. Breng 2,2 μL over naar 8-strooks buisjes voor kwaliteitsbeoordeling van de hoeveelheid en kwaliteit van RNA met behulp van RNA-tests met hoge gevoeligheid.
    9. Bewaar het monster bij -20 °C voor korte perioden en -70 °C voor een langere periode.
      OPMERKING: Dit kan een pauzepunt in het protocol zijn.

2. Bisulfietconversie

OPMERKING: De centrifugeerstappen werden allemaal bij kamertemperatuur uitgevoerd. De procedures worden in wezen uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, maar met een extra stap 2.2 voor het toevoegen van de spike-in controle-mRNA-sequentie(n) vóór de bisulfietreactiestap 2.3.

  1. Breng 19 μL gezuiverd poly(A)-verrijkt RNA-monster over naar een buis van 0,2 ml met 8 strips.
  2. Voeg 1,0 μL spike-in-controle, die vrij is van wijzigingen bij de vooraf bepaalde hoeveelheidsverhouding van 1:10.000 (d.w.z. 0,1 ng luciferase-mRNA: 1 μg gezuiverd poly(A)-verrijkt RNA) toe aan het RNA-monster van stap 2.1.
    OPMERKING: De spike-in-controlesequentie kan Firefly-luciferase-RNA, Renilla-luciferase of in vitro getranscribeerde RNA-sequentie zonder gemethyleerde cytosines zijn.
  3. Voeg 130 μL conversieregent toe aan de buis en keer voorzichtig meerdere keren om voor grondig mengen.
  4. Plaats de buis in de PCR-machine en voer drie verwarmingscycli uit bij 70 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door incubatie bij 64 °C gedurende 45 minuten en vervolgens een laatste stap om af te koelen tot 4 °C.
  5. Plaats de kolom op de verzamelbuis en breng 250 μL RNA-bindingsbuffer over naar de kolom.
  6. Breng het monster van stap 2.4 over naar de kolom van stap 2.5 en pipetteer het grondig.
  7. Voeg 400 μL 95-100% ethanol toe aan de kolom, sluit snel de dop en keer meerdere keren om.
  8. Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 30 s bij 25 °C en gooi de doorstroming weg.
  9. Voeg 200 μL RNA-wasbuffer toe aan de kolom.
  10. Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 30 s bij 25 °C en gooi de doorstroming weg.
  11. Voeg 200 μL desulfonatiebuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  12. Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 30 s bij 25 °C en gooi de doorstroom weg.
  13. Voeg 400 μL RNA-wasbuffer toe en centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 30 s bij 25 °C en gooi de doorstroming weg. Herhaal deze stap één keer.
  14. Centrifugeer opnieuw bij 10.000 × g gedurende 2 minuten bij 25 °C om de resterende wasbuffer volledig te verwijderen.
    NOTITIE: De andere centrifugatiestap 2.14 gedurende 2 minuten vóór elutie is het volledig verwijderen van de wasbuffer. De wasstap wordt twee keer uitgevoerd om de zoutrijke component uit het bisulfietreagens en de desulfonatiebuffer op de kolom te spoelen.
  15. Breng de kolom over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
  16. Voeg 20-30 μL nucleasevrij H2O toe aan de kolom en laat 1 minuut op kamertemperatuur staan.
  17. Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 30 s bij 25 °C.
  18. Breng 2,2 μL over naar 8-strooks buisjes voor de beoordeling van de hoeveelheid en kwaliteit van RNA.
  19. Bewaar het met bisulfiet behandelde RNA-monster gedurende korte perioden bij -20 °C en -70 °C gedurende een langere periode.
    OPMERKING: Dit kan een pauzepunt in het protocol zijn.

3. Met bisulfiet behandelde mRNA-bibliotheekvoorbereiding

NOTITIE: Volg het instructieprotocol voor bibliotheekvoorbereiding sectie 4 voor gebruik met gezuiverd mRNA of rRNA-verarmd RNA. De eerste priming-stap moet het FFPE-RNA-protocol volgen, aangezien de bisulfietbehandeling het RNA fragmenteert. Voer elke stap uit in de laminaire stromingskap en voeg het reactiemengsel toe op een ijsgekoeld koelrek.

  1. Het ingangs-RNA primen
    1. Breng de gewenste hoeveelheid met bisulfiet behandeld mRNA-monster over in een totaal van maximaal 5 μL of voeg nucleasevrije H2O toe om een totaal van 5 μL te maken.
      OPMERKING: Een minimum van 10 ng met bisulfiet behandeld mRNA als input wordt aanbevolen voor dit type RNA-bibliotheekvoorbereiding en om de uiteindelijke molariteit van het 4nM-bibliotheekproduct te genereren.
    2. Voeg 1 μL Random primer (lila) toe aan het monster en meng door te pipetteren.
    3. Plaats het monsterbuisje in de vooraf ingestelde PCR-machine bij 65 °C en het deksel op 105 °C gedurende 5 minuten en houd het op 4 °C.
  2. Eerste-strengs cDNA-synthese
    1. Voeg 4 μL synthesereactiebuffer (lila), 8 μL strengspecificiteitsreagens (bruin) en 2 μL synthese-enzymmix (bruin) toe aan het monster, wat een totaal volume van 20 μL oplevert. Meng grondig door minstens 10x te pipetteren en draai snel af.
    2. Plaats het monsterbuisje in de vooraf ingestelde PCR-machine bij 25 °C gedurende 10 min, 42 °C gedurende 50 min, 70 °C gedurende 15 min en houd deze op 4 °C.
      OPMERKING: Voor wisselplaten van meer dan 200 basen wordt een incubatietijd van 42 °C van 50 minuten aanbevolen; voor wisselplaatgroottes van minder dan 200 basen wordt een incubatietijd van 42 °C van 15 minuten aanbevolen.
  3. Tweede-strengs cDNA-synthese
    1. Voeg 8 μL synthesereactiebuffer toe met dUTP-mix (oranje), 4 μL synthese-enzymmix (oranje) en 48 μL nucleasevrijH2O. Meng grondig door minimaal 10x te pipetteren en draai snel af.
    2. Plaats het monsterbuisje in de vooraf ingestelde PCR-machine bij 16 °C gedurende 1 uur met het deksel eraf of ≤40 °C.
  4. Zuivering van dubbelstrengs cDNA met DNA-zuiveringskorrels
    1. Verwarm de DNA-zuiveringskralen 30 minuten voor het uitvoeren van de zuivering en vortex om de kralen opnieuw te suspenderen.
    2. Voeg 144 μL geresuspendeerde DNA-zuiveringskorrels toe aan het cDNA-monster uit stap 3.3.2 en meng grondig door minstens 10x te pipetteren.
    3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    4. Plaats het monsterbuisje gedurende 5 minuten op een magnetisch rek totdat de oplossing helder is en verwijder dan het supernatans en bewaar de kralen die DNA bevatten.
    5. Voeg 200 μL vers gemaakte 80% ethanol toe aan de buis met de kralen terwijl u het monster op het magnetische rek bewaart en incubeer gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
    6. Verwijder het supernatans en herhaal stap 3.4.5 één keer, maar verwijder deze keer voorzichtig al het resterende supernatant.
    7. Laat de kralen 1-5 minuten aan de lucht drogen terwijl u het monster op de magneet houdt.
      NOTITIE: Droog de kralen niet te veel; De kleur moet donkerbruin zijn.
    8. Haal het monster uit het magnetische rek en eluer het DNA door 53 μL 0,1x TE (10 mM Tris-HCl en 1 mM EDTA, pH 8,0) buffer aan de korrels toe te voegen. Meng grondig door minimaal 10x te pipetteren en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Plaats de buis gedurende 5 minuten op het magnetische rek of totdat de oplossing helder is.
    10. Breng 50 μL supernatans met dubbelstrengs cDNA over in een nieuwe 8-strips buis.
      OPMERKING: Het protocol kan op dit punt worden gestopt en het monster kan worden bewaard bij -30 °C.
  5. Einde voorbereiding cDNA-bibliotheek
    1. Voeg 7 μL eindpolijstreactiebuffer (groen) en 3 μl eindpolijstenzymmix (groen) toe aan het geëlueerde dubbelstrengs cDNA-monster.
    2. Meng het mengsel door 10x te pipetteren met een volume-instelling van 50 μL zonder luchtbellen te creëren en draai het monster vervolgens snel naar beneden.
    3. Plaats het monster in een PCR-machine en incubeer het bij 20 °C gedurende 30 min, 65 °C gedurende 30 minuten en houd het bij 4 °C.
  6. Ligatie van de adapter
    1. Verdun de adapter (rood) volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Voeg 2,5 μl van de verdunde adapter, 1 μl ligatieversterker (rood) en 30 μl ligatiemastermix (rood) toe aan het monster.
    3. Meng het mengsel door 10x te pipetteren met een volume-instelling van 80 μL zonder luchtbellen te creëren en draai het monster vervolgens snel naar beneden.
    4. Plaats het monster in een PCR-machine en incubeer het gedurende 15 minuten bij 20 °C.
    5. Voeg 3 μl van het mengsel van uracil-DNA-glycosylase en DNA-glycosylase-lyase-endonuclease VIII (blauw) toe aan het monster en pipel grondig.
    6. Plaats het monster terug in de PCR-machine en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C met het deksel ingesteld op 75 °C.
  7. Zuivering van met ligatiereactie behandelde cDNA's
    OPMERKING: De maatkeuze met SPRIselect Beads, of optioneel met AMpure XP kralen kan beide voor dit doel worden gebruikt18.
    1. Verwarm de kralen 30 minuten voor voordat u de zuivering uitvoert en vortex om ze opnieuw te suspenderen.
    2. Breng 25 μl geresuspendeerde korrels over in het cDNA-monster uit stap 3.6.6 en meng grondig door ten minste 10x te pipetteren.
    3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    4. Plaats het monsterbuisje 5 minuten op een magnetisch rek tot de oplossing helder is en breng het supernatans vervolgens over in een nieuw buisje met 8 strips en gooi de korrels weg.
    5. Voeg 10 μL geresuspendeerde parels toe aan het supernatans en meng grondig door minimaal 10x te pipetteren.
    6. Plaats het monsterbuisje gedurende 5 minuten op een magnetisch rek totdat de oplossing helder is en gooi dan het supernatans weg en verstoor de parels niet.
    7. Voeg 200 μL vers gemaakte 80% ethanol toe aan de buis met de kralen terwijl u het monster op het magnetische rek bewaart en incubeer gedurende 30 s bij kamertemperatuur.
    8. Verwijder het supernatans en herhaal stap 3.7.7 één keer, maar verwijder deze keer voorzichtig al het resterende supernatant.
    9. Laat de kralen 1-5 minuten aan de lucht drogen terwijl u het monster op de magneet houdt.
      NOTITIE: Droog de kralen niet te veel; De kleur moet donkerbruin zijn.
    10. Haal het monster uit het magnetische rek en eluer het DNA door 17 μL 0,1x TE-buffer aan de kralen toe te voegen. Meng grondig door minimaal 10x te pipetteren en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    11. Plaats de buis gedurende 5 minuten op het magnetische rek totdat de oplossing helder is.
    12. Breng 15 μL supernatant, dat dsDNA bevat dat op het doel is voorbereid, over naar een nieuwe buis met 8 strips.
  8. PCR-verrijking van adaptor-ligated DNA
    1. Voeg 25 μL mastermix (blauw), 5 μL 5'-adapterprimer en 5 μL 3'-adapterprimer toe aan het adapter-ligated DNA-monster. Meng grondig door minimaal 10x te pipetteren.
    2. Plaats het monster in de PCR-machine en voer PCR-amplificatie uit met behulp van de volgende stappen: (1) 98 °C gedurende 30 s, (2) 98 °C gedurende 10 s, (3) 65 °C gedurende 75 s, (4) 65 °C gedurende 5 min, en (5) vasthouden bij 4 °C; waarin de stappen (2) en (3) moeten worden herhaald voor een N+2-cyclusnummer waarbij N gelijk is aan de RNA-invoerhoeveelheid in de gebruiksaanwijzing. Dit betekent dat er 2 extra cycli nodig zijn vanwege de dubbelzijdige selectie van monsters die in stap 3.7 is uitgevoerd.
      OPMERKING: Bijvoorbeeld, 8 ng van de gezuiverde mRNA-input zou worden aanbevolen met 9-10 cycli PCR; maar met dubbelzijdig, op maat geselecteerd, geligeerd cDNA in stap 3.7, zou de aanbevolen PCR-cyclus 11-12 cycli zijn.
  9. Zuivering van PCR-geamplificeerde bibliotheken
    1. Verwarm de DNA-zuiveringskorrels 30 minuten voor voordat u de zuivering uitvoert en vortex om de kralen opnieuw te suspenderen.
    2. Breng 45 μl (0,9x) geresuspendeerde parels over aan het PCR-product uit stap 3.8.2 en meng grondig door ten minste 10x te pipetteren.
    3. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
    4. Plaats het monsterbuisje gedurende 5 minuten op een magnetisch rek totdat de oplossing helder is en verwijder dan het supernatans en bewaar de kralen die DNA bevatten.
    5. Voeg 200 μL vers gemaakte 80% ethanol toe aan de buis met de parels, laat het monster op het magnetische rek liggen en laat het 30 s op kamertemperatuur staan.
    6. Verwijder het supernatans en herhaal stap 3.9.5 één keer, maar verwijder deze keer voorzichtig al het resterende supernatant.
    7. Laat de kralen 1-5 minuten aan de lucht drogen terwijl u het monster op de magneet houdt.
      NOTITIE: Droog de kralen niet te veel; De kleur moet donkerbruin zijn.
    8. Haal het monster van het magnetische rek en voeg 22 μL 0,1x TE-buffer toe aan de kralen om het DNA te elueren. Meng grondig door minimaal 10x te pipetteren en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
    9. Plaats de buis op het magnetische rek en laat deze 5 minuten staan of totdat de oplossing bij kamertemperatuur helder is.
    10. Breng 20 μL supernatans over in een nieuwe 8-strips buis.
    11. Breng 2,2 μl over op buizen met 8 stroken voor kwaliteitsbeoordeling van de kwantiteit en kwaliteit van de bibliotheek.
      OPMERKING: De hoeveelheid van de bibliotheek kan ook worden gedetecteerd door qPCR (zie de tabel met materialen).
    12. Bewaar het bsRNA-seq-bibliotheekmonster bij -20 °C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een reeks bsRNA-seq-bibliotheken van cellijnen19 werd gegenereerd door de procedures in dit rapport te volgen (Figuur 1). Na totale RNA-zuivering vergezeld van DNase-behandeling uitgevoerd op cellijnmonsters en de kwaliteit gecontroleerd door gelelektroforese en UV-VIS spectrofotometrie (A260/A280), kan het RNA-monster overgaan tot poly(A)-RNA-verrijking. Om te bepalen of de dubbele zuivering het grootste deel van het ribosomaal RNA kon verwijderen, w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit protocol werd een gedetailleerde pijplijn van poly(A)-verrijking, bisulfietconversie en bibliotheekvoorbereiding bereikt door gebruik te maken van gestandaardiseerde componenten. Verdere sequentieanalyse leverde de identificatie op van mRNA 5-methylcytosine in interessante monsters.

De kritieke stap is de kwaliteit van het uitgangsmateriaal - totaal RNA - aangezien de afbraak van RNA van invloed zou zijn op de herstelsnelheid van poly(A)-RNA-zuivering. Het monster moet zorgvuldig worden...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Nationale Raad voor Wetenschap en Technologie van Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer SystemAgilent, Santa Clara, CARNA kwaliteitsdetectie
AMpure XP beadsBeckman CoulterA63881DNA zuiveren
Bioanalyzer DNA high sensitivity kitAgilent, Santa Clara, CA5067-4626DNA kwaliteitsdetectie
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kitAgilent, Santa Clara, CA5067-1513RNA kwaliteitsdetectie
DiaMag02 - magnetische rekDiagenode, Denville, NJB04000001assisteren bij bibliotheekvoorbereiding
DiaMag1.5 - magnetische rekDiagenode, Denville, NJB04000003assisteren bij poly(A) RNA-zuivering
Dynabeads mRNA DIRECT-zuiveringskitThermo Fisher Scientific, Waltham, MA61011poly(A) RNA-zuivering; Wash Buffer 1 en Wash Buffer 2
EthanolJ.T.Baker64-17-5
EZ RNA-methylatiekitZymo, Irvine, CAR5002bisulfietbehandeling
Firefly luciferase mRNAPromega, Madison, WI, USAL4561spike-in controlesequentie
KAPA Library Quantification KitsRoche, ZwitserlandKK4824bibliotheekkwantificering
Nanodrop spectrofotometerThermo Fisher Scientific, Waltham, MATotale RNA-hoeveelheid detectie
NEBNext multiplex Oligos voor illumina (index Primer set1)New England Biolabs, Ipswich, MAE7335Sbibliotheekvoorbereiding
NEBNext Ultra figure-materials-1 Directional RNA Library Prep Kit voor IlluminaNew England Biolabs, Ipswich, MAE7760Sbibliotheekvoorbereiding
Nuclease-vrij waterThermo Fisher ScientificAM9932
P2 pipetmanThermo Fisher Scientific, Waltham, MA4641010
Qubit 2.0 fluorometerThermo Fisher Scientific, Waltham, MARNA-hoeveelheid detectie
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32854DNA-hoeveelheid detectie
Qubit RNA HS Assay KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAQ32852RNA-hoeveelheid detectie

Referenties

  1. Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
  2. Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102(2019).
  3. Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959(2023).
  4. Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
  5. Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
  6. Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
  7. Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
  8. Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1(2017).
  9. Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40(2020).
  10. Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606(2017).
  11. Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
  12. Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430(2020).
  13. Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15(2022).
  14. Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43(2020).
  15. Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
  16. Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
  17. Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231(2020).
  18. Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , Chapter 18, Unit 18.12 (2009).
  19. Chen, S. -Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
  20. Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
  21. Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
  22. Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
  23. Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
  24. Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
  25. Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
  26. Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281(2019).
  27. Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602(2013).
  28. Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
  29. Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198(2021).
  30. Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
  31. Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045(2022).
  32. Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
  33. Chao, H. -P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Bisulfiet RNA sequencingRNA methylering5 methylcytosine modificatieRNA methyltransferasePoly A RNA zuiveringcytosine methyleringRNA integriteitpancreaskanker
Verrijking van mRNA en bisulfiet-mRNA-bibliotheekvoorbereiding voor sequencing van de volgende generatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.