Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

De ex vivo bereiding van een doorsnede van het ruggenmerg voor de opname van de patchklem in motorneuronen met hele cellen tijdens stimulatie van het ruggenmerg

3.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65385

⸱

8 september 2023

 ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Neuromodulation, School of Aerospace Engineering, Tsinghua University, 2IDG/McGovern Institute for Brain Research, Tsinghua University, 3School of Life Sciences, Tsinghua University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode met behulp van een patch-clamp om de elektrische reacties van motorneuronen op ruggenmergstimulatie (SCS) met een hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen, wat onderzoekers kan helpen hun vaardigheden te verbeteren bij het scheiden van het ruggenmerg en het tegelijkertijd handhaven van de levensvatbaarheid van de cel.

Samenvatting

Ruggenmergstimulatie (SCS) kan de bewegingsfunctie effectief herstellen na een dwarslaesie (SCI). Omdat de motorneuronen de laatste eenheid zijn om sensomotorisch gedrag uit te voeren, kan het direct bestuderen van de elektrische reacties van motorneuronen met SCS ons helpen de onderliggende logica van spinale motorische modulatie te begrijpen. Om tegelijkertijd verschillende stimuluskenmerken en cellulaire reacties vast te leggen, is een patch-clamp een goede methode om de elektrofysiologische kenmerken op eencellige schaal te bestuderen. Er zijn echter nog steeds enkele complexe moeilijkheden om dit doel te bereiken, waaronder het handhaven van de levensvatbaarheid van de cel, het snel scheiden van het ruggenmerg van de benige structuur en het gebruik van de SCS om met succes actiepotentialen te induceren. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol met behulp van patch-clamp om de elektrische reacties van motorneuronen op SCS met een hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen, wat onderzoekers kan helpen hun vaardigheden te verbeteren bij het scheiden van het ruggenmerg en tegelijkertijd de levensvatbaarheid van de cel te behouden om het elektrische mechanisme van SCS op motorneuron soepel te bestuderen en onnodig vallen en opstaan te voorkomen.

Inleiding

Ruggenmergstimulatie (SCS) kan de bewegingsfunctie effectief herstellen na een dwarslaesie (SCI). Andreas Rowald et al. meldden dat SCS de bewegings- en rompfunctie van de onderste ledematen binnen één dag mogelijkmaakt1. Het onderzoeken van het biologische mechanisme van SCS voor locomotorisch herstel is een cruciaal en trending onderzoeksgebied voor het ontwikkelen van een preciezere SCS-strategie. Het team van Grégoire Courtine toonde bijvoorbeeld aan dat excitatoire Vsx2-interneuron en Hoxa10-neuronen in het ruggenmerg de belangrijkste neuronen zijn voor de respons op SCS, en dat celspecifieke neuromodulatie haalbaar is om het loopvermogen van ratten na SCI2 te herstellen. Er zijn echter maar weinig studies die zich richten op het elektrische mechanisme van SCS op eencellige schaal. Hoewel het algemeen bekend is dat de bovendrempelige gelijkstroomstimulus de actiepotentialen (AP's) in het klassieke inktvisexperiment 3,4,5 kan opwekken, is het nog onduidelijk hoe de gepulseerde wisselende elektrische stimulatie, zoals SCS, de motorsignaalgeneratie beïnvloedt.

Gezien de complexiteit van intraspinale neurale circuits, is een geschikte selectie voor celpopulatie belangrijk voor het onderzoeken van het elektrische mechanisme van SCS. Hoewel SCS de motorische functie herstelt door de proprioceptieve route6 te activeren, zijn de motorneuronen de laatste eenheid om het motorcommando uit te voeren, afgeleid van de integratie van proprioceptie-informatie afferente input7. Daarom kan het rechtstreeks bestuderen van de elektrische kenmerken van motorneuronen met SCS ons helpen de onderliggende logica van spinale motormodulatie te begrijpen.

Zoals we weten, is patch-clamp de gouden standaardmethode voor cellulaire elektrofysiologische registratie met extreem hoge spatiotemporele resolutie8. Daarom beschrijft deze studie een methode met behulp van een patchklem om de elektrische reacties van motorneuronen op SCS te bestuderen. Vergeleken met de hersenpleisterklem9 is de ruggenmergklem moeilijker om de volgende redenen: (1) Het ruggenmerg wordt beschermd door het wervelkanaal met een klein volume, wat zeer fijne micromanipulatie en rigoureus ijskoud onderhoud vereist om een betere cellevensvatbaarheid te verkrijgen. (2) Omdat het ruggenmerg te slank is om op de snijplaat te worden vastgezet, moet het worden ondergedompeld in agarose met een laag smeltpunt en na stolling worden bijgesneden.

Daarom biedt deze methode technische details bij het ontleden van het ruggenmerg en het tegelijkertijd handhaven van de levensvatbaarheid van de cel, om het elektrische mechanisme van SCS op motorneuronen soepel te bestuderen en onnodige vallen en opstaan te voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De Institutional Animal Care and Use Committee keurde alle dierproeven goed en de onderzoeken werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante dierenwelzijnsvoorschriften.

1. Bereiding van dieren

  1. Dieren
    1. Huisvestingsinformatie: Huisvest mannelijke Sprague-Dawley-ratten (postnataal 10-14 dagen, P10-P14) in een specifieke pathogeenvrije omgeving.
      OPMERKING: De kamercondities werden gehandhaafd op 20 °C ± 2 °C, vochtigheid: 50%-60%, met een licht/donkercyclus van 12 uur. Dieren hadden vrije toegang tot voedsel en water.
    2. Label de motorneuronen retrograde: Injecteer Fluoro-Gold (FG) in de bilaterale tibialis anterior en gastrocnemius-spier (2% in steriele zoutoplossing, 50 μL per spier) om de motorneuronen 2 dagen voor het offer retrograde te labelen.
  2. Oplossingen
    1. Snijoplossing bereiden: Meng 120 mM Cholinechloride, 2,6 mM KCl, 26 mM NaHCO 3, 1,25 mM NaH 2 PO4, 0,5 mM CaCl 2, 7 mM MgCl2, 1,3 mM Ascorbinezuur, 15 mM glucose. Laat de oplossing voor bubbelen met 95%O2 en 5% CO2 (stel in op pH 7,4 met KOH) gedurende 30 minuten voor de dissectie en het snijden. Koel de oplossing af met gemalen ijs.
    2. Bereid kunstmatig hersenvocht (ACSF): Meng 126 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM NaH2PO4; 1,3 mM MgCl 2, 2,4 mM CaCl2, 26 mM NaHCO3 en 10 mM glucose. Laat de oplossing vóór de incubatie 30 minuten voor de incubatie opborrelen met 95%O2 en 5% CO 2 (CO2).
    3. Bereid een intracellulaire oplossing voor: Meng 126 mM K-gluconaat, 2 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM Na 2 ATP, 0,4 mM Na2GTP, 10 mM K-fosfocreatine en 0,5% neurobiotine (pH 7,25 en 305 mOsm/kg). Koel de oplossing af met gemalen ijs.
    4. Bereid agarosegel met een laag smeltend gehalte: Los 4 g agarose op in 100 ml snijoplossing en gebruik een magnetische roerrotor om het volledig op te lossen. Verwarm de agarose met laag smeltpunt 30 minuten voor het inbedden gedurende 1 minuut in de magnetron met hoog vermogen en breng deze vervolgens over in een waterbad van 39 °C om de vloeibare toestand te behouden.
  3. Voorbereiding van het instrument
    1. Plaats gemalen ijs op de perfusielade (aanvullende figuur 1A) 10 minuten voor de perfusie. Plaats de anatomische lade (aanvullende afbeelding 1B) en de snijplaat (aanvullende afbeelding 1C) met een waterband op -80 °C een nacht van tevoren.
    2. Plaats de incubatiekamer met nylon gaas een nacht van tevoren in de oven op 45 °C.
    3. Gebruik agarose met een laag smeltpunt om een helling van 35° en een platform van 2 mm dik te prefabriceren (aanvullende afbeelding 1D). Plaats ze na het stollen van de gel in het midden van een petrischaal van 35 mm om het ruggenmerg te ondersteunen bij de volgende procedures.
  4. Intracardiale perfusie
    1. Verdoof de ratten met 2,5% tribroomethanol (160 μl/10 g) via intraperitoneale injectie. Zorg ervoor dat de ratten volledig verdoofd zijn door het gebrek aan reactie op externe stimuli, zoals een zacht knijpen in de teen, te verifiëren.
    2. Wanneer de juiste verdoving is bevestigd, plaatst u de ratten op hun rug en immobiliseert u ze in de petrischaal gevuld met silicagel.
    3. Snijd een incisie van 5 mm in de lengterichting van de huid caudaal af naar de processus xiphoid en breid vervolgens de onderhuidse ruimte volledig uit. Snijd een incisie van 2 cm in de lengterichting van de huid langs de ventrale middellijn om de buitenste borstwand volledig bloot te leggen, beginnend met de bovengenoemde incisie en eindigend met de bovenkant van de borstkas.
    4. Gebruik een getande pincet om de xiphoid op te tillen (aanvullende figuur 2A) en gebruik vervolgens een fijne schaar om het diafragma door te knippen. Snijd het borstbeen langs beide zijden van de processus xiphoid door om de borstkas te openen en het hart bloot te leggen (aanvullende figuur 2B).
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u de interne thoracale vaten aan beide zijden behoudt; anders kan het enorme bloedingen veroorzaken.
    5. Gebruik een tandeloos pincet om de linker hartkamer op te tillen. Steek een naald van 22 G in de linkerventrikeltop langs de lengteas van de linkerventrikel (aanvullende figuur 2C). Let ondertussen op de ritmische bloedpulsatie in de perfusiebuis, anders kan de naald in de rechterhartkamer prikken, wat kan leiden tot een slecht perfusie-effect.
      NOTITIE: Een pincet met tand mag niet worden gebruikt; anders kan het extra bloedlekkage uit de pincethoudplaats veroorzaken.
    6. Gebruik een fijne schaar om het rechter atrium af te knippen (aanvullende figuur 2C) en injecteer vervolgens handmatig 100 ml ijskoude perfuseervloeistof met een snelheid van ongeveer 2 ml/s binnen 1 minuut.
      OPMERKING: Wanneer de lever en poten van ratten bleek worden en er geen bloed uit het rechter atrium stroomt, kan een goede perfusie worden bereikt.
  5. Dissectie van het ruggenmerg (figuur 1)
    1. Plaats de rat in buikligging en snijd de wervelkolom door bij respectievelijk de voorste superieure iliacale wervelkolom (ongeveer L4 wervelniveau) en het krommingsverschuivende punt van de thoracale kolom (ongeveer T6 wervelniveau) (Figuur 1A). Plaats vervolgens onmiddellijk de geïsoleerde wervelkolom in de zuurstofrijke ijskoude perfuseeroplossing om het resterende bloed- en vetweefsel af te wassen; Deze procedure is gunstig voor het schoonhouden van het operatieveld in de volgende procedures.
      OPMERKING: De paraspinale spieren moeten worden gereserveerd, wat bevorderlijk is voor de daaropvolgende fixatie van de wervelkolom met behulp van een insectenspeld.
    2. Breng de geïsoleerde wervelkolom onmiddellijk over naar de anatomische lade (Figuur 1B) met de dorsale zijde naar boven en het rostrale uiteinde dicht bij de operator. Vul de anatomische bak met 50 ml continu zuurstofrijke ijskoude snijoplossing (Figuur 1B).
    3. Gebruik vier insectenpinnen om de wervelkolom vast te zetten door de paraspinale spieren te penetreren (Figuur 1B).
    4. Snijd onder de dissectiemicroscoop de wervelsteeltjes van beide zijden van het rostrale uiteinde met de microschaar, wat "laminectomie" kan worden genoemd (Figuur 1C). Let op dat u het ruggenmerg niet beschadigt. Gebruik ondertussen het micro-getande pincet om het doorgesneden wervellichaam op te tillen.
    5. Scheid na de laminectomie het ruggenmerg niet onmiddellijk van het wervelkanaal. Gebruik in plaats daarvan een microschaar om de dura mater langs de dorsale middellijn door te snijden, wat bevorderlijk is voor de opname van voedingsstoffen tussen cellen en zuurstofrijke ACSF (Figuur 1D).
      NOTITIE: Scheur de dura mater nooit. Alleen het knippen van de dura mater met een microschaar is toegestaan; Anders worden de zenuwwortel en het spinale parenchym ernstig beschadigd!
    6. Til het rostrale deel van het ruggenmerg op en snijd vervolgens voorzichtig de zenuwwortel door met ongeveer 1 mm gereserveerd (Figuur 1E). Nadat u het ruggenmerg van het wervelkanaal hebt gescheiden, gebruikt u 2 insectenpennen om het ruggenmerg met de buikzijde naar boven vast te zetten (Figuur 1F).
    7. Gebruik een microschaar om de dura mater langs de ventrale middellijn door te knippen (Figuur 1F). Snijd de overtollige zenuwwortels af met ongeveer 1 mm gereserveerd.
      OPMERKING: De zenuw is veel hardnekkiger dan het ruggenmerg. Als de gereserveerde zenuwwortel te lang is (>1 mm), kan het vibratoom de zenuwwortel niet afsnijden, wat kan leiden tot een ernstige scheur in het spinale parenchym.
    8. Gebruik een microschaar om de lumbale vergroting te scheiden tot een lengte van 6-7 mm (Figuur 1G).
  6. Inbedding in de laagsmeltende agarose
    1. Plaats de lumbale vergroting op de helling van 35 ° (Figuur 1H) met de dorsale zijde naar boven en het staartuiteinde naar beneden. Gebruik een absorberend filtreerpapier om overvloedig water op het weefseloppervlak te verwijderen (Figuur 1H).
    2. Giet langzaam de gesmolten agarosegel in de petrischaal met de lumbale vergroting (Figuur 1I).
      OPMERKING: Giet niet te snel, anders hopen zich luchtbellen op in de gel.
    3. Plaats de bovenstaande petrischaal in het ijs-watermengsel om de gel zo snel mogelijk af te koelen, wat bevorderlijk is voor het behoud van de activiteit van cellen.
    4. Snijd de gel in een kubus van 15 mm x 10 mm x 10 mm en monteer deze met secondelijm op de preparaatschijf (Figuur 1J).
  7. Snijden
    1. Plaats de preparaatschijf in de voorgevroren snijplaat en giet vervolgens de ijskoude snijoplossing (Figuur 1K). Continu bubbelen met 95% CO 2 en 5% O2 in de snijplaat.
    2. Stel de vibratoomparameters in: dikte: 350 μm; snelheid: 0,14-0,16 mm/s, amplitude: 1,0 mm en trillingsfrequentie: 85 Hz.
    3. Oogst 2-3 geschikte plakjes per dier. Registreer 1-2 gezonde FG+ motorneuronen per plak, met een bereik van 5-6 cellen per dier.
  8. Incubatie
    1. Gebruik een pincet om een plakje af te knippen (Figuur 1L) en plaats het in de incubatiekamer gevuld met continu zuurstofrijk ACSF. Plaats de incubatiekamer gedurende 30 minuten in een waterbad bij 32 °C en blijf deze vervolgens nog 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) incuberen voordat u gaat opnemen.
      OPMERKING: De bovenstaande procedures, van anesthesie tot het verkrijgen van de eerste plak, moeten binnen 20-30 minuten worden voltooid om de levensvatbaarheid van cellen zoveel mogelijk te behouden. De motorneuronen in elke plak kunnen hun levensvatbaarheid ongeveer 6-7 uur behouden.

2. Patch-clamp opname met SCS (Figuur 2)

  1. Voorbereidingen
    1. Doordrenk de opnamekamer met continu geborrelde ACSF met een snelheid van ongeveer 1-2 ml/min. Pas het debiet individueel aan via het bedieningspaneel op de slangenpomp.
    2. Plaats een plakje in de opnamekamer. Gebruik de U-vormige platinadraad met nylondraden om de plak stevig op zijn plaats te stabiliseren.
    3. Gebruik een infrarood differentiële interferentiecontrastmicroscoop (IR-DIC) om de plak te observeren. Controleer onder de 4x objectieflens dat de lengte van de dorsale wortel ongeveer 1 mm is. Zoek het gebied waar de dorsale wortel het parenchym binnenkomt en verplaats vervolgens het centrale gezichtsveld naar dit gebied.
    4. Sluit de pulsgenerator aan op maat gemaakte elektroden (Figuur 2A).
  2. SCS-configuratie
    1. Plaats de anode van SCS in de buurt van de dorsale middellijn via het micromanipulatiesysteem (Figuur 2B).
    2. Plaats de kathode van SCS in de buurt van de dorsale wortelingangszone (DREZ) via het micromanipulatiesysteem (Figuur 2B).
  3. Celtargeting en beeldvorming
    1. Gebruik IR-DIC met een 10x objectieflens om ruwweg het dorsolaterale gebied van de motorkolom te vinden, waar de meeste motorneuronen zich bevinden. Verplaats vervolgens het centrale gezichtsveld naar dit gebied.
    2. Schakel over naar een 60x objectieflens om een gezond neuron te vinden met een glad en helder oppervlak en onzichtbare kernen (Figuur 2C,F).
    3. Verlaag de IR-intensiteit iets en schakel de fluorescentielichtbron in. Schakel het lichtfilter over naar het breedband ultraviolette excitatiefilter (Figuur 2D,G) om een geschikt FG-positief (FG+) motorneuron te selecteren (Figuur 2E,H).
    4. Gebruik zuigelektroden om 1x motordrempelstimulatie toe te passen op de dorsale wortel. Als een evoked action potential wordt gedetecteerd in de motorneuronen (aanvullende figuur 3), bevestigt dit dat de activiteit van de dorsale wortel intact is. Als dit niet het geval is, moet dit plakje worden weggegooid.
  4. Patch-clamp opname
    1. Vul de micropipet met de intracellulaire oplossing en plaats deze in de elektrodehouder. Gebruik het micromanipulatiesysteem om de pipet in het ACSF-bad te laten zakken. De pipetweerstand varieert van 5-8 MΩ.
    2. Oefen een kleine hoeveelheid positieve druk uit op de pipet om het stof en celvuil weg te blazen.
      1. Laat de elektrode zakken om de cel te naderen. Wanneer de pipet het oppervlak van het FG+ neuron raakt, wordt een kleine inkeping van het membraan zichtbaar ter hoogte van de tip. Laat de overdruk los.
      2. Oefen vervolgens met een injectiespuit een kleine hoeveelheid onderdruk uit op de pipet. Hierdoor ontstaat een kleine hoeveelheid zuigkracht die het celmembraan in contact brengt met de glazen pipet. Let altijd op de totale weerstand op de software-interface totdat de weerstandswaarde toeneemt tot gigaohm (>1 GΩ). Vervolgens wordt de gigaseal gevormd.
    3. Klem de membraanpotentiaal op -70 mV en druk vervolgens op de knop voor snelle capaciteitscompensatie op de software-interface van de versterker. Oefen voorzichtig een tijdelijke negatieve druk uit om het celmembraan te scheuren en druk vervolgens op de langzame capaciteitscompensatieknop op de software-interface van de versterker. Op dit punt wordt een goede configuratie van de hele cel verkregen.
    4. Schakel over naar de stroomtangmodus door op de IC-knop op de software-interface te klikken en registreer het rustmembraanpotentiaal (RMP).
    5. Pas de SCS 1-2 s toe met een amplitude van 1-10 mA, terwijl de pulsbreedte en -frequentie zijn vastgesteld op respectievelijk 210 μs en 40 Hz. Bepaal de motorische drempel door de stimulatieamplitude langzaam te verhogen totdat de eerste AP wordt waargenomen.
    6. Onderscheid vertraagde en onmiddellijk vurende motorneuronen met behulp van een depolariserende stroominjectie van 5 s rond de rheobase in de stroomklemmodus10,11,12. Onmiddellijk vurende motorneuronen: Lage rheobase kan onmiddellijk en repetitief vuren induceren met een stabiele vuurfrequentie; Vertraagd vurende motorneuronen: Een hoge rheobase kan een vertraagd begin induceren voor herhaald vuren met een versnellende vuursnelheid (Figuur 3).
    7. Wanneer SCS is uitgeschakeld, gaat u door met het opnemen van het membraanpotentiaal voor het opvangen van de spontane AP's die worden afgevuurd.
    8. Voer voltage-clamp-opnames uit voltage-clamp-opnames voor excitatoire postsynaptische stroom (EPSC) wanneer SCS is in- en uitgeschakeld. De stimulatieparameter is 1x motordrempel, 210 μs, 2 Hz.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dankzij het rigoureuze onderhoud bij lage temperaturen tijdens de fijne werking (aanvullende figuur 1, aanvullende figuur 2 en figuur 1) was de levensvatbaarheid van de cel goed genoeg om latere elektrofysiologische opnames uit te voeren. Om het klinische scenario zoveel mogelijk te simuleren, gebruikten we micromanipulatie om de SCS-kathode en anode respectievelijk in de buurt van de dorsale middellijn en DREZ te plaatsen (Figuur 2), wat een ne...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De bewegingsinformatie die door SCS wordt gemoduleerd, wordt uiteindelijk geconvergeerd naar de motorneuronen. Daarom kan het nemen van de motorneuronen als onderzoeksdoel de onderzoeksopzet vereenvoudigen en het neuromodulatiemechanisme van SCS directer onthullen. Om tegelijkertijd verschillende stimuluskenmerken en cellulaire reacties vast te leggen, is een patch-clamp een goede methode om de elektrofysiologische kenmerken op eencellige schaal te bestuderen. Er zijn echter nog steeds enkele moeilijkheden, waaronder hoe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China for Young Scholars (52207254 en 82301657) en het China Postdoctoral Science Fund (2022M711833).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adenosine 5’-trifosfaat magnesiumzoutSigmaA9187
AscorbinezuurSigmaA4034
CaCl2·2H2OSigmaC5080
CholinechlorideSigmaC7527
DekglaspincetVETUS36A-SAKlep een plakje
D-GlucoseSigmaG8270
EGTASigmaE4378
Fijne schaarRWD Life ScienceS12006-10Snij het diafragma
Fluorescentie lichtbronOlympus U-HGLGPS
Fluoro-GoldFluorochromeFluorochromeLabel de motorneuron
Guanosine 5′-trifosfaat natriumzout hydraatSigmaG8877
HEPESSigmaH3375
Infrarood CCD-cameraDage-MTIIR-1000E
KClSigmaP5405
K-gluconaatSigmaP1847
Agarose met laag smeltpuntSigmaA9414
MgSO4·7H2OSigmaM2773
Micromanipulator Sutter Instrument MP-200
Micropipet pullerSutter instrumentP1000
Micro-schaar Jinzhongwa1020Laminectomie
Microscoop voor anatomieOlympus SZX10
Microscoop voor eclectrofysiologieOlympus BX51WI
Micro-getande pincetRWD Life ScienceF11008-09Til het gesneden wervellichaam op
NaClSigmaS5886
NaH2PO4SigmaS8282
NaHCO3SigmaV900182
Na-FosfocreatineSigmaP7936
Objectieflens voor eclectrofysiologieOlympus LUMPLFLN60XWwerkafstand 2 mm 
Osmometer Advanced FISKE 210
Patch-clamp versterker Axon Multiclamp 700B
Patch-clamp digitizerAxon Digidata 1550B
pH-meter Mettler Toledo FE28
Slice AnchorMultichannel systemSHD-27H
Ruggenmerg stimulatorPINST901
Getande pincetRWD Life ScienceF13030-10Til het xiphoïd op
VibratomeLeicaVT1200S
Breedband ultraviolet exctatiever filterOlympus U-MF2

Referenties

  1. Rowald, A., et al. Activity-dependent spinal cord neuromodulation rapidly restores trunk and leg motor functions after complete paralysis. Nature Medicine. 28 (2), 260-271 (2022).
  2. Kathe, C., et al. The neurons that restore walking after paralysis. Nature. 611 (7936), 540-547 (2022).
  3. Smith, S. J., Buchanan, J., Osses, L. R., Charlton, M. P., Augustine, G. J. The spatial distribution of calcium signals in squid presynaptic terminals. The Journal of Physiology. 472, 573-593 (1993).
  4. Augustine, G. J. Regulation of transmitter release at the squid giant synapse by presynaptic delayed rectifier potassium current. The Journal of Physiology. 431, 343-364 (1990).
  5. Llinás, R., McGuinness, T. L., Leonard, C. S., Sugimori, M., Greengard, P. Intraterminal injection of synapsin I or calcium/calmodulin-dependent protein kinase II alters neurotransmitter release at the squid giant synapse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (9), 3035-3039 (1985).
  6. Formento, E., et al. Electrical spinal cord stimulation must preserve proprioception to enable locomotion in humans with spinal cord injury. Nature Neuroscience. 21 (12), 1728-1741 (2018).
  7. Hari, K., et al. GABA facilitates spike propagation through branch points of sensory axons in the spinal cord. Nature Neuroscience. 25 (10), 1288-1299 (2022).
  8. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review Of Physiology. 46, 455-472 (1984).
  9. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B. The preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (116), e54525(2016).
  10. Sharples, S. A., Miles, G. B. Maturation of persistent and hyperpolarization-activated inward currents shapes the differential activation of motoneuron subtypes during postnatal development. Elife. 10, e71385(2021).
  11. Bhumbra, G. S., Beato, M. Recurrent excitation between motoneurones propagates across segments and is purely glutamatergic. PLoS Biology. 16 (3), e2003586(2018).
  12. Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Elife. 3, 04046(2014).
  13. Tahir, R. A., Pabaney, A. H. Therapeutic hypothermia and ischemic stroke: A literature review. Surgical Neurology International. 7, S381-S386 (2016).
  14. Lu, Y., et al. Management of intractable pain in patients with implanted spinal cord stimulation devices during the COVID-19 pandemic using a remote and wireless programming system. Frontiers in Neuroscience. 14, 594696(2020).
  15. Yao, Q., et al. Wireless epidural electrical stimulation in combination with serotonin agonists improves intraspinal metabolism in spinal cord injury rats. Neuromodulation. 24 (3), 416-426 (2021).
  16. Arlotti, M., Rahman, A., Minhas, P., Bikson, M. Axon terminal polarization induced by weak uniform dc electric fields: a modeling study. 2012 Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 4575-4578 (2012).
  17. Espino, C. M., et al. Na(V)1.1 is essential for proprioceptive signaling and motor behaviors. Elife. 11, e79917(2022).
  18. Romer, S. H., Deardorff, A. S., Fyffe, R. E. W. A molecular rheostat: Kv2.1 currents maintain or suppress repetitive firing in motoneurons. The Journal of Physiology. 597 (14), 3769-3786 (2019).
  19. Yao, X., et al. Structures of the R-type human Ca(v)2.3 channel reveal conformational crosstalk of the intracellular segments. Nature Communications. 13 (1), 7358(2022).
  20. Bandres, M. F., Gomes, J., McPherson, J. G. Spontaneous multimodal neural transmission suggests that adult spinal networks maintain an intrinsic state of readiness to execute sensorimotor behaviors. Journal Of Neuroscience. 41 (38), 7978-7990 (2021).
  21. Manuel, M., Heckman, C. J. Simultaneous intracellular recording of a lumbar motoneuron and the force produced by its motor unit in the adult mouse in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (70), e4312(2012).
  22. Luo, X., Wang, S., Rutkove, S. B., Sanchez, B. Nonhomogeneous volume conduction effects affecting needle electromyography: an analytical and simulation study. Physiological Measurement. 42 (11), (2021).
  23. Barra, B., et al. Epidural electrical stimulation of the cervical dorsal roots restores voluntary upper limb control in paralyzed monkeys. Nature Neuroscience. 25 (7), 924-934 (2022).
  24. Powell, M. P., et al. Epidural stimulation of the cervical spinal cord for post-stroke upper-limb paresis. Nature Medicine. 29 (3), 689-699 (2023).
  25. Wenger, N., et al. Spatiotemporal neuromodulation therapies engaging muscle synergies improve motor control after spinal cord injury. Nature Medicine. 22 (2), 138-145 (2016).
  26. Özyurt, M. G., Ojeda-Alonso, J., Beato, M., Nascimento, F. In vitro longitudinal lumbar spinal cord preparations to study sensory and recurrent motor microcircuits of juvenile mice. Journal of Neurophysiology. 128 (3), 711-726 (2022).
  27. Moraud, E. M., et al. Mechanisms underlying the neuromodulation of spinal circuits for correcting gait and balance deficits after spinal cord injury. Neuron. 89 (4), 814-828 (2016).
  28. Capogrosso, M., et al. A computational model for epidural electrical stimulation of spinal sensorimotor circuits. Journal of Neuroscience. 33 (49), 19326-19340 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Elektrofysiologische registratiecelviabiliteitactiepotentialenruggenmergletselvibratoomsnijden
De ex vivo bereiding van een doorsnede van het ruggenmerg voor de opname van de patchklem in motorneuronen met hele cellen tijdens stimulatie van het ruggenmerg
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.