Meting van O2-verbruik in Drosophila melanogaster met behulp van coulometrische microrespirometrie

Samenvatting

Coulometrische respirometrie is ideaal voor het meten van de stofwisseling van kleine organismen. Bij correctie voor Drosophila melanogaster in de huidige studie lag de gemeten O_2-consumptie binnen het bereik dat in eerdere studies werd gerapporteerd voor wildtype D. melanogaster. Het verbruik van O₂ per vlieg door vatmutanten , die kleiner en minder actief zijn, was significant lager dan bij het wildtype.

Samenvatting

Coulometrische microrespirometrie is een eenvoudige, goedkope methode om het_O2-verbruik van kleine organismen te meten met behoud van een stabiele omgeving. Een coulometrische microrespirometer bestaat uit een luchtdichte kamer waarin O 2 wordt verbruikt en de door het organisme geproduceerde CO₂ wordt verwijderd door een absorberend medium. De resulterende drukverlaging activeert de elektrolytische O2-productie en de hoeveelheid geproduceerde_O2 wordt gemeten door de hoeveelheid lading te registreren die wordt gebruikt om deze te genereren. In de huidige studie is de methode aangepast aan Drosophila melanogaster getest in kleine groepen, waarbij de gevoeligheid van het apparaat en de omgevingsomstandigheden zijn geoptimaliseerd voor hoge stabiliteit. De hoeveelheid O₂ die door wildtype vliegen in dit apparaat wordt geconsumeerd, komt overeen met die gemeten door eerdere studies. De massaspecifieke_{O2-consumptie} door vatmutanten, die kleiner zijn en waarvan bekend is dat ze minder actief zijn, verschilde niet van die van congene controles. De kleine omvang van de vatmutanten resulteerde echter in een aanzienlijke vermindering van het_O2-verbruik per vlieg. Daarom is de microrespirometer in staat om het_O2-verbruik in D. melanogaster te meten, bescheiden verschillen tussen genotypen te onderscheiden en een veelzijdig hulpmiddel toe te voegen voor het meten van stofwisselingssnelheden.

Inleiding

Het vermogen om de stofwisseling te meten is cruciaal voor een volledig begrip van een organisme in zijn omgevingscontext. Het is bijvoorbeeld noodzakelijk om de stofwisseling te meten om de rol ervan in levensduur¹, de rol van voeding in het metabolisme² of de drempel voor hypoxische stress³ te begrijpen.

Er zijn twee algemene benaderingen voor het meten van de stofwisseling⁴. Directe calorimetrie meet het energieverbruik rechtstreeks door de warmteproductie te meten. Indirecte calorimetrie meet de energieproductie op andere manieren, vaak via respirometrische meting van het O2-verbruik (V_O2), de CO₂ -productie of beide. Hoewel directe calorimetrie is toegepast op kleine ectothermen, waaronder Drosophila melanogaster⁵, is respirometrie technisch eenvoudiger en wordt het vaker gebruikt.

Verschillende vormen van respirometrie zijn met succes gebruikt om de stofwisseling te meten bij wildtype en mutant D. melanogaster en hebben inzicht gegeven in de metabole effecten van temperatuur⁶, sociale omgeving 3, voeding ^{3,7 en} neurologische ontwikkelingsstoornissen⁸. Deze vallen uiteen in twee klassen, die aanzienlijk variëren in kosten en complexiteit. Manometrie is de eenvoudigste en goedkoopste^9,10, waarbij vliegen in een afgesloten kamer worden geplaatst die een CO₂ -absorberend middel bevat en die via een dun capillair is verbonden met een vloeistofreservoir. Naarmate O 2 wordt verbruikt en CO₂ wordt geabsorbeerd, neemt de druk in de kamer af en wordt vloeistof in het capillair gezogen. Het met vloeistof gevulde volume van het capillair is daarom evenredig met V_O2. Meer uitgebreide versies, die de kracht compenseren die door de vloeistof in het capillair wordt uitgeoefend, zijn ook gebruikt op D. melanogaster¹. Manometrie heeft het voordeel dat het eenvoudig en goedkoop is, maar omdat het gevoelig is voor druk, vereist het constante omgevingsomstandigheden. Verder, omdat verbruikt O 2 niet wordt vervangen, neemt de partiële druk van O₂ (P_O2) geleidelijk af in de kamers.

Respirometrie met behulp van gasanalyse wordt ook regelmatig gebruikt voor D. melanogaster. In dit geval worden met regelmatige tussenpozen gassen bemonsterd uit afgesloten kamers met vliegen en naar een infraroodanalysator 2,6,11 gestuurd. Dit type apparaat heeft als voordeel dat het in de handel verkrijgbaar is, minder gevoelig is voor omgevingsomstandigheden en dat gassen tijdens de bemonstering worden ververst, zodat P_O2 stabiel blijft. De apparatuur kan echter duur en complex zijn om te bedienen.

Een recent ontwikkelde coulometrische microrespirometer¹² biedt een goedkoop, gevoelig en stabiel alternatief voor bestaande systemen. In de praktijk wordt een organisme in een luchtdichte kamer geplaatst waar het O 2 verbruikt en de uitgeademde CO₂ wordt verwijderd door een absorberend materiaal, wat resulteert in een netto afname van de kamerdruk. Wanneer de interne druk daalt tot een vooraf ingestelde drempel (AAN-drempel), wordt stroom door een elektrolytische O_2-generator geleid, waardoor de druk wordt teruggevoerd naar een tweede drempel (UIT-drempel), waardoor de elektrolyse wordt gestopt. De ladingsoverdracht over de O 2-generator is recht evenredig met de hoeveelheid O 2 die nodig is om de kamer opnieuw onder druk te brengen en kan daarom worden gebruikt om de O₂ te meten die door het organisme wordt verbruikt⁴. De methode is zeer gevoelig, meet V O2 nauwkeurig en de regelmatige vervanging van O₂ kan P_O2 uren of dagen op een bijna constant niveau houden.

De coulometrische microrespirometer die in dit onderzoek wordt gebruikt, maakt gebruik van een multimodale (druk, temperatuur en vochtigheid) elektronische sensor. De sensor wordt bediend door een microcontroller die kleine drukveranderingen detecteert en O_2-generatie activeert wanneer een lagedrukdrempel¹² wordt bereikt. Dit apparaat is samengesteld uit kant-en-klare onderdelen, kan worden gebruikt met een breed scala aan kamers en experimentele omgevingen, en is met succes gebruikt om de effecten van lichaamsgewicht en temperatuur op de kever Tenebrio molitor te onderzoeken. In de huidige studie is de microrespirometer aangepast om het_O2-verbruik te meten in D. melanogaster, dat ongeveer 1% van de massa van T. molitor heeft. De gevoeligheid van het apparaat is verhoogd door de drempel voor het activeren van O_2-opwekking te verlagen, en de stabiliteit van het milieu is verbeterd door experimenten uit te voeren in een temperatuurgecontroleerd waterbad en door de luchtvochtigheid in de kamers op of in de buurt van 100% te houden.

Het CASK (Calmodulin-dependent Serine Protein Kinase) eiwit, onderdeel van de familie van membraan-geassocieerde guanylaatkinasen (MAGUK), is een moleculair steiger in verschillende multi-eiwitcomplexen, en mutaties in CASK zijn geassocieerd met neurologische ontwikkelingsstoornissen bij mensen en bij D. melanogaster^13,14. Een levensvatbare D. melanogaster-mutant, CASK^Δ18, verstoort de activiteit van dopaminerge neuronen 15 en vermindert de activiteitsniveaus met meer dan 50% in vergelijking met congene controles^14,16. Vanwege de verminderde activiteitsniveaus van CASK mutanten en de rol van catecholamines bij het reguleren van het metabolisme¹⁷ veronderstelden we dat hun standaard stofwisseling, en dus O₂ consumptie, drastisch zou worden verminderd in vergelijking met controles.

O₂ consumptie werd gemeten in CASK^Δ18 en hun wildtype congeneren, w(ex33). Groepen vliegen werden in respirometriekamers geplaatst, het O 2-verbruik werd gemeten, het O_2-verbruik werd berekend en uitgedrukt op zowel massaspecifieke basis als per vlieg. Het apparaat registreerde V_O2 in wildtype vliegen, wat consistent was met eerdere studies, en het kon onderscheid maken tussen de O_2-consumptie per vlieg van wildtype en CASK mutante vliegen.

Protocol

1. Vliegenopfok en -verzameling

1. Houd vliegen bij 25 °C in smalle injectieflacons met standaard Drosophila-voer .
   OPMERKING: De steekproefomvang voor elk genotype moet ten minste negen replicaten omvatten, elk bestaande uit een enkele respirometerkamer met 15-25 vliegen, opgesteld zoals hieronder beschreven.
2. Breng de vliegen elke 2-3 dagen over.
3. Verdoof vliegen met CO₂, verzamel groepen van 15-25 mannetjes van elk genotype en plaats elke groep in verse, niet-gegiste voedselflesjes.
   OPMERKING: Mannetjes werden gebruikt om de variabiliteit als gevolg van de voortplantingsstatus te verminderen. De methode is van toepassing op beide geslachten.
4. Laat de vliegen minimaal 24 uur herstellen bij 25 °C.
   OPMERKING: Tegen de tijd van het experiment moeten vliegen 1-4 dagen oud zijn. De frequentie van het verzamelen zoals beschreven in stap 1.3 kan worden ingesteld om de leeftijdscategorie van de vliegen te verkleinen.

2. Opstelling en montage van de respirometerkamer

1. Zet het waterbad aan en stel het in op de gewenste temperatuur voor het experiment.
   OPMERKING: De onderstaande experimenten werden uitgevoerd bij 25 °C met 50 ml Schlenk-buizen als kamers. Componenten moeten worden gemonteerd zoals weergegeven in afbeeldingen 1A, 1B en 1C.
2. Reinig de geslepen glasverbindingen van kamers en sensorpluggen grondig door 70% ethanol op een laboratoriumdoekje te spuiten (niet rechtstreeks op de verbinding) en stof en oud vet van de sensorstekker te vegen (Figuur 1A). Veeg ethanol weg met een nieuw laboratoriumdoekje.
3. Leg een stuk wattenrol van 1 cm gedrenkt in gezuiverd water op de bodem van de kamer om de luchtvochtigheid te stabiliseren.
   1. Voeg voldoende water toe (~0,5 ml) om een kleine plas op de bodem van de wattenrol te vormen.
4. Veeg al het water weg dat op de verbinding van de kamer is gemorst.
5. Breng de vliegen over naar geëtiketteerde polypropyleen buizen met behulp van een trechter.
   1. Sluit de buis af met een wattenbroodje.
      OPMERKING: De buisjes bestaan uit een reageerbuis van 5 ml polypropyleen, op 5,5 cm lengte geknipt en geperforeerd met een heet mes om de vrije uitwisseling van lucht met de experimentele kamer mogelijk te maken. Van CO₂ -anesthesie is bekend dat het metabole afwijkingen veroorzaakt, dus vliegen worden zonder verdoving overgebracht, wat meer zorg vereist om te voorkomen dat de vliegen verloren gaan.
6. Voeg een geventileerde buis met vliegen toe aan elke ademhalingsmeterkamer (bovenop nat katoen).
7. Vul natronkalkpatronen (4-5 pellets per buis) en plaats ze op de bovenkant van de buis met vliegen in de kamer.
   OPMERKING: Soda lime-patronen bestaan uit centrifugebuisjes van 800 μL die 4-5 keer zijn geperforeerd met een boormachine.
8. Vul O_{2-generatoren} met een oplossing van verzadigd kopersulfaat (CuSO₄) onder het niveau van de ontluchtingsgaten
   OPMERKING: O₂ generatoren bestaan uit centrifugebuisjes met schroefdop en 4 gaten die onder de schroefdraad zijn geboord. Platina (Pt) en koper (Cu) elektroden worden gesoldeerd aan een tweepolige connector, in gaten gestoken die in de dop zijn geboord en bevestigd met epoxy. Elektrolyse van CuSO₄ genereert de O₂ die door het experimentele organisme wordt verbruikt. CuSO₄ is giftig voor ongewervelde dieren, vermijd morsen of lekken en ruim onmiddellijk op.
9. Sluit de gevulde O_2-generator aan op de tweepolige connector op de sensorstekker.
   NOTITIE: De koperen kathode moet worden aangesloten op de negatieve uitgang van de controller en de platina-anode op de positieve draad. Omgekeerde verbindingen zullen het mislukken van het experiment veroorzaken.
10. Plaats twee kleine klodders helder siliconenvet aan weerszijden van de geslepen glasverbinding van de sensorstekker.
11. Steek de plug in de kamer en draai de plug (of kamer) met matige druk om het vet in de verbinding te verspreiden.
    1. Veeg overtollig vet weg met een laboratoriumdoekje.
12. Klik plastic Keck-klemmen op verbindingen om pluggen in kamers vast te zetten. De geassembleerde kamer moet eruit zien als figuur 1C.
13. Herhaal de bovenstaande stappen voor het aantal kamers dat wordt gebruikt voor het experiment van de dag.
    OPMERKING: Het aantal kamers dat kan worden opgenomen, wordt beperkt door het aantal beschikbare kamers, controllers en USB-ingangen voor de computer. Voor de huidige experimenten werden gewoonlijk zeven kamers parallel gedraaid. Experimentele vliegen, zoals mutanten, moeten worden gekoppeld aan passende controles. In elk experiment moet een kamer worden opgenomen die identiek is opgezet, maar zonder vliegen, als controle op omgevingsvariatie. Kamers met verschillende behandelingen (mutant, wildtype, no-fly) moeten tussen de experimenten worden afgewisseld.
14. Plaats de geassembleerde kamers in een rek in het waterbad met de kranen open (Figuur 1E).
    OPMERKING: Om circadiane variatie te voorkomen, werden tussen 9.30 en 9.50 uur kamers in het bad geplaatst voor alle hier beschreven experimenten.
15. Laat de kranen open (houd de hendel evenwijdig aan de kraan).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen water in de kranen komt.
16. Laat de kamers ongeveer 30 minuten in evenwicht zijn met de kranen open.
    NOTITIE: Terwijl de kamer in evenwicht is, sluit u de elektronica aan en stelt u de gegevensverzameling in zoals hieronder beschreven.

3. Controllers en computer instellen

1. Zorg ervoor dat de schakelaars die stroom leveren aan de O_{2-generatoren} in de UIT-stand staan (weg van de connector; Figuur 1D).
2. Sluit elke controllerbox aan op een beschikbare USB-poort (Universal Serial Bus).
   OPMERKING: Constructie en programmering van de elders beschreven besturingseenheden¹².
3. Sluit controllers aan op ademhalingsmeterkamers met behulp van 6-aderige kabels.
4. Controleer of de displays van de OLED-displays (Organic Light Emitting Diode) van de controllers (Afbeelding 1D) omgevingsparameters weergeven.
5. Schakel de O_{2-generatoren} kort in met de schakelaar op de regelaar (Figuur 1D).
   1. Als de stroomwaarde stijgt van nul naar tussen 35 en 55 mA, zijn de controller en de kamer klaar voor experimenten.
6. Bepaal welke COM-poorten worden gebruikt door de controllers, zoals hieronder beschreven.,
   1. Klik op het Start-pictogram in Microsoft Windows.
   2. Klik op het pictogram Instellingen .
   3. Klik op Bluetooth en apparaten.
   4. Zorg ervoor dat de controllers en hun COM-poorten in de lijst met apparaten worden weergegeven.
7. Open PuTTY op het bureaublad en stel een logbestand in voor elk kanaal van de respirometer zoals hieronder beschreven.
   OPMERKING: PuTTY is een gratis beveiligde shell en telnet-client die wordt gebruikt om gegevens via COM-poorten naar de computer over te brengen.
   1. Selecteer de COM-poort voor een controller door het nummer van de poort in het vak "Seriële lijn" te typen (Figuur 2A).
   2. Klik op Logging.
   3. Selecteer Afdrukbare uitvoer in "Sessieregistratie" (Afbeelding 2B).
   4. Klik onder Bestandsnaam logboekbestand op Bladeren.
   5. Maak in de map van de keuze een bestandsnaam aan met beschrijvende informatie (bijv. datum, soort, COM-poortnummer).
   6. Klik op Opslaan.
   7. Klik op Openen. Er wordt een venster geopend met door komma's gescheiden gegevens die worden geregistreerd (Figuur 2C).
   8. Herhaal dit voor alle andere controllers die voor het experiment worden gebruikt. De invoer van elke COM-poort verschijnt als een apart venster (Figuur 2D).

4. Experimenten uitvoeren

1. Zodra de kamers gedurende 30 minuten in evenwicht zijn, sluit u ze af door de kranen te sluiten.
2. Bedek het bad en de kamers met een doos van polystyreenschuim om een stabiele omgeving te behouden.
3. Laat nog een uur balanceren.
4. Schakel de stroom naar de O_2-generator van elke kamer in met behulp van de schakelaar op de controllerbox.
5. Zodra de O_{2-generatoren} zijn geactiveerd, moet u ervoor zorgen dat de druk toeneemt tot de vooraf ingestelde UIT-druk.
   OPMERKING: 1017 hPa, wat iets boven de atmosferische druk ligt, werd gebruikt als de "UIT"-druk in deze reeks experimenten. Terugkeer naar de omgevingsdruk duidt op lekkage van gas uit de kamers. Verder maakt het het mogelijk om dezelfde druk te gebruiken in alle experimenten, ongeacht de luchtdruk in de omgeving. De "AAN"-druk was 1016 hPa, wat betekent dat de druk slechts 1 hPa hoefde te dalen voordat de O_2-generator werd geactiveerd. Dit leverde voldoende gevoeligheid op om de_{O2-consumptie} in Drosophila te meten. Zodra een kamer onder druk staat op de "UIT"-instelling, moet de stroom tot nul dalen.
6. Laat het experiment 3 uur of langer lopen.
   OPMERKING: Een hogere V_O2 bij verhoogde temperaturen kan zorgen voor kortere experimenttijden. Controleer af en toe om er zeker van te zijn dat de apparatuur werkt, maar vermijd overmatige activiteit in de buurt van de kamers die de temperatuurstabiliteit kunnen beïnvloeden.

5. Experiment afronden

1. Schakel O_{2-generatoren} op alle controllers uit.
   NOTITIE: Doe eerst om te voorkomen dat de O_{2-generatoren} draaien terwijl de kamers open zijn.
2. Open de kranen om de kamers te ontzegelen.
3. Laat de PuTTY-vensters nog 5-15 minuten open om een definitieve basislijn te geven.
4. Sluit het PuTTY-venster voor elke controller en beëindig de opnames.
   OPMERKING: Alle experimenten eindigden tussen 16.50 en 17.10 uur.
5. Koppel de sensoren los van de kabels.
6. Verplaats de kamers naar het droogrek.
7. Verwijder de sensorstekkers één voor één uit de kamers.
8. Koppel de O₂ generatoren los en plaats ze in het buizenrek.
9. Veeg het vet van de sensorstekker en bewaar deze in het rek.
10. Verwijder vet van kamerverbindingen en verwijder buizen met vliegen en natronkalk.
11. Verdoofvliegen in elke buis met CO_2, tik op een gewichtsboot en weeg op een microbalans.
    1. Registreer het gewicht en het aantal vliegen voor elke buis.
12. Gooi vliegen weg of leg ze opzij voor aanvullende procedures.
13. Gooi natronkalk uit patronen in de afvalcontainer.
14. Open de O_2-generator en gooi de CuSO_4-oplossing in de afvalcontainer.
    1. Spoel elektroden en slang af met gezuiverd water.
    2. Plaats de buizenrekken om te drogen.

6. Analyse van de gegevens over de overdracht van de kosten

1. Importeer gegevens als door komma's gescheiden tekst in een spreadsheet, waarbij elke record een afzonderlijk werkblad bevat.
2. Noteer de stroom- en tijdgegevens voor elke puls van de O_2-generator . Beginnend met de eerste puls nadat de kamer onder druk is gezet, noteert u de starttijd en eindtijd (als rijnummers) van elke stroompuls. Dat is het rijnummer wanneer de stroom boven nul gaat (meestal tot ongeveer 45-50 mA) naar de laatste rij die boven nul ligt.
3. Maak een tabel op het werkblad om de volgende gegevens vast te leggen:
   1. De gemiddelde stroomamplitude tijdens de puls: = GEMIDDELDE([eerste rij puls]:[laatste rij puls]) voor elke puls (uit de stroomkolom).
   2. Pulsduur: ([Laatste rij polsslag] - [eerste rij polsslag[-één rij]])/1000 voor elke polsslag (vanaf de tijd in milliseconden kolom).
   3. Totale experimenttijd: [tijd aan het begin van de laatste puls] - [tijd aan het einde van de eerste puls nadat de kamer onder druk is gezet] (vanaf de kolom tijd in minuten).
4. Bereken vervolgens de ladingsoverdracht (Q) voor elke puls (gemiddelde stroom X duur)
5. Tel de lading van alle pulsen bij elkaar op om de totale lading (Q_tot) te berekenen.

7. Analyse van het_O2-verbruik

1. Stel een nieuwe spreadsheet in voor alle gegevens en voer voor elke kamer het volgende in of bereken het:
   1. Q_tot (totale kosten)
   2. Moedervlekken (= Q ÷ 96485 × 4)
   3. ml O₂ (= mol × 22413 ml/mol)
   4. Totale tijd (uit de gegevensanalyse hierboven)
   5. ml ^min-1 (= ml O₂ ÷ totale tijd)
   6. Gewicht in grammen (vliegen verdoofd en gewogen, gemeten na het experiment)
   7. ml min-1 g-1 (= ml ^min-1 ÷ gewicht in gram)
   8. ml/h/g (de bovenstaande × 60)
   9. mg/vlieg (= gewicht van vliegen ÷ aantal vliegen)
   10. μL vlieg-1 h-1 (= (ml ^min-1 × 3600) ÷ aantal vliegen).
2. Tabelgegevens voor elke behandeling (genotype, bijv.)
3. Vergelijk behandelingen met ANOVA, t-test of Mann-Whitney u-test ¹³.

Resultaten

De druk- en stroomuitgangen van de ademhalingsmeterregelaar worden weergegeven voor één kamer in één experiment in figuur 3A. De eerste, lange stroompuls zette de kamer onder druk van omgevingsdruk (ongeveer 992 hPa) tot de vooraf ingestelde UIT-drempel van 1017 hPa. Terwijl de vliegen O 2 verbruikten en CO 2 werd geabsorbeerd, nam de druk langzaam af totdat deze de AAN-drempel van 1016 hPa bereikte, die de stroom door de O _2-generator activeerde. In het geto...

Discussie

De bovenstaande procedure demonstreert de meting van het_O2-verbruik in D. Melanogaster met behulp van een elektronische coulometrische microrespirometer. De resulterende gegevens voor de consumptie van O₂ in wildtype D. melanogaster lagen binnen de marges die in de meeste eerdere publicaties met verschillende methoden zijn beschreven (tabel 1), hoewel iets lager dan die welke door anderen werden gerapporteerd ^3,6.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
19/22 Thermometer Adapter	Wilmad-Labglass	ML-280-702	Sensor Plug
2 ml Screwcap Tubes	Fisher	3464	O2 generator
2-Pin Connector	Zyamy	40PIN-RFB10	O2 generator: cut to 2-pin
4-Pin Female Connector	TE Connectivity	215299-4	Sensor Plug
5 ml Polypropylene Tube	Falcon	352063	Cut to 5.5 cm and perforated
50 ml Schlenk Tube 19/22 Joint	Laboy	HMF050804	Chamber
6-Conductor Cable	Zenith	6-Conductor 26 ga	Cable
6-Pin Female Bulkhead Connector	Switchcraft	17982-6SG-300	Controller
6-Pin Female Connector	Switchcraft	18982-6SG-522	Sensor plug
6-Pin Male Connector	Switchcraft	16982-6PG-522	Cable
800 ul centrifuge tube	Fisher	05-408-120	Soda Lime Cartridge
ABS Plastic Enclosure	Bud Industries	PS-11533-G	Controller
Arduino Nano Every	Arduino LLC	ABX00028	Controller
BME 280 Sensor	DIYMall	FZ1639-BME280	Sensor Plug
Circuit Board	Lheng	5 X 7 cm	Controller
Copper Sulfate	BioPharm	BC2045	O2 Generator
Computer	Azulle	Byte4	Data Acquisition
Cotton Rolls	Kajukajudo	#2	Cut in half to plug fly tubes Cut in quarters for humidity
Environmental Chamber	Percival	I30 VLC8	Fly Care
Epoxy	JB Weld	Plastic Bonder	Secure Electrodes in O2 Generator
Fly Food	Lab Express	Type R	Fly Care
Keck Clamps	uxcell	a20092300ux0418	Secures glass joint of chamber to plug
Low-Viscosity Epoxy	Loctite	E-30CL	Sensor Plug
OLED Display	IZOKEE	IZKE31-IIC-WH-3	Controller
Platinum Wire 24 ga	uGems	14349	O2 generator
Silicone grease	Dow-Corning	High Vacuum Grease	Seals chamber-plug connection
Soda Lime	Jorvet	JO553	CO2 absorption
Toggle Switch	E-Switch	100SP1T1B1M1QEH	Controller
USB Cable	Sabrent	CB-UM63	Controller
USB Hub	Atolla	Hub 3.0	Connect controllers to computer
Water bath	Amersham	56-1165-33	Temperature Control
Water Bath Tank	Glass Cages	15-liter rimless acrylic	Bath for Respirometers