Methodenartikel

Ultrastructurele expansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65381

⸱

12 mei 2023

 ,  ,  , 
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET, 2Area Biología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 3Area Parasitología, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de Rosario (UNR), 4Unidad de Microscopía, Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), CONICET

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie toont een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van ultrastructuurexpansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas. We nemen de geoptimaliseerde techniek voor cytoskeletale eiwitten en pan-proteoomlabeling op.

Samenvatting

We beschrijven hier de toepassing van ultrastructuurexpansiemicroscopie (U-ExM) in Trypanosoma cruzi, een techniek die het mogelijk maakt de ruimtelijke resolutie van een cel of weefsel te verhogen voor microscopische beeldvorming. Dit wordt gedaan door een monster fysiek uit te breiden met kant-en-klare chemicaliën en gewone laboratoriumapparatuur.

De ziekte van Chagas is een wijdverbreid en dringend probleem voor de volksgezondheid veroorzaakt door T. cruzi. De ziekte komt veel voor in Latijns-Amerika en is een groot probleem geworden in niet-endemische regio's als gevolg van de toegenomen migratie. De overdracht van T. cruzi vindt plaats via hematofaag insectenvectoren die behoren tot de families Reduviidae en Hemiptera. Na infectie vermenigvuldigen T. cruzi amastigoten zich in de zoogdiergastheer en differentiëren ze zich tot trypomastigoten, de niet-replicatieve bloedbaanvorm. In de insectenvector veranderen trypomastigoten in epimastigoten en vermenigvuldigen ze zich door binaire splitsing. De differentiatie tussen de levenscyclusfasen vereist een uitgebreide herschikking van het cytoskelet en kan in het laboratorium volledig worden nagebootst met behulp van verschillende celkweektechnieken.

We beschrijven hier een gedetailleerd protocol voor de toepassing van U-ExM in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, gericht op optimalisatie van de immunolokalisatie van cytoskeletale eiwitten. We hebben ook het gebruik van N-Hydroxysuccinimide-ester (NHS) geoptimaliseerd, een pan-proteoomlabel dat ons in staat heeft gesteld om verschillende parasitaire structuren te markeren.

Inleiding

Expansiemicroscopie (ExM) werd in 2015 voor het eerst beschreven door Boyden et al.1. Het is een beeldvormingsprotocol waarmee een conventionele microscoop een ruimtelijke resolutie onder de diffractielimiet kan bereiken. Deze hogere resolutie wordt verkregen door een fysieke vergroting van het monster. Om dit te bereiken, worden fluorescerend gelabelde moleculen verknoopt met een hydrogel, die vervolgens isotroop wordt geëxpandeerd met water. Als gevolg van deze expansie worden de signalen in alle drie de dimensies bijna isotroop gescheiden. Deze methode maakt gebruik van goedkope chemicaliën en maakt een ruimtelijke resolutie van ongeveer 65 nm mogelijk met conventionele (confocale) microscopen, wat ongeveer vier keer beter is dan de standaardresolutie van een confocale microscoop (ongeveer 250 nm)1.

De volgende mijlpaal, die het gebruik van expansiemicroscopie op veel biologische gebieden mogelijk heeft gemaakt, was de aanpassing van immunofluorescentie-labeling met conventionele antilichamen2. Een andere aanpassing van het oorspronkelijk gepubliceerde ExM-protocol is de vergrote analyse van het proteoom (MAP)3. Deze methode introduceerde het gebruik van hoge concentraties acrylamide en paraformaldehyde voorafgaand aan de onderdompeling van het monster in hydrogel om intra- en inter-eiwit verknoping te voorkomen, wat leidde tot een beter behoud van het eiwitgehalte en de subcellulaire architectuur van de monsters. Dit alternatieve protocol werd geoptimaliseerd om een beter behoud van de algehele ultrastructuur van geïsoleerde organellen te verkrijgen door gebruik te maken van lagere concentraties van de fixeermiddelen (formaldehyde/paraformaldehyde en acrylamide); deze benadering werd ultrastructuuruitbreidingsmicroscopie (U-ExM)4 genoemd.

Om nog meer resolutie te krijgen, is ook de combinatie van ExM met superresolutiemicroscopietechnieken, waaronder gestimuleerde emissiedepletiemicroscopie of lokalisatiemicroscopie van één molecuul, gerapporteerd om resoluties onder 20 nm5 te bereiken.

Het gebruik van ExM is breed uitgemeten op het gebied van neurowetenschappen en cytoskeletonderzoek6, maar er zijn slechts enkele onderzoeken uitgevoerd bij parasitaire protisten. Ons laboratorium rapporteerde als eerste de toepassing van U-ExM in T. cruzi7. Het stichtingsprotocol is voornamelijk gebaseerd op de eerdere U-ExM-rapporten in Toxoplasma gondii, Plasmodium ssp. en Trypanosoma brucei 8,9,10,11.

Een van de grootste voordelen van ExM is het modulaire karakter, dat een grote flexibiliteit biedt om zich aan te passen aan verschillende biologische monsters. Het protocol kan worden onderverdeeld in stappen (zoals fixatie, verknopingspreventie of geleer) die eenvoudig door de gebruiker kunnen worden aangepast om aan hun experimentele vereisten te voldoen. Bovendien kan deze pijplijn worden gewijzigd om de compatibiliteit met het modelorganisme te verbeteren of om een specifieke resolutie te bereiken. Als gevolg hiervan biedt ExM een enorm potentieel voor zowel geavanceerde als niet-geavanceerde optische systemen, wat zorgt voor bredere toepassingen in de toekomst.

De ziekte van Chagas, ook wel Amerikaanse trypanosomiasis genoemd, is een endemische ziekte in Latijns-Amerika die wordt veroorzaakt door Trypanosoma cruzi, een protozoaire parasiet. De levenscyclus van de parasiet is complex en omvat twee ontwikkelingsstadia bij zoogdieren en twee in de insectengastheer (leden van de familie Triatominidae), de biologische vector van deze ziekte. De ziekte van Chagas behoort tot de groep van verwaarloosde tropische ziekten die op de lijst van de Wereldgezondheidsorganisatie staan en vormt een belangrijk economisch en sociaal probleem in Latijns-Amerika. Epidemiologische studies schatten dat 8 miljoen mensen over de hele wereld leven met de ziekte van Chagas en meer dan 10.000 sterfgevallen per jaar. Deze cijfers illustreren het belang van de ziekte van Chagas als een probleem voor de volksgezondheid wereldwijd. De geografische verspreiding van de ziekte van Chagas is de afgelopen decennia veranderd, waarbij veel geïnfecteerde personen nu in grote stedelijke gebieden wereldwijd wonen als gevolg van toegenomen migraties, in tegenstelling tot de voornamelijk landelijke gebieden van Latijns-Amerika waar het oorspronkelijk werd gevonden12.

De ontwikkelingsstadia van T. cruzi verschillen gedurende zijn levenscyclus, die in vitro volledig kan worden gerepliceerd. Epimastigoten zijn replicatieve vormen in de insectenvector en ze hebben een bolvormige kern in het centrale gebied van het cellichaam en een staafvormige kinetoplast (een mitochondriale DNA-bevattende structuur die uniek is voor kinetoplastiden) in het voorste gebied ten opzichte van de kern, met een vrij flagellum. Trypomastigoten zijn de infectieuze, niet-replicatieve vorm en hebben een langwerpige kern, een afgeronde posterieure kinetoplast en een flagellum dat over de gehele lengte van de parasiet aan het plasmamembraan is bevestigd. Amastigoten zijn de intracellulaire replicatieve vorm; Ze hebben een kern in het centrale gebied, een staafvormige kinetoplast in het voorste deel van het cellichaam en een gereduceerd flagellum. Het aanpassingsvermogen van de parasiet aan verschillende omgevingen is een weerspiegeling van deze morfologische variaties. Het is ook vermeldenswaard dat deze levenscyclus een symmetrische verdeling en verschillende overgangsontwikkelingsstadia omvat13. Tijdens de differentiatie speelt het cytoskelet van de trypanosomatiden een cruciale rol. Deze structuur wordt gevormd door een korset van subpelliculaire microtubuli die zijn gerangschikt in een geordende reeks stabiele microtubuli onder het plasmamembraan. In deze organismen is ook een paraflagellaire staaf aanwezig, een roosterachtige structuur die parallel loopt en is bevestigd aan het flagellaire axoneem14. De precieze cytoskeletale organisatie en nucleaire structurele veranderingen langs de stadia van de celcyclus omvatten unieke genregulatiemechanismen die specifiek zijn voor trypanosomatiden, waardoor ze interessante modellen zijn voor celbiologische studies.

Gezien de kleine omvang van T. cruzi en andere protozoaire parasieten, biedt U-ExM een uitstekend hulpmiddel voor het analyseren van de structurele kenmerken van deze belangrijke pathogenen. Zoals eerder vermeld, werd de toepasbaarheid van deze techniek op T. cruzi voor het eerst gevalideerd door Dr. Alonso7. Dit rapport beschrijft een volledig U-ExM-protocol, met de nadruk op de immunolokalisatie van cytoskeletale eiwitten tijdens de verschillende levenscyclusfasen van T. cruzi. Ook hebben we het gebruik van N-Hydroxysuccinimidester (NHS) geoptimaliseerd, een pan-proteoomlabel dat ons in staat stelt om verschillende parasitaire structuren te markeren. Daarnaast wordt een in vitro methodologie beschreven om de drie stadia van de parasiet te verkrijgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Figuur 1 illustreert het volledige experimentele ontwerp.

figure-protocol-1
Figuur 1: U-ExM-workflow voor drie in vitro levenscyclusstadia van T. cruzi. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Bereiding van de met poly-D-lysine beklede dekglaasjes

  1. Plaats een vierkant afdichtingsfolie van 10 cm x 10 cm in een petrischaaltje. Was de dekglaasjes door ze te baden in absolute ethanol in een glazen petrischaaltje van 35 mm.
  2. Haal de dekglaasjes met een pincet uit het ethanolbad en giet de overtollige vloeistof met tissuepapier af. Plaats de dekglaasjes over de afdichtingsfolie.
  3. Absorbeer de rest van de ethanol met papier van microscopiekwaliteit. Voeg een 0,1% v/v-oplossing van poly-D-lysine toe op het midden van het dekglaasje en verdeel het met de punt om ongeveer 80% van het oppervlak te bedekken. Sluit de petrischaal en broed gedurende 1 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: Gebruik voor22 mm 2 dekglaasjes 200 μL poly-D-lysineoplossing; Gebruik voor ronde dekglaasjes van 12 mm 100 μL poly-D-lysineoplossing.
  4. Was de dekglaasjes drie keer met ultrazuiver water. Gebruik aspiratie met een vacuüm om het water tussen elke wasbeurt te verwijderen. Maximaal 1 week op 4 °C bewaren.

2. Voorbereiding van de oplossing

  1. Bereid stockoplossingen van 38% (m/m) natriumacrylaat (SA).
    1. Voeg al roerend langzaam 19 g SA toe aan 31 ml nucleasevrij water.
      OPMERKING: Deze oplossing is erg stroperig; Let op bij het pipetteren.
    2. Zodra de SA volledig is opgelost, bewaart u deze in een steriele container. Houd het op 4 °C en ververs het elke 6 maanden.
      OPMERKING: SA vertoont soms tekenen van verontreiniging met natriumpolyacrylaat, afhankelijk van het merk, wat merkbaar is bij het bereiden van de voorraadoplossing omdat deze geelachtig en troebel wordt. Gebruik het voorzichtig als dit het geval is.
  2. Bereid een stockoplossing van 40% (m/v) acrylamide (AA) en een stockoplossing van 2% (m/v) N, N'-methyleenbisacrylamide (BIS). Los elke verbinding op in ultrapuur water en filtreer met een steriel spuitfilter van 0,22 μm. Bewaren in een steriele verpakking bij 4 °C.
    LET OP: AA en BIS zijn zeer giftige stoffen. Werk onder een zuurkast en gebruik de juiste beschermingselementen (handschoenen, beschermende kleding, masker en veiligheidsbril).
  3. Bereid de oplossing voor eiwitcrosslinking prevention (CP) door 38 μl van een 37% formaldehyde (FA)-oplossing te mengen met 50 μl van de 40% acrylamidestockoplossing (stap 2.2) in 912 μl fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; Tabel 1) om een eindconcentratie van 1,4% formaldehyde en 2% acrylamide te verkrijgen.
    OPMERKING: Bereid de CP-oplossing altijd vers en wees uiterst nauwkeurig bij het pipetteren. Gebruik bijvoorbeeld een P1000-pipet om 900 μl PBS af te nemen en een P20-pipet om de resterende 12 μl PBS af te nemen.
  4. Bereid de monomere oplossing voor
    OPMERKING: Gebruik de oplossing niet direct na bereiding; bewaren bij -20 °C ten minste 24 uur voor gebruik.
    1. Meng 500 μl van de 38% SA-oplossing (stap 2.1), 250 μl van de 40% AA-oplossing en 50 μl van de BIS-oplossing (stap 2.2), evenals 100 μl 10x PBS (tabel 1).
    2. Verdeel dit eindvolume van 900 μl in 10x microcentrifugebuisjes van 1,5 ml met elk 90 μl monomere oplossing. Bewaren bij -20 °C gedurende maximaal 2 weken.
      OPMERKING: De SA-oplossing kan tijdens het pipetteren op de punt blijven zitten omdat deze erg stroperig is; Wees voorzichtig en geef alles af.
  5. Bereid de denatureringsoplossing voor
    1. Meng 114,3 ml van een 350 mM natriumdodecylsulfaatoplossing (SDS) bereid in ultrapuur water met 10 ml van een 4 M natriumchlorideoplossing bereid in ultrapuur water. Voeg al roerend 12 g Tris toe in een bekerglas van 250 ml.
      LET OP: SDS is zeer giftig; Gebruik het onder een zuurkast met handschoenen, beschermende kleding, een masker en een veiligheidsbril.
    2. Breng de pH op 9 met een geconcentreerde oplossing van zoutzuur. Vul aan tot 200 ml met ultrapuur water en bewaar in een steriele kolf bij 4 °C.
  6. Bereid een 10% ammoniumpersulfaat (APS) oplossing en een 10% TEMED-oplossing.
    1. Los 0,1 g APS op in 1 ml ultrapuur water.
    2. Bereid 1 ml van een 10% TEMED-oplossing in ultrapuur water.
    3. Bereid 100 μL aliquots van beide oplossingen in steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en bewaar ze maximaal 1 maand bij -20 °C.
  7. Bereid de paraformaldehyde-oplossing voor.
    1. Los al roerend bij 60 °C 2 g paraformaldehyde op in 40 ml PBS. Voeg druppelsgewijs 1 M NaOH toe tot de oplossing van wit naar kleurloos verandert.
      LET OP: Formaldehyde is zeer giftig; Gebruik het onder een zuurkast met handschoenen, beschermende kleding, een masker en een veiligheidsbril.
    2. Koel de oplossing af tot kamertemperatuur en pas de pH met NaOH aan op 7,2 in een eindvolume van 50 ml. Filtreer met een steriel spuitfilter van 0,22 μm en bewaar in een steriele container.
    3. Bereid hoeveelheden van 1 ml in steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en bewaar ze bij -20 °C.
  8. Bereid de paraformaldehyde/glutaaraldehyde-oplossing voor.
    1. Voeg 0,2 g paraformaldehyde toe aan 3,5 ml ultrapuur water en 50 μl 16 M NaOH-oplossing. Verwarm de oplossing tot 60 °C om het paraformaldehyde op te lossen.
    2. Koel af en voeg 300 μL 70% glutaaraldehyde toe. Breng het volume op 5 ml met ultrapuur water en tenslotte op 10 ml met PBS.
      LET OP: Paraformaldehyde en glutaaraldehyde zijn zeer giftig; Gebruik ze onder een zuurkast met handschoenen, beschermende kleding, een masker en een veiligheidsbril.
    3. Bereid hoeveelheden van 1 ml in steriele microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en bewaar ze bij -20 °C.

3. Bereiding van de parasietculturen

  1. Groei T. cruzi epimastigoten.
    1. Gebruik een axenische cultuur in een T-25-kolf (groeigebied van 25cm2 ) en houd de culturen in de logaritmische fase door elke 48-72 uur te subkweken in leverinfusie-tryptosemedium (LIT) met 10% foetaal kalfsserum (FCS; Tabel 1).
    2. Zorg ervoor dat de dop goed gesloten is en houd de kweekkolf verticaal op 28 °C voor de incubatie. Bewaak de groei van de parasiet door het tellen van cellen in een Neubauer-kamer tijdens elke subcultuur.
      OPMERKING: Voor de Dm28c-stam die in deze studie is gebruikt, ligt de concentratie van epimastigoten in logfaseculturen tussen 1-5 x 107 parasieten/ml.
    3. Bereid een suspensie van 2 x 106 epimastigoten/ml van een logfasecultuur in LIT-medium aangevuld met 10% FCS. Centrifugeer de suspensie bij 5.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Was een of twee keer met PBS en resureer opnieuw in 200 μL PBS.
    4. Hecht op het ronde dekglaasje van 12 mm dat eerder is gecoat met poly-D-lysine (sectie 1). Incubeer 15-20 minuten bij RT. Ga verder met de stap ter voorkoming van verknoping (hoofdstuk 4).
      OPMERKING: U kunt de epimastigoten ook 7 minuten fixeren met koude methanol of paraformaldehyde/glutaaraldehyde-oplossing (stap 2.8) gedurende 10 minuten bij RT voordat de parasieten aan het dekglaasje hechten. Het is mogelijk om de vaste parasieten maximaal 1 week bij 4 °C te bewaren.
  2. Verkrijg de amastigoten uit geïnfecteerde Vero-cellen.
    1. Leg een steriel rond dekglaasje van 12 mm op de bodem van een weefselkweekplaat met 24 putjes. Bereid een suspensie van 2 x 105 Vero-cellen/ml in Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 2% foetaal kalfsserum (FCS). Zaai 500 μL van de suspensie per putje.
      OPMERKING: Deze studie gebruikt DMEM met 2% FCS om de cellen langzamer te laten groeien.
    2. Incubeer een nacht (AAN; 12-16 uur) bij 37 °C en 5% CO2 om de celhechting te garanderen.
    3. Was de cellen na de incubatie tweemaal met 500 μl steriel PBS. Voeg T. cruzi-trypomastigoten toe aan de cellen met een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 op 100 μL DMEM met 2% FCS per putje, wat overeenkomt met een miljoen trypomastigoten per putje. Incubeer gedurende 6 uur bij 37 °C en 5% CO2 .
    4. Spoel de platen na incubatie twee keer af met PBS. Voeg 500 μL DMEM toe aangevuld met 2% FCS. Ga nu verder met de stap ter voorkoming van verknoping (hoofdstuk 4).
      OPMERKING: Intracytoplasmatische amastigoten zullen 2 dagen na infectie zichtbaar zijn door een omgekeerde optische microscoop (aanvullende figuur 1). U kunt de trypomastigoten ook 7 minuten fixeren met koude methanol bij -20 °C, of paraformaldehyde/glutaaraldehyde gedurende 10 minuten bij RT, voordat de parasieten zich aan het dekglaasje hechten.
  3. Verkrijg trypomastigoten uit geïnfecteerde Vero-cellen.
    1. Verzamel het bovenstaande van een monolaag van Vero-cellen (30%-40% samenvloeiing) geïnfecteerd met trypomastigoten (MOI 1:10; BIJ incubatie) 4 dagen na infectie.
      OPMERKING: Voor een T-25-kolf is de initiële concentratie van gebruikte Vero-cellen 800.000 cellen en voor een T-75-kolf is dit twee miljoen cellen.
    2. Bepaal de trypomastigotconcentratie met behulp van een Neubauer-kamer voor het tellen van cellen. Centrifugeer 4 x 106 trypomastigoten bij 7.000 x g bij RT gedurende 10 min.
    3. Spoel tweemaal met PBS en resusreer opnieuw in 200 μl PBS. Aanbrengen op een rond dekglaasje van 12 mm bedekt met poly-D-lysine (sectie 1). Incubeer gedurende 10-15 minuten bij RT. Ga verder met de stap ter voorkoming van verknoping (sectie 4).
      OPMERKING: U kunt de trypomastigoten ook fixeren met koude methanol gedurende 7 minuten bij -20 °C of paraformaldehyde/glutaaraldehyde gedurende 10 minuten bij RT voordat de parasieten zich aan het dekglaasje hechten.

4. Uitvoeren van crosslinking preventie (DAG 1)

  1. Dompel het dekglaasje van 12 mm met de aangehechte parasieten of geïnfecteerde cellen (naar boven gericht) onder in een plaat met 24 putjes met 0,5 ml CP-oplossing (stap 2.3) in elk putje.
  2. Vul de lege putjes met water om verdamping te verminderen. Sluit de plaat af met een afdichtingsfolie. Incubeer gedurende 5 uur bij 37 °C. Deze stap kan worden verlengd tot een AAN-incubatie bij 4 °C.
    NOTITIE: Dompel het dekglaasje altijd onder in de oplossing; Piket de fixeeroplossing niet op de dekglaasjes.

5. Uitvoeren van geleering van het monster

  1. Zet een vochtige kamer in een petrischaal met een afdichtingsfilm op tissuepapier (Figuur 2A). Voeg water toe aan het papieren zakdoekje en incubeer gedurende 20 minuten bij -20 °C om af te koelen. Ontdooi een TEMED en een APS-aliquot gedurende 20 minuten op ijs (stap 2.6).
    OPMERKING: Bevries en ontdooi de APS niet meer dan drie keer.
  2. Leg de koele, vochtige kamer op ijs (Figuur 2A). Haal de in sectie 4 voorbereide plaat met 24 putjes uit de broedmachine. Zuig de CP-oplossing op met een pasteurpipet van 3 ml en laat wat oplossing over, anders zijn de dekglaasjes moeilijk te verwijderen.
  3. Verwijder de 12 mm dekglaasjes met een pincet uit de fixeeroplossing en leg ze op tissuepapier met de parasieten naar boven.
    NOTITIE: Het is handig om een steriele naald te gebruiken om het dekglaasje op te tillen en vervolgens met het pincet vast te houden.
  4. Voeg aan een hoeveelheid van 90 μl monomere oplossing (stap 2.4) 5 μl TEMED en 5 μl eerder ontdooide APS toe. Meng met een vortexmixer niet langer dan 2-3 s; Het is niet nodig om de tube af te sluiten met het deksel.
    OPMERKING: Voeg altijd eerst TEMED toe en APS als laatste. De toevoeging van APS eerst en TEMED als laatste aan de monomere oplossing maakt het geleeringsproces sneller, waardoor er geen tijd is om het te manipuleren.
  5. Maak snel een druppel van 35 μL over de afdichtingsfilm van de vochtige kamer voor elk dekglaasje. Pak het dekglaasje onmiddellijk met een pincet op en leg het over de druppel (Figuur 2B) met de parasieten naar beneden.
    OPMERKING: Maak maximaal twee dekglaasjes tegelijk; Het is van cruciaal belang om deze stap niet uit te stellen, omdat de oplossing zeer snel polymeriseert.
  6. Incubeer de vochtige kamer gedurende 5 minuten op ijs en vervolgens gedurende 1 uur bij 37 °C. Zet een verwarmingsblok aan op 95 °C om de juiste temperatuur voor de volgende stap te garanderen.

figure-protocol-2
Figuur 2: Details van de geleringsstap. (A) Montage van de vochtige kamer. (B) De dekglaasjes op de monomeeroplossing laten vallen met TEMED en APS voor geleer. (C) Schematische weergave van de gel die is samengesteld voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Denatureren van de gegeleerde monsters en uitvoeren van de isotrope expansie

  1. Verwijder de denaturatieoplossing (stap 2.5) bij 4 °C. Als het neergeslagen is, doe het dan in een warmwaterbad totdat het volledig is opgelost.
  2. Voeg 2 ml van de denatureringsoplossing toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes. Breng de dekglaasjes van stap 5.3 over op de plaat met de denaturatieoplossing. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT door zachtjes te schudden zodat de gel loskomt van het dekglaasje.
  3. Breng de gel voorzichtig over (verwijder deze van het dekglaasje van 12 mm) met een metalen spatel in een steriel microcentrifugebuisje van 1,5 ml met 1 ml denatureringsoplossing. Gebruik dopvergrendelingen om de buizen vast te zetten. Incubeer gedurende 1 uur en 30 minuten bij 95 °C in een verwarmingsblok.
    OPMERKING: Gels beginnen tijdens deze stap uit te zetten; wees voorzichtig bij het overbrengen van de gel naar de microcentrifugebuis van 1,5 ml.
    LET OP: Na de incubatie is de tube met de gel 95 °C, wat gevaarlijk kan zijn. Gebruik beschermende handschoenen en laat de buizen afkoelen voordat u ze aanraakt om brandwonden en projecties te voorkomen.
  4. Voer de eerste uitbreidingsronde uit
    1. Zuig de denatureringsoplossing uit de microcentrifugebuis van 1,5 ml met de gel op met een P1000-pipet. Breng de gel van de microcentrifugebuis van 1,5 ml over in een petrischaaltje met 10 ml ultrapuur water gedurende 30 minuten met behulp van een kleine spatel.
    2. Vervang het ultrazuivere water met behulp van een wegwerppasteurpipet van 3 ml. Incubeer AAN bij RT.
      OPMERKING: Wees voorzichtig met de gels, want na de eerste 30 minuten van de incubatie werden ze kwetsbaar.
    3. Vervang het ultrazuivere water nog een keer met een wegwerppasteurpipet van 3 ml.
      LET OP: Drie waterincubaties van elk 30 minuten zijn voldoende, maar voor de praktijk is het beter om de tweede incubatie AAN te laten staan.

7. Uitvoeren van fluorescentielabeling van de doeleiwitten (DAG 2)

  1. Verwijder het water uit het petrischaaltje met de gel met een wegwerppasteurpipet van 3 ml. Meet de diameter van de gel met een schuifmaat om de uitzetting te berekenen (tussen vier en vijf keer).
  2. Was twee keer met 10 ml PBS gedurende 15 min. Snijd de gel met een scheermesje in vierkanten van ongeveer 10 mm x 10 mm in het midden van de ronde gel. Gebruik één vierkant per te testen toestand.
    OPMERKING: De gel krimpt na de PBS-incubaties. Gels kunnen maximaal 1 week in PBS bij 4 °C worden bewaard.
  3. Breng elk vierkant over op een plaat met 12 putjes en incubeer met 500 μl primair antilichaam verdund in 2% PBS-runderserumalbumine (BSA) gedurende 2 uur en 30 minuten bij 37 °C onder schudden.
    OPMERKING: Incubatie van alternatieve antilichamen kan AAN worden uitgevoerd bij 4 °C. Het minimale antilichaamvolume dat kan worden gebruikt is 300 μL in een plaat met 24 putjes. Gebruik als algemene regel tweemaal de concentratie van antilichamen die worden gebruikt voor conventionele immunolabeling.
  4. Was driemaal met 2 ml PBS met 0,1% polysorbaat 20 gedurende 10 minuten terwijl u schudt in een plaat met 6 putjes.
  5. Breng de gel over op een plaat met 12 putjes en incubeer met 500 μl secundair antilichaam in PBS met DAPI en 10 μg/ml NHS-ester geconjugeerd aan de gewenste fluorofoor gedurende 2 uur en 30 minuten bij 37 °C onder voorzichtig schudden.
    OPMERKING: Gebruik als algemene regel tweemaal de concentratie antilichamen die wordt gebruikt voor conventionele immunolabeling. Als alternatief kan deze incubatie AAN worden uitgevoerd bij 4 °C.
  6. Was driemaal met 2 ml PBS met 0,1% polysorbaat 20 gedurende 10 minuten terwijl u schudt in een plaat met 6 putjes.
  7. Breng de gel over in een petrischaaltje met ultrapuur water. Incubeer gedurende 30 minuten. Ververs het water twee keer met een wegwerppasteurpipet van 3 ml, zoals gedaan in stap 6.4.

8. Beeldvorming en beeldverwerking (DAG 3)

  1. Verwijder het water uit de petrischaaltjes met een wegwerppasteurpipet van 3 ml en meet de geldiameter met een schuifmaat om de uitzettingsfactor te berekenen.
  2. Snijd met een scheermesje een klein stukje van ~10 mm x 10 mm en plaats het op een schaal met glazen bodem van 35 mm.
    OPMERKING: Plaats als alternatief de gel tussen een objectglaasje en een dekglaasje (zonder poly-D-lysine). De dia moet twee kleinere dia's hebben die zijn gesneden met een diamantmes aan de zijkanten om een kamer te vormen met ongeveer de dikte van de gel.
  3. Controleer de oriëntatie bij een vergroting van 10x of 20x. Om goed scherp te stellen, moet u ervoor zorgen dat de parasieten naar het dekglaasje wijzen; anders moet men de gel omdraaien en opnieuw controleren (Figuur 2C).
  4. Zodra de juiste oriëntatie is gevonden, droogt u de resterende gel af met microscopiepapier. Bedek de gel met een afdekglaasje met poly-D-lysinecoating.
  5. Voeg een kleine druppel ultrapuur water toe aan de gel om te visualiseren met een confocale microscoop.
    OPMERKING: Om een goede beeldvorming te garanderen, is het van cruciaal belang om de geloriëntatie gedurende het hele proces te behouden, zodat de kant van de gel met cellen in de buurt van het oppervlak aan het einde naar de schaal met glazen bodem is gericht. Bij gebruik van schotels van 35 mm vermindert het toevoegen van poly-D-lysine aan het dekglaasje dat op de bodem is geplaatst, het verschuiven van de gel tijdens de beeldacquisitie.
  6. Parameters voor beeldacquisitie
    1. Beeld de monsters af in een confocale microscoop (Materiaaltabel) met behulp van een 63x olie-immersie 1.4 numeriek apertuur (NA) objectief.
    2. Verkrijg Z-stacks, de breedte van elke z-stap en een belichtingstijd per pixel, empirisch te bepalen, afhankelijk van de steekproef, de signaalintensiteit en optimalisatie van acquisitietijden. Gebruik desgewenst de scanzoom voor een effectieve vergroting.
    3. Open de Z-stapel met behulp van beeldverwerkingssoftware (Materiaaltabel). Groepeer voor elk kanaal de gestapelde afbeeldingen met behulp van de optie Groep Z-project . Selecteer de projectie met maximale intensiteit.
    4. Als u afbeeldingen wilt samenvoegen, gebruikt u de tool Kanalen samenvoegen en selecteert u de kleur van elk kanaal. Voeg een schaalbalk toe met behulp van de tool Schaalbalk in de verwerkingssoftware.
      OPMERKING: Als alternatief kan men elk kanaal naar wens inkleuren (zie voorbeelden in de representatieve resultaten).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als het protocol goed is uitgevoerd (Figuur 1), zullen monsters zichtbaar zijn als een vlakke en doorschijnende gel die in water kan worden uitgezet tot een factor 4-4,5x (Figuur 3A). Deze expansie zorgde voor een effectieve resolutie van ongeveer 70 nm, die kan variëren afhankelijk van de uiteindelijke expansiefactor en het gebruikte beeldvormingssysteem. Na het tweede expansieproces en beeldacquisitie in een confocale microsco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Ultrastructurele expansiemicroscopie is een techniek waarmee beelden met een hoge resolutie van biologische monsters kunnen worden verkregen door ze fysiek uit te breiden tot meerdere keren hun oorspronkelijke grootte. Het U-ExM-protocol omvat verschillende kritieke stappen die zorgvuldig moeten worden uitgevoerd om optimale resultaten te bereiken4. Eerst moet het monster worden gefixeerd met een CP-middel en worden ingebed in een zwellende hydrogelmatrix. Het for...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We danken Dolores Campos voor hun hulp bij de Vero-celkweek en Romina Manarin voor hun hulp bij de T. cruzi-cultuur . Dit werk werd ondersteund door Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva uit Argentinië (PICT2019-0526), Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIBAA 1242) en Research Council United Kingdom [MR/P027989/1].

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 micrometers steriele spuitfilters PESMembraanoplossingenSFPES030022S
1 L bekerSchott Duran10005227
1.5-mL SPINWIN Micro CentrifugebuisTarsonT38-500010
10 mL wegwerpspuit sterieleNP66-32
10 mL serologische pipet sterieleJet BiofilGSP211010
12-mm dekglasjesMerienfeld GmbH01 115 20Ronde dekglasjes
12-well platenJet BiofilTCP011012
22-mm dekglasjesCorning2845-22Vierkante dekglasjes
24-well platenJet BiofilTCP-011-024
250 mL bekerSchott DuranC108.1
3 mL PasteurpipetDeltalab200037
35-mm glazen bodem schalenMatsunami glass indD11130H
4',6-Diamidine-2'-fenylindol dihydrochlorideSigma AldrichD9542DAPI
5 ml serologische pipet sterieleJet BiofilGSP010005
6-well platenSarstedt83.3920
AcrylamidBioRad1610101
AmmoniumpersulfaatSigma AldrichA3678-25GAPS
ATTO 647 NHS-esterBOC SciencesF10-0107Voor pan-proteoom labelen
BieveiligheidskastTelstarBio II A/P
Bovine Sodium AlbumineSigma AldrichA7906BSA
CO2 IncubatorSanyoMCO-15A
Confocal MicroscoopZeissLSM 880
Wegwerp PetrischaalTarsons46009590 mm diameter
DMEM, Hoge GlucoseThermo Fisher Cientific12100046Poeder
Elektronische digitale schuifmaatRadarRADAR-SLIDE-CALIPER
Ethanol AbsoluutSupelco1,00,98,31,000
Fetaal Kalfs SerumInternegocios SAFCS FRA 500Steriele en hitte-inactiveerde
Fiji beeldverwerkingspakketImageJdoi:10.1038/nmeth.2019
Formaldehyde 37%Sigma AldrichF8775FA
Glazen PetrischaalMarienfeld SuperiorPM-340030060 mm diameter
Glucosa D(+)Cicarelli716214
Glutaraldehyde 70%Sigma AldrichG7776
Geit anti-Muis IgG Secundair Antilichaam Alexa Fluor 555InvitrogenA-21422
Geit anti-Konijn IgG Secundair Antilichaam FICTJackson Immunoresearch115-095-003
Gradueerde cilinderNalgene3663-1000
Gradueerde glazen flesGlasscoGL-274.202.01100 mL
VerwarmingsblokIBRIn eigen huis gemaakt
HeminFrontier ScientificH651-9
Zoutzuur 36.8-38.0%Ciccarelli918110
IJsemmerCorning1167U68
IncubatorTecno DalvoTOC130
Lever InfusieDifco226920
Magneetroerder en verwarmerLab companionHP-3000
Metalen spatelSALTTECH200MM
Metalen pincetMarienfeld SuperiorPM-6633002
Methanol absoluutCicarelli897110
Microcentrifugebuis 1.5 mLTarson500010-N
Microscopie kwaliteit papier KimWipesKimtech ScienceB0013HT2QW
Milli-Q water systeemMerk MilliporeIQ-7003
muis anti- alfa tubulin klon DM1ASigma AldrichT9026
muis anti-PFRGepuurde antilichamenGedoneerd door Dr. Ariel Silber (USP)
N,N'-methylenbisacrilamideICN193997BIS
Na2HPO4Cicarelli834214
Neubauer kamerBoecoBOE 01
p1000 pipetGilsonPIPETMAN P1000
p1000 pipettipsTarsonTAR-521020B
p20 pipetGilsonPIPETMAN P20
p20 pipettipsTarsonTAR-527108
p200 pipetGilsonPIPETMAN P200
p200 pipettipsTarsonTAR-521010Y
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148PFA
pH / ORP / °C meterHANNA InstrumentsHI 2211
Poly-D-Lysine 0.1%Sigma AldrichP8920
KaliumchlorideCicarelli867212KCl
HolblaadPrintexBS 2982:1992
Sealing Film "Parafilm M"BemisPM996
Natrium AcrilaatSigma Aldrich408220-25GSA
Natrium BicarbonaatCicarelli929211NaHCO3
NatriumchlorideCicarelli750214NaCl
NatriumdodecylsulfaatBioRad1610302SDS
Natrium

Referenties

  1. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  2. Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
  3. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  4. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2018).
  5. Tillberg, P. W., Chen, F. Expansion microscopy: Scalable and convenient super-resolution microscopy. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 35, 683-701 (2019).
  6. Jurriens, D., van Batenburg, V., Katrukha, E. A., Kapitein, L. C. Mapping the neuronal cytoskeleton using expansion microscopy. Methods in Cell Biology. 161, 105-124 (2021).
  7. Alonso, V. L. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) in Trypanosoma cruzi: localization of tubulin isoforms and isotypes. Parasitology Research. 121 (10), 3019-3024 (2022).
  8. Kalichava, A., Ochsenreiter, T. Ultrastructure expansion microscopy in Trypanosoma brucei. Open Biology. 11 (10), 210132(2021).
  9. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. Journal of Cell Science. 134 (5), (2021).
  10. Liffner, B., Absalon, S. Expansion microscopy reveals plasmodium falciparum blood-stage parasites undergo anaphase with a chromatin bridge in the absence of mini-chromosome maintenance complex binding protein. Microorganisms. 9 (11), 2306(2021).
  11. Dos Santos Pacheco, N., Soldati-Favre, D. Coupling auxin-inducible degron system with ultrastructure expansion microscopy to accelerate the discovery of gene function in Toxoplasma gondii. Methods in Molecular Biology. 2369, 121-137 (2021).
  12. Lidani, K. C. F., et al. Chagas disease: From discovery to a worldwide health problem. Frontiers in Public Health. 7, 166(2019).
  13. Carrea, A., Diambra, L. Systems biology approach to model the life cycle of Trypanosoma cruzi. PloS One. 11 (1), e0146947(2016).
  14. Vidal, J. C., De Souza, W. Morphological and Functional Aspects of Cytoskeleton of Trypanosomatids. Cytoskeleton - Structure, Dynamics, Function and Disease. , InTech. (2017).
  15. Kunz, T. C., Götz, R., Gao, S., Sauer, M., Kozjak-Pavlovic, V. Using expansion microscopy to visualize and characterize the morphology of mitochondrial cristae. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 617(2020).
  16. Laporte, M. H., Klena, N., Hamel, V., Guichard, P. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nature Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  17. Sahabandu, N., et al. Expansion microscopy for the analysis of centrioles and cilia. Journal of Microscopy. 276 (3), 145-159 (2019).
  18. Wen, G., Leen, V., Rohand, T., Sauer, M., Hofkens, J. Current progress in expansion microscopy: chemical strategies and applications. Chemical Reviews. 123 (6), 3299-3323 (2023).
  19. Trinks, N., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging of immunological synapse formation between NK cells and A. fumigatus by expansion microscopy. Communications Biology. 4 (1), 1151(2021).
  20. White, B. M., Kumar, P., Conwell, A. N., Wu, K., Baskin, J. M. Lipid expansion microscopy. Journal of the American Chemical Society. 144 (40), 18212-18217 (2022).
  21. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Reports Methods. 2 (10), 100311(2022).
  22. Shaib, A. H., et al. Visualizing proteins by expansion microscopy. bioRxiv. , (2023).
  23. M'Saad, O., et al. All-optical visualization of specific molecules in the ultrastructural context of brain tissue. bioRxiv. , (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ultrastructure Expansie microscopieziekte van Chagascytoskeletale eiwittenconfocale microscopieimmunolocalisatiepan proteoomlabelingepimastigot stadiumflagellair axonema

Gerelateerde artikelen