Methodenartikel

Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde genetische manipulatie van groene microalgen, Chlorella vulgaris

5.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65382

⸱

27 oktober 2023

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of Waterloo

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst het gebruik van Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) voor het integreren van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van de groene microalg Chlorella vulgaris, wat leidt tot de productie van stabiele transformatoren.

Samenvatting

Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) dient als een veelgebruikt hulpmiddel voor het manipuleren van plantengenomen. A. tumefaciens vertoont echter het vermogen tot genoverdracht naar een breed scala aan soorten. Talloze soorten microalgen missen gevestigde methoden om genen die van belang zijn betrouwbaar te integreren in hun nucleaire genoom. Om de potentiële voordelen van microalgenbiotechnologie te benutten, zijn eenvoudige en efficiënte hulpmiddelen voor genoommanipulatie cruciaal. Hierin wordt een geoptimaliseerd AMT-protocol gepresenteerd voor de industriële microalgensoort Chlorella vulgaris, waarbij gebruik wordt gemaakt van het reporter groen fluorescerend eiwit (mGFP5) en de antibioticaresistentiemarker voor Hygromycine B. Mutanten worden geselecteerd door middel van plating op Tris-Acetaat-Fosfaat (TAP) media die Hygromycine B en cefotaxime bevatten. De expressie van mGFP5 wordt gekwantificeerd via fluorescentie na meer dan tien generaties subculturing, wat wijst op de stabiele transformatie van de T-DNA-cassette. Dit protocol maakt het mogelijk om in minder dan twee weken op betrouwbare wijze meerdere transgene C. vulgaris-kolonies te genereren, waarbij gebruik wordt gemaakt van de in de handel verkrijgbare pCAMBIA1302 plantenexpressievector.

Inleiding

Agrobacterium tumefaciens, een gramnegatieve bodembacterie, bezit een uniek vermogen tot genoverdracht tussen koninkrijken, waardoor het de titel "natuurlijke genetische ingenieur" heeft gekregen1. Deze bacterie kan DNA (T-DNA) overbrengen van een tumor-inducerend plasmide (Ti-Plasmide) naar gastheercellen via een Type IV-secretiesysteem, wat resulteert in de integratie en expressie van het T-DNA in het gastheergenoom 1,2,3,4. In de natuurlijke omgeving leidt dit proces tot tumorvorming in planten, algemeen bekend als kroongalziekte. Agrobacterium kan echter ook T-DNA overbrengen naar verschillende andere organismen, waaronder gist, schimmels, algen, zee-egelembryo's en zelfs menselijke cellen onder laboratoriumomstandigheden 5,6,7,8.

Door gebruik te maken van dit natuurlijke systeem, maakt Agrobacterium tumefaciens-gemedieerde transformatie (AMT) de willekeurige integratie van gen(en) van belang in het nucleaire genoom van een gastheercel mogelijk door het T-DNA-gebied van het Ti-plasmide te wijzigen. Voor dit doel is een veelgebruikte AMT-plantenexpressievector pCAMBIA13029. Onderzoekers kunnen eenvoudige kloonworkflows gebruiken in E. coli voordat ze de gewenste vector overbrengen naar A. tumefaciens voor latere overdracht naar de gastheer van belang.

Groene microalgen zijn eukaryoten die veel overeenkomsten vertonen met landplanten, maar zeer recalcitrant zijn voor genetische modificatie. Genetische transformatie speelt echter een cruciale rol in zowel fundamenteel als biotechnologisch onderzoek naar microalgen. In verschillende microalgensoorten, met name Chlamydomonas reinhardtii, heeft genetische transformatie via AMT met succes transgenen geïntroduceerd zoals humaan interleukine-2 (hIL-2), het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus 2-receptorbindende domein (SARS-CoV-2 RBD) en twee antimicrobiële peptiden (AMP's)10,11,12,13. Chlorella vulgaris, een minder kieskeurige en snelgroeiende groene algensoort, heeft een aanzienlijk potentieel voor de duurzame productie van koolhydraten, eiwitten, nutraceuticals, pigmenten en andere hoogwaardigeverbindingen14. Het gebrek aan betrouwbare instrumenten voor het creëren van transgene stammen van C. vulgaris belemmert echter de commerciële vooruitgang ervan. Aangezien er slechts een beperkt aantal gepubliceerde werken zijn gepubliceerd waarin AMT in C. vulgaris15 wordt gebruikt, en gezien de aanzienlijke verschillen tussen de kweek van planten en microalgen, wordt het optimaliseren van het AMT-protocol essentieel.

In deze studie plaatsten onderzoekers groen fluorescerend eiwit (mGFP5) stroomafwaarts van de Cauliflower Mosaic Virus (CamV) 35S-promotor en voegden een histidine-tag toe om het te gebruiken als een reporter-gen voor eiwitexpressie. Transformanten werden geselecteerd met behulp van hygromycine B en na meer dan twintig generaties subculturatie bleef de transformatie stabiel. Het pCAMBIA1302-plasmide dat in dit werk wordt gebruikt, kan gemakkelijk worden aangepast om elk interessant gen te bevatten. Bovendien kunnen de gepresenteerde methode en materialen worden aangepast voor andere groene algensoorten met een actieve CamV35S-promotor, aangezien deze promotor wordt gebruikt voor hygromycineselectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle media en oplossingen moeten voor gebruik worden geautoclaveerd, tenzij anders vermeld. Alle centrifugebuisjes, pipetpunten, enz. moeten voor gebruik steriel of geautoclaveerd zijn. Voor het gemak zijn de mediarecepten die in dit protocol worden gebruikt, vermeld in tabel 1.

1. Bereiding van elektrocompetente cellen van A. tumefaciens

  1. Inoculeer Agrobacterium (AGL-1) in een steriele schudkolf van 25 ml LB-media (aangevuld met rifampicine, 20 mg/L-1) uit een bevroren glycerolvoorraad en laat een nacht groeien bij 28-30 °C en 150 rpm.
    OPMERKING: De Agrobacterium-stam AGL-1 is (zie materiaaltabel) resistent tegen rifampicine, ampicilline, chlooramfenicol en streptomycine en kan bij verschillende leveranciers worden verkregen.
  2. Verdun de volgende dag de cultuur 1,00,000-voudig door 0,5 μL van de nachtelijke cultuur toe te voegen aan 50 ml geautoclaveerd ultrazuiver water en verdeel 10 μL van deze verdunde cultuur op een LB-plaat en incubeer vervolgens gedurende 1-3 dagen bij 28-30 °C.
  3. Kies een kolonie en start een nachtelijke kweek van 20 ml in LB met rifampicine bij 28-30 °C.
  4. Inoculeer de volgende dag 500 ml LB-media (geen antibioticum) in een schudkolf met 9 ml van de nachtcultuur en kweek bij 28-30 °C totdat de OD600 0,5 bereikt.
  5. Verdeel de cultuur gelijkmatig over tien centrifugebuisjes van 50 ml en zet 30 minuten op ijs in de koelkast. Koel de centrifuge voor op 4 °C.
  6. Centrifugeer de buisjes bij 4 °C en 4000 x g gedurende 15 min. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk supernatant met behulp van een pipet en resuspendeer de pellet in elk buisje in 50 ml ijskoud water.
  7. Centrifugeer de cellen bij 4 °C en 4000 x g gedurende 15 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 25 ml ijskoud water in elke buis.
  8. Centrifugeer de cellen bij 4 °C en 4000 x g gedurende 15 min. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude 10% (w/v) glycerol in elke tube.
  9. Combineer alle buisjes in één buisje van 50 ml en centrifugeer de cellen bij 4 °C en 4000 x g gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 400 μL ijskoude 10% (m/v) glycerol. De celconcentratie moet ongeveer 1-3 x 1010 cellen/ml zijn.
  10. Verdeel de cellen als aliquots van 50 μl in steriele voorgekoelde microbuisjes. Vries in vloeibare stikstof in en bewaar in een vriezer van -80 °C.

2. Elektroporatie van A. tumefaciens

  1. Voeg 50 μl elektrocompetente cellen AGL-1 A. tumefaciens toe aan een voorgekoelde cuvet van 0,1 mm en voeg 2 μl pCAMBIA1302 of een soortgelijk plasmide (conc 15 ng/μl) toe (zie materiaaltabel).
  2. Elektroporaat bij 2400 V met behulp van een elektroporator (200 Ω, capaciteitsversterker 250 μFD, capaciteit 25 μFD, exponentieel verval, zie Materiaaltabel). De tijdconstante moet >4,5 ms zijn voor succesvolle elektroporatie met exponentieel verval.
  3. Voeg onmiddellijk 1 ml LB-media toe aan de cuvet en pipetteer voorzichtig op en neer om te mengen. Breng de 1 ml geresuspendeerde cellen over in een microbuis van 1,5 ml en incubeer deze bij 28-30 °C gedurende ten minste 1 uur om te herstellen.
  4. Plaat de cellen op LB-agar met het juiste antibioticum (d.w.z. 50 mg/L kanamycine voor pCAMBIA1302 voor prokaryote selectie).
  5. Incubeer bij 28-30 °C gedurende 2-3 dagen.
  6. Selecteer een kolonie, kweek 's nachts in LB met de juiste selectie (50 mg/L kanamycine voor pCAMBIA1302) en cryopreservatie van de plasmidebevattende stam met 50% glycerol bij -80 °C voor toekomstig gebruik.

3. AMT van C. vulgaris

OPMERKING: Bereid C. vulgaris (UTEX 395, zie materiaaltabel) en A. tumefaciens culturen parallel voor voor co-cultivatie. Met de culturen van C. vulgarimoet 3 dagen voor de bereiding van de culturen van A. tumefaciens worden begonnen. Het protocol is aangepast op basis van het protocol dat is gepubliceerd door Kumar et al.7.

  1. Bereid C. vulgaris-cultuur voor
    1. C. vulgaris wordt traditioneel op hellingen opgeslagen of in logfaseculturen onder verlichte omstandigheden gehouden. Verspreid 0,5 ml van een logfasecultuur bij OD600 = 1,0 op een agarplaten van trisacetaatfosfaat (TAP, zie tabel 1) ( 1,2% m/v agar A) en kweek gedurende 5 dagen bij 25 °C met belichting (50 μE/m2s). Dit levert ongeveer 5 x 106 cellen op.
  2. Bereid A. tumefaciens-cultuur voor
    1. Kweek de A. tumefaciens AGL-1 pCAMBIA1302-stam in een schudkolf door 10 ml LB-media te inoculeren, aangevuld met 15 mM glucose, 20 mg/l rifampicine en 50 mg/l kanamycine (zie materiaaltabel) met behulp van de glycerolvoorraad. Incubeer bij 28-30 °C en 250 tpm gedurende een nacht.
    2. Inoculeer 1 ml 's nachts in 50 ml LB met 15 mM glucose, 20 mg/L rifampicine en 50 mg/L kanamycine en incubeer bij 28-30 °C en 250 tpm totdat de OD600 1,0 bereikt.
  3. Cocultiveer C. vulgaris en A. tumefaciens
    1. Om de A. tumefaciens-cultuur voor te bereiden op co-cultivatie, brengt u de gekweekte cultuur over in een buis van 50 ml en centrifugeert u deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op 4000 x g . Verwijder het supernatans met behulp van een pipet en was de cellen twee keer met het inductiemedium.
      OPMERKING: De gebruikte inductiemedia zijn TAP-media aangepast aan pH 5,5 en aangevuld met F/2 medium sporenmetalen en vitaminen met 200 μM acetosyringon (AS, zie Materiaaltabel). Resuspendeer de cellen in inductiemedia zodanig dat OD600 = 0,5.
    2. Om de C. vulgaris-cultuur voor te bereiden op co-cultivatie, voegt u 25 ml inductiemedia toe aan de C. vulgaris-plaat met ~ 5 x 106 cellen. Breng over naar een tube van 50 ml. Centrifugeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur bij 4000 x g en gooi het supernatant weg.
    3. Meng de algencelkorrel met 200 μL van de bacteriële suspensie (OD600: 0,5) en incubeer ze gedurende 1 uur in een roterende schudder bij 21-25 °C bij 150 rpm.
    4. Verdeel de mengcultuur (200 μL) over inductieplaten aangevuld met 15 mM glucose en incubeer gedurende 3 dagen bij 21-25 °C in het donker.
    5. Gebruik na 3 dagen 10 ml TAP-media aangevuld met 400 mg/l cefotaxime of 20 mg/l tetracycline (zie materiaaltabel) om de microalgen te verzamelen en gedurende 2 dagen in het donker bij 21-25 °C te incuberen om A. tumefaciens uit de kweek te verwijderen.
    6. Plaat 500 μL van de kweek op selectieve media, bijv. TAP-media aangevuld met 20-70 mg/L Hygromycine B (bij gebruik van pCAMBIA1302) en 400 mg/L-1 cefotaxime of 20 mg/L tetracycline. Incubeer 21-25 °C gedurende 2 dagen in het donker voordat u ze in een verlichte kamer plaatst.
      OPMERKING: Resistente kolonies verschijnen 5-7 dagen na blootstelling aan licht.
    7. Pluk enkele kolonies van de transformatieplaat en streep ze opnieuw op TAP-agarplaten aangevuld met 400 mg/L cefotaxime of 20 mg/L tetracycline en 20-70 mg/L Hygromycine B.

4. Kolonie-PCR (cPCR) om genintegratie in C. vulgaris-transformanten te bevestigen

  1. Genoom-DNA extraheren uit een C. vulgaris-transformant na ten minste twee keer subcultureren uit een enkele kolonie met behulp van een DNA-extractiekit voor het genoom van planten (zie Materiaaltabel). Gebruik dit als sjabloon voor PCR en ontwerp primers voor het mgfp5-gebied van het T-DNA (mgfp5-Fwd: 5' CCCATCTCATAAATAACGTC 3', en M13-Rev: 5' CAGGAAACAGCTATGAC 3').
    1. Gebruik een Q5 high-fidelity DNA-polymerase master mix kit (zie Tabel met materialen) om polymerasekettingreactie (PCR) uit te voeren om transgenintegratie te valideren.
      OPMERKING: Voor dit onderzoek zijn de volgende omstandigheden gebruikt: 98 °C gedurende 3 minuten; 35 cycli (98 °C gedurende 10 s, 57 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 1 min); 72 °C gedurende 5min. Gebruik pCAMBIA1302 als positieve controle en wildtype C. vulgaris genoom-DNA als negatieve controle.
  2. Om te bevestigen dat er geen pCAMBIA1302 in het monster aanwezig is als gevolg van restbesmetting door A. tumefaciens, gebruikt u kolonie-PCR. Voeg een kleine hoeveelheid transformatorcellen toe aan 10 μL steriel water en kook op 98 °C gedurende 15 min. Gebruik dit als sjabloon voor PCR.
    1. Ontwerpprimers voor een gebied buiten het T-DNA op pCAMBIA1302 (B1-Fwd: 5'AGTAAAGGAGAAGAACTTTTC 3' en B1-Rev: 5'CCTGATGCGGTATTTTCTC 3').
      OPMERKING: Voor dit onderzoek zijn de volgende voorwaarden gebruikt: 94 °C gedurende 3 minuten; 30 cycli (94 °C gedurende 30 s, 48 °C gedurende 30 s, 68 °C gedurende 5 min); 68 °C gedurende 7 min. Gebruik een gekookte kolonie van A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) als positieve controle en een gekookte kolonie van wildtype C. vulgaris als negatieve controle.
  3. Om te bevestigen dat er geen besmetting met A. tumerfaciens in het monster aanwezig is, gebruikt u kolonie-PCR. Voeg een kleine hoeveelheid transformatorcellen toe aan 10 μL steriel water en kook op 98 °C gedurende 15 min. Gebruik dit als sjabloon voor PCR.
    1. Ontwerp primers voor het virE2-gen op het AGL-1-virulentieplasmide (virE2-Fwd: 5' AGGGAGCCCTACCCG 3' en virE2-Rev: 5' GAACCAGCCTGGAGTTCG 3').
      OPMERKING: Voor dit onderzoek zijn de volgende voorwaarden gebruikt: 94 °C gedurende 3 minuten; 30 cycli (94 °C gedurende 30 s, 53 °C gedurende 30 s, 68 °C gedurende 3 min); 68 °C gedurende 7 min. Gebruik een gekookte kolonie van A. tumefaciens AGL-1 (pCAMBIA1302) als positieve controle en een gekookte kolonie van wildtype C. vulgaris als negatieve controle.
  4. Voer PCR-monsters uit op een DNA-agarosegel samen met een ladder (1 Kbp DNA-ladder, zie Tabel met materialen) om de grootte van de resulterende fragmenten te bevestigen16.

5. Meten van de fluorescentie van transformatoren

  1. Inoculeer elk transformatiemiddel uit een log-fase onderhoudscultuur of TAP-agar-helling in 50 ml TAP aangevuld met 200 mg/L-1 cefotaxime en 25 mg/L-1 hygromycine B, zodanig dat de begin-OD 600 = 0,1. Inoculeer één kweek met wildtype C. vulgaris en slechts 200 mg/L-1 cefotaxime als negatieve controle. Incubeer bij 25 °C bij 150 omw/min met 150 μmol/m2s fotosynthetisch actief licht (zie materiaaltabel).
  2. Neem elke 24 uur een monster van 300 μl en meet de extinctie en fluorescentie (excitatie 488 nm, emissie 526 nm) in een plaatlezer met 96 putjes of UV/Vis-spectrometer en fluorometer (zie materiaaltabel). Gebruik een zwarte plaat met een transparante bodem voor gelijktijdige metingen.

6. Extractie van ruw eiwit, eiwitzuivering en SDS-PAGE-elektroforese

  1. Inoculeer transformant (#50) uit een log-fase onderhoudscultuur in 300 ml TAP aangevuld met 200 mg/L-1 cefotaxime en 25 mg/L-1 hygromycine B om de OD680 = 0,1 te bereiken. Inoculeer één kweek met wildtype C. vulgaris en slechts 200 mg/L-1 cefotaxime als negatieve controle. Incubeer bij 25 °C bij 150 omw/min met 150 μmol/m2s fotosynthetisch actief licht.
  2. Extraheer het ruw eiwitmonster uit de transformant (#50) en wildtype stammen met behulp van 5 ml lysisbuffer (zie tabel 1), gevolgd door sonicatie gedurende 4 minuten.
  3. Zuiver het ruw eiwitmonster met een Ni-NTA-hars door polypropyleenkolommen van 5 ml (zie materiaaltabel).
  4. Lyofiliseer de 15 ml gezuiverde eiwitmonsters en resuspendeer ze in 1 ml lysisbuffer voor SDS-PAGE-analyse17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om een succesvolle transformatie met behulp van de bovenstaande methode aan te tonen, werd C. vulgaris gecoculteerd met AGL-1 met het pCAMBIA1302-plasmide of zonder het plasmide (wildtype en verguld op TAP-agar aangevuld met hygromycine B en cefotaxime (figuur 1A). De meest linkse plaat toont de getransformeerde kolonies die in staat zijn om te groeien op Hygromycine B/cefotaxime-platen, en de middelste plaat laat zien dat wild-type AGL-1 niet kan groeien op de Hygromycine B/cefotax...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De efficiëntie van transformatie wordt geassocieerd met verschillende parameters. De keuze van A. tumefaciens-stammen die voor AMT worden gebruikt, is cruciaal. AGL-1 is een van de meest invasieve stammen die is ontdekt en wordt om deze reden routinematig gebruikt in AMT van planten. Het aanvullen van de inductiemedia met glucose (15-20 mM) is ook belangrijk voor de AMT-efficiëntie. Aangezien C. vulgaris kan groeien in zowel fototrofe als heterotrofe omstandigheden, worden glucose of andere koolstofbron...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er werden geen belangenconflicten gemeld.

Dankbetuigingen

De auteurs willen Prof. Paul Hooykaas bedanken voor het beschikbaar stellen van de pCAMBIA1302 vector en Agrobacterium tumefaciens AGL1 van het Instituut Biologie Leiden, Universiteit Leiden, Nederland. De auteurs willen ook Eva Colic bedanken voor haar hulp bij het kweken van de fluorescerende transformatoren. Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en het Mitacs Accelerate-programma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 Kb Plus DNA ladderFroggaBioDM015
AcetosyringoneFisher ScientificD26665G
Agrobacterium tumefaciensGold BiotechnologiesStrain: AGL-1; Gift van Prof. Paul HooykaasGenotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
BiotinEnzo Life Sciences89151-400
CaCl2·2H2OVWRBDH9224-1KG
CefotaximeAK ScientificJ90010
Chlorella vulgarisUniversity of Texas at Austin Culture Collection of AlgaeStrain: UTEX 395Wildtype strain
CoCl2·6H2OSigma AldrichC8661-25G
CuSO4·5H2OEMD MilliporeCX2185-1
FeCl3·6H2OVWRBDH9234-500G
Gene Pulser Xcell ElectroporatorBio-Rad1652662Hoogeenheid uitgerust met PC-module.
GeneJET Plant Genome Purification KitThermo ScientificK0791
Glacial azijnzuurVWRCABDH3093-2.2P
GlycerolBioBasicGB0232
HEPES-bufferSigma AldrichH-3375
Hygromycin BFisher ScientificAAJ6068103
K2HPO4VWRBDH9266-500G
KanamycinGold BiotechnologiesK-250-25
KH2PO4VWRBDH9268-500G
MgSO4·7H2OVWR97062-134
MnCl2·4H2OJT BakerBAKR2540-01
Na2CO3VWRBDH7971-1
Na2EDTA·2H2OJT Baker8993-01
Na2MoO4·2H2OJT BakerBAKR3764-01
NaClVWRBDH7257-7
NaH2PO4 H2OMillipore SigmaCA80058-650
NaNO3VWRBDH4574-500G
NEBExpress Ni ResinNewEngland BioLabsNEB #S1427
NH4ClVWRBDH9208-500G
pCAMBIA1302Leiden UniversityGift van Prof. Paul HooykaaspBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropyleen kolommen (5 mL)QIAGEN34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-gelabeld recombinant, 1 mLBio-Rad1610363
RifampicineMillipore SigmaR3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 InchSunBlaster210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometerBioTEKS4MLFPTA
TetracyclineThermo Scientific ChemicalsCAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%Bio-Rad1610185
ThiamineTCI AmericaT0181-100G
Tris BaseFisher ScientificBP152-500
TryptonBioBasicTG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamine)Enzo Life Sciences89151-436
Gist ExtractBioBasicG0961
ZnSO4·7H2OJT Baker4382-01

Referenties

  1. Smith, E. F., Townsend, C. O. A plant tumor of bacterial origin. Science. 25 (643), 671-673 (1907).
  2. Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
  3. De Cleene, M., De Ley, J. The host range of crown gall. The Botanical Review. 42, 389-466 (1976).
  4. Hooykaas, P. J., Schilperoort, R. A. Agrobacterium and plant genetic engineering. Plant Molecular Biology. 19, 15-38 (1992).
  5. Bundock, P., den Dulk-Ras, A., Beijersbergen, A., Hooykaas, P. J. J. Transkingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. The European Molecular Biology Organization. 14 (13), 3206-3214 (1995).
  6. Piers, K. L., Heath, J. D., Liang, X., Stephens, K. M., Nester, E. W. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (4), 1613-1618 (1996).
  7. Kumar, S. V., Misquitta, R. W., Reddy, V. S., Rao, B. J., Rajam, M. V. Genetic transformation of the green alga-Chlamydomonas reinhardtii by Agrobacteriumtumefaciens. Plant Science. 166 (3), 731-738 (2004).
  8. de Groot, M. J., Bundock, P., Hooykaas, P. J., Beijersbergen, A. G. Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology. 16 (9), 839-842 (1998).
  9. Hajdukiewicz, P., Svab, Z., Maliga, P. The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Molecular Biology. 25 (6), 989-994 (1994).
  10. Dehghani, J., Adibkia, K., Movafeghi, A., Pourseif, M. M., Omidi, Y. Designing a new generation of expression toolkits for engineering of green microalgae; robust production of human interleukin-2. BioImpacts. 10 (4), 259-268 (2020).
  11. Berndt, A. J., Smalley, T. N., Ren, B., Simkovsky, R., Badary, A., Sproles, A. E., Fields, F. J., Torres-Tiji, Y., Heredia, V., Mayfield, S. P. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii. PLoS One. 16, e0257089(2021).
  12. Li, A., Huang, R., Wang, C., Hu, Q., Li, H., Li, X. Expression of anti-lipopolysaccharide factor isoform 3 in Chlamydomonas reinhardtii showing high antimicrobial activity. Marine Drugs. 19 (5), 239(2021).
  13. Xue, B., Dong, C. M., Hu, H. H., Dong, B., Fan, Z. C. Chlamydomonas reinhardtii-expressed multimer of ToAMP4 inhibits the growth of bacteria of both Gram-positive and Gram-negative. Process Biochemistry. 91, 311-318 (2020).
  14. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17, 36(2018).
  15. Cha, T. S., Yee, W., Aziz, A. Assessment of factors affecting Agrobacterium-mediated genetic transformation of the unicellular green alga, Chlorella vulgaris. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 28, 1771-1779 (2012).
  16. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).
  17. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040, Rev C. , Bio-Rad Laboratories Inc. Accessed March (2023).
  18. NEBExpress Ni Resin Gravity Flow Typical Protocol. , New England Biolabs Inc. Accessed March https://international.neb.com/protocols/2019/09/10/nebexpress-ni-resin-gravity-flow-typical-protocol (2023).
  19. Ward, V. C. A., Rehmann, L. Fast media optimization for mixotrophic cultivation of Chlorella vulgaris. Scientific Reports. 9, 19262(2019).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Current Protocols in Microbiology. Chapter 1: Unit 3D.1. , (2012).
  21. Haddadi, F., Abd Aziz, M., Abdullah, S. N., Tan, S. G., Kamaladini, H. An efficient Agrobacterium-mediated transformation of strawberry cv. Camarosa by a dual plasmid system. Molecules. 20 (3), 3647-3666 (2015).
  22. Wang, X., Ryu, D., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Antibiotic use and abuse: a threat to mitochondria and chloroplasts with impact on research, health, and environment. Bioessays. 37 (10), 1045-1053 (2015).
  23. Gelvin, S. B. Plant DNA repair and Agrobacterium T-DNA integration. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8458(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Transformatie van microalgenAMT protocolgroen fluorescent eiwithygromycine B selectieplantexpressievectorstabiele transformatiemicroalgenbiotechnologie

Gerelateerde artikelen