Methodenartikel

Opstelling en bevestiging van een postnataal muismodel met overbelasting van het rechterventrikelvolume

DOI:

10.3791/65372

⸱

9 juni 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Intensive Care Unit, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Shanghai Children’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 3Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Shanghai Ninth People’s Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 4Department of Radiology, Huangpu Branch, Shanghai Ninth People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Institute of Pediatric Translational Medicine, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, 6Shanghai Institute for Pediatric Congenital Heart Disease, Shanghai Children’s Medical Center, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert de opstelling en bevestiging van een postnataal rechterventrikelvolume-overbelasting (VO)-model bij muizen met abdominale arterioveneuze fistel (AVF), dat kan worden toegepast om te onderzoeken hoe VO bijdraagt aan de postnatale hartontwikkeling.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rechterventrikel (RV) volumeoverbelasting (VO) komt vaak voor bij kinderen met een aangeboren hartafwijking. Met het oog op verschillende ontwikkelingsstadia kan het RV-myocardium anders reageren op VO bij kinderen dan bij volwassenen. De huidige studie heeft tot doel een postnataal RV VO-model op te stellen bij muizen met behulp van een gemodificeerde abdominale arterioveneuze fistel. Om de aanmaak van VO en de volgende morfologische en hemodynamische veranderingen van de RV te bevestigen, werden gedurende 3 maanden abdominale echografie, echocardiografie en histochemische kleuring uitgevoerd. Als gevolg hiervan vertoonde de procedure bij postnatale muizen een acceptabele overleving en slagingspercentage van fistels. Bij VO-muizen werd de RV-holte vergroot met een verdikte vrije wand en werd het slagvolume binnen 2 maanden na de operatie met ongeveer 30%-40% verhoogd. Daarna nam de systolische druk van RV toe, werd overeenkomstige longklepregurgitatie waargenomen en trad kleine remodellering van de longslagader op. Concluderend is gemodificeerde arterioveneuze fistelchirurgie (AVF) haalbaar om het RV VO-model bij postnatale muizen vast te stellen. Gezien de waarschijnlijkheid van fistelsluiting en verhoogde weerstand van de longslagader, moeten echografie van de buik en echocardiografie worden uitgevoerd om de modelstatus vóór toepassing te bevestigen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volumeoverbelasting (VO) van het rechterventrikel (RV) komt vaak voor bij kinderen met een aangeboren hartafwijking (CHD), wat leidt tot pathologische myocardiale remodellering en een slechte prognose op lange termijn 1,2,3. Een diepgaand begrip van RV-remodellering en gerelateerde vroege gerichte interventies is essentieel voor een goed resultaat bij kinderen met CHD. Er zijn verschillende verschillen in de moleculaire structuren, fysiologische functies en reacties op stimuli in de harten van volwassenen en kinderen 1,4,5,6. Onder invloed van drukoverbelasting is de proliferatie van cardiomyocyten bijvoorbeeld de belangrijkste reactie in neonatale harten, terwijl fibrose optreedt in volwassen harten 5,6. Bovendien hebben veel effectieve geneesmiddelen bij de behandeling van hartfalen bij volwassenen geen therapeutisch effect op hartfalen bij kinderen en kunnen ze zelfs verdere schade veroorzaken 7,8. Daarom kunnen conclusies van volwassen dieren niet rechtstreeks worden toegepast op jonge dieren.

Het arterioveneuze fistelmodel (AVF) wordt al tientallen jaren gebruikt om chronische hart-VO en bijbehorende hartdisfunctie te induceren bij volwassen dieren van verschillende soorten 9,10,11,12,13. Er is echter weinig bekend over het model bij postnatale muizen. In onze eerdere studies werd met succes een VO postnataal muismodel gegenereerd door het maken van een abdominale AVF. Het veranderde RV-ontwikkelingstraject in het postnatale hart werd ook aangetoond14,15,16,17.

Om het onderliggende gemodificeerde chirurgische proces en de kenmerken van het huidige model te onderzoeken, wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd; Het model wordt in deze studie gedurende 3 maanden geëvalueerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier gepresenteerde procedures voldeden aan de principes die zijn uiteengezet in de Verklaring van Helsinki en zijn goedgekeurd door de Commissie voor dierenwelzijn en menselijke studies van het Shanghai Children's Medical Center (SCMC-LAWEC-2023-003). C57BL/6 muizenjongen (P7, mannetjes, 3-4 g) werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel). De muizenpups en hun zogende moeders (pups:moeders = 6:1 in een enkele kooi) werden gehouden onder specifieke pathogeenvrije laboratoriumomstandigheden onder een licht- en donkercyclus van 12 uur bij 22 ± 2 °C met vrije toegang tot water en een voedingsdieet. De pups werden gerandomiseerd in twee groepen: een VO-groep en een schijn-geopereerde (schijn) groep.

1. Voorbereiding van apparatuur en chirurgisch gereedschap

OPMERKING: De commerciële details van alle materialen/apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

  1. Zorg ervoor dat de volgende soorten apparatuur klaar zijn en goed functioneren: operatietafel (schuimplastic paneel), inhalatie-anesthesieapparaat, microscoop met verticale verlichting en een ingebouwde camera, ultrasoon apparaat met een 24 MHz-transducer en thermostatisch verwarmingsplatform.
  2. Steriliseer de chirurgische instrumenten (d.w.z. een micronaaldhouder, een pincet met fijne punt en een Vannas-veerschaar met ronde handgreep).
  3. Monteer de volgende verbruiksartikelen: 11-0 en 9-0 chirurgische hechtnaalden (taps toelopend punt) met draad, tapestrips, spuitnaalden van 5 ml, 2-0 zijde (chirurgische fixatie), steriele wattenstaafjes en ultrasone gel.
  4. Zorg ervoor dat de volgende reagentia aanwezig zijn: Betadine, 70% ethanol, normale steriele zoutoplossing, isofluraan, paracetamol, oogzalf en ontharingscrème.

2. Chirurgische ingreep

OPMERKING: De procedure voor een fisteloperatie is aangepast volgens de eerder beschreven methode11. Figuur 1 toont een schematisch diagram van de AVF-werking bij postnatale muizen.

  1. Anesthesie en fixatie
    1. Plaats de muizenpups gedurende 2 minuten in een anesthesie-inductiebox die wordt geleverd met 2% isofluraan/zuurstof met een debiet ingesteld op 1 l/min. Dien paracetamol (0,1 ml oraal van 80 mg/2,5 ml) toe met behulp van een tbc-spuit.
    2. Plaats de pups in rugligging op de operatietafel met neusinhalatie van 1,5% isofluraan met een stroom van 0,8 l/min om de anesthesie te behouden. Pas de positie van de pup aan door de poten vast te binden aan de vaste spuitnaalden. Breng oogzalf aan op de ogen van de pups om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
    3. Knijp in de staart van de verdoofde pup om zijn pijnresponsiviteit te controleren; Geen duidelijke lichaamsbewegingen duiden op adequate anesthesie.
  2. Fisteloperatie
    1. Desinfecteer de huid met drie afwisselende scrubs van betadine en 70% ethanol en drapeer vervolgens de operatieplaats. Snijd de buikwand en het buikvlies van de onderbuik naar de subxiphoid om de buikholte volledig bloot te leggen, en zorg ervoor dat u de buikorganen niet verwondt. Druppel normale steriele zoutoplossing om uitwendige organen te bevochtigen.
    2. Trek het maagdarmkanaal en de blaas voorzichtig weg van de operatieplaats met wattenstaafjes om de verticale abdominale aorta (AA) en inferieure vena cava (IVC) onder het retroperitoneum te visualiseren. Draai de operatietafel 90° tegen de klok in en pas de vergroting van de microscoop aan om de twee horizontale vaten duidelijk te visualiseren.
    3. Prik de fistel van de AA in de IVC in een schuine richting 1 cm distaal van de nierslagader met een 11-0 hechtnaald (diameter = 0,07 mm). Controleer de succesvolle aanmaak van fistels op basis van de zwelling en vermenging van veneus en arterieel bloed in de IVC.
    4. Druk vervolgens het bloedingspunt snel samen met een geschikte kracht die gedurende 15 seconden wordt uitgeoefend met droge wattenstaafjes. Vervang de maag, darmen en blaas in de buikholte zo snel mogelijk om hemostatische compressie te bevorderen.
    5. Hecht de buikwand en het buikvlies met een dekensteek met een 9-0 hechtdraad. Stop met de anesthesie en geef de pups 1 minuut lang 100% zuurstof.
  3. Anesthesie reanimatie
    1. Plaats de jongen op een verwarmingsplatform van 38 °C. Na een volledig ontwaken met vitaliteit, breng je de pups terug naar hun zogende moeder. De hele procedure duurt ongeveer 15 minuten.
      OPMERKING: In de huidige studie ondergaat de schijngroep dezelfde procedure, behalve voor de punctuurstap.

3. Echografie bevestiging van fistel

OPMERKING: De algemene werking van het ultrasone apparaat was identiek aan eerdere rapporten18,19.

  1. Bevestiging van fistel door echografie van de buik
    1. Na inductie van anesthesie (stap 2.1.1), fixeert u de muizen met tapestrips in rugligging op het warme platform. Sluit de muizen vervolgens aan op een elektrocardiogram (ECG) monitor met ultrasone gel. Handhaaf de anesthesie met 1,5% isofluraan bij een stroom van 0,8 l/min.
    2. Bereid de borst- en buikhuid voor met ontharingscrème. Verwijder na een paar seconden de crème met een in warm water gedrenkt wattenstaafje. Plaats de transducer (24 MHz) op de middenbuiklijn en draai de transducermarker naar de kop van de muizen.
    3. Verplaats het platform naar de linker- of rechterkant van de muizen en gebruik de B-modus en de kleuren-Doppler-modus om het lange-asbeeld van de bloedvaten en bloedsignalen te visualiseren18,19. Meet de bloedstroomsnelheid van de AA, IVC en fistel om de doorgankelijkheid van AVF te bevestigen via de Doppler-modus met gepulseerde golven.
      OPMERKING: Succesvolle fistelvorming op de echografie werd aangegeven door een turbulent stromingssignaal dat zichtbaar was tussen de AA en IVC (Figuur 2C). De Doppler-bloedstroomsnelheid op de AVF-plaats was significant verhoogd in vergelijking met een relatief lagere systolische snelheid in de AA (Figuur 2A,C). Bovendien, in tegenstelling tot normale stroompatronen in de IVC (Figuur 2B), bevestigde de pulserende golfvorm van de IVC-bloedstroom proximaal van de AVF ook de succesvolle creatie van de fistel (Figuur 2D).
  2. Bevestiging van VO door echocardiografie
    1. Beweeg het staartgedeelte van het platform naar beneden, plaats de transducer (24 MHz) op de borst en draai de transducermarkering naar de rechterschouder van de muizen. Visualiseer de gewijzigde parasternale lange-asweergave van de longslagader (PA) met behulp van de B-modus en de kleuren-Doppler-modus.
    2. Meet met behulp van de Doppler-modus met gepulseerde golven de bloedstroomsignalen in de PA, inclusief de snelheidstijdintegraal (PA-VTI), diameter van de PA-klep (PAD), pulmonale arteriële versnellingstijd (PAT) en RV-ejectietijd (RVET) (Figuur 2E,F en Figuur 3A,B).
    3. Meet de ultrasone parameters vanaf het gemiddelde van drie opeenvolgende metingen. Bereken het RV-slagvolume (RVSV, ml) en de RV-systolische druk (RVSP, mmHg) met behulp van de volgende formules20:
      RVSV [ml] = 1/4 × πD2 × VTIPA
      RVSP [mmHg] = -83,7 × PAT/RVET - index + 63,7
      OPMERKING: Rekening houdend met de ultrasone meetbias, werd een toename van >15% in de RVSV of VTIPA bij VO-muizen in vergelijking met muizen in de schijngroep beschouwd als VO in de RV (Figuur 2E,F).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Overlevingspercentage en AVF-doorgankelijkheid binnen 3 maanden
In totaal overleefden 30 (75%) muizen in de VO-groep en 19 (95%) muizen in de schijngroep de AVF-operatie (Figuur 4A). In de VO-groep stierven acht muizen binnen 1 dag na de operatie als gevolg van overmatig bloeden (n = 5) of kannibalisatie (n = 3), terwijl twee muizen na 1 maand stierven aan onbekende oorzaken.

Van de overlevende VO-muizen (n = 30) bevestigde echografie de succes...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voorheen werd het klassieke RV VO-model gemaakt met behulp van klepregurgitatie21; in vergelijking met AVF kan openhartklepchirurgie echter meer geavanceerde technieken vereisen en kan het in verband worden gebracht met een aanzienlijk hogere mortaliteit, vooral bij postnatale muizen. Omdat dierstudies hebben aangetoond dat hetzelfde effect van VO is bereikt door AVF22, werd in deze studie een aangepaste abdominale fisteloperatie met minder trauma gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation of China (nr. 82200309) en het Innovation Project of Distinguished Medical Team in Ningbo (nr. 2022020405)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
70% EthanolTiandz,Chia
ACETAMINOPHEN Oral SolutionVistaPharm, Inc. Largo, FL 33771, USANDC 66689-054-01
Anesthesia machineRWD Life Science,ChinaR550IP
Anesthesia maskRWD Life Science,China68680
C57BL/6 miceXipu’er-bikai Experimental Animal Co., Ltd (Shanghai, China)
Hair removal creamVeet, FranceVT-200
Hematoxylin and eosin Kit Beyotime biotech C0105M 
IsofluraneRWD Life Science,ChinaR510-22-10
Microscope Yuyan Instruments, ChinaSM-301
Surgical suture needlesNINGBO MEDICAL NEEDLE CO.,LTD, China
Thermostatic heating platformQingdao Juchuang Environmental Protection Group Co., Ltd, China
Ultrasound deviceFUJIFILM VisualSonics, Inc.Vevo 2100Beeldmodi omvatten B-Modus, Color Doppler Modus en Pulsed Wave Doppler Modus
Ultrasound gelParker Laboratories,United StatesREF 01-08
Ultrasound transducerFUJIFILM VisualSonics, Inc.MS 400

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sanz, J., Sanchez-Quintana, D., Bossone, E., Bogaard, H. J., Naeije, R. Anatomy, function, and dysfunction of the right ventricle: JACC state-of-the-art review. Journal of the American College of Cardiology. 73 (12), 1463-1482 (2019).
  2. Alonso-Gonzalez, R., Dimopoulos, K., Ho, S., Oliver, J. M., Gatzoulis, M. A. The right heart and pulmonary circulation (IX). The right heart in adults with congenital heart disease. Revista Española de Cardiología. 63 (9), 1070-1086 (2010).
  3. Kovacs, A., Lakatos, B., Tokodi, M., Merkely, B. Right ventricular mechanical pattern in health and disease: beyond longitudinal shortening. Heart Failure Reviews. 24 (4), 511-520 (2019).
  4. Ye, L., et al. Role of blood oxygen saturation during postnatal human cardiomyocyte cell cycle activities. JACC: Basic to Translational Science. 5 (5), 447-460 (2020).
  5. Ye, L., et al. Pressure overload greatly promotes neonatal right ventricular cardiomyocyte proliferation: a new model for the study of heart regeneration. Journal of the American Heart Association. 9 (11), e015574(2020).
  6. Geraets, I. M. E., Glatz, J. F. C., Luiken, J., Nabben, M. Pivotal role of membrane substrate transporters on the metabolic alterations in the pressure-overloaded heart. Cardiovascular Research. 115 (6), 1000-1012 (2019).
  7. Burns, K. M., et al. New mechanistic and therapeutic targets for pediatric heart failure: report from a National Heart, Lung, and Blood Institute working group. Circulation. 130 (1), 79-86 (2014).
  8. Shaddy, R. E., et al. Carvedilol for children and adolescents with heart failure: a randomized controlled trial. Journal of the American Medical Association. 298 (10), 1171-1179 (2007).
  9. Flaim, S. F., Minteer, W. J., Nellis, S. H., Clark, D. P. Chronic arteriovenous shunt: evaluation of a model for heart failure in rat. American Journal of Physiology. 236 (5), H698-H704 (1979).
  10. Liu, Z., Hilbelink, D. R., Crockett, W. B., Gerdes, A. M. Regional changes in hemodynamics and cardiac myocyte size in rats with aortocaval fistulas. 1. Developing and established hypertrophy. Circulation Research. 69 (1), 52-58 (1991).
  11. Scheuermann-Freestone, M., et al. A new model of congestive heart failure in the mouse due to chronic volume overload. European Journal of Heart Failure. 3 (5), 535-543 (2001).
  12. Du, Y., Plante, E., Janicki, J. S., Brower, G. L. Temporal evaluation of cardiac myocyte hypertrophy and hyperplasia in male rats secondary to chronic volume overload. The American Journal of Pathology. 177 (3), 1155-1163 (2010).
  13. Wu, J., Luo, X., Huang, Y., He, Y., Li, Z. Hemodynamics and right-ventricle functional characteristics of a swine carotid artery-jugular vein shunt model of pulmonary arterial hypertension: An 18-month experimental study. Experimental Biology and Medicine. 240 (10), 1362-1372 (2015).
  14. Sun, S., et al. Postnatal right ventricular developmental track changed by volume overload. Journal of the American Heart Association. 10 (16), e020854(2021).
  15. Wang, S., et al. Metabolic maturation during postnatal right ventricular development switches to heart-contraction regulation due to volume overload. Journal of Cardiology. 79 (1), 110-120 (2022).
  16. Zhou, C., et al. Downregulated developmental processes in the postnatal right ventricle under the influence of a volume overload. Cell Death Discovery. 7 (1), 208(2021).
  17. Cui, Q., et al. Volume overload initiates an immune response in the right ventricle at the neonatal stage. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 772336(2021).
  18. Cheng, H. W., et al. Assessment of right ventricular structure and function in mouse model of pulmonary artery constriction by transthoracic echocardiography. Journal of Visualized Experiments. (84), e51041(2014).
  19. Sawada, H., et al. Ultrasound imaging of the thoracic and abdominal aorta in mice to determine aneurysm dimensions. Journal of Visualized Experiments. (145), e59013(2019).
  20. Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (2), 157-163 (2010).
  21. Mori, Y., et al. A new dynamic three-dimensional digital color doppler method for quantification of pulmonary regurgitation: validation study in an animal model. Journal of the American College of Cardiology. 40 (6), 1179-1185 (2002).
  22. Bossers, G. P. L., et al. Volume load-induced right ventricular dysfunction in animal models: insights in a translational gap in congenital heart disease. European Journal of Heart Failure. 20 (4), 808-812 (2018).
  23. Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), H1718-H1725 (2013).
  24. Jouannic, J. M., et al. The effect of a systemic arteriovenous fistula on the pulmonary arterial blood pressure in the fetal sheep. Prenatal Diagnosis. 22 (1), 48-51 (2002).
  25. Jouannic, J. M., et al. Systemic arteriovenous fistula leads to pulmonary artery remodeling and abnormal vasoreactivity in the fetal lamb. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (3), L701-L709 (2003).
  26. Patel, M. D., et al. Echocardiographic assessment of right ventricular afterload in preterm infants: maturational patterns of pulmonary artery acceleration time over the first year of age and implications for pulmonary hypertension. Journal of the American Society of Echocardiography. 32 (7), 884-894 (2019).
  27. Habash, S., et al. Normal values of the pulmonary artery acceleration time (PAAT) and the right ventricular ejection time (RVET) in children and adolescents and the impact of the PAAT/RVET-index in the assessment of pulmonary hypertension. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 35 (2), 295-306 (2019).
  28. Arkles, J. S., et al. Shape of the right ventricular Doppler envelope predicts hemodynamics and right heart function in pulmonary hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 183 (2), 268-276 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Right Ventricular OverloadArteriovenous FistulaPostnatal Mouse ModelCongenital Heart DiseaseAbdominal UltrasoundEchocardiographyHemodynamic ChangesPulmonary Artery RemodelingHistochemical StainingStroke Volume

Gerelateerde artikelen