Hier presenteren we een alternatief protocol om actief experimentele auto-immuun encefalomyelitis te induceren bij C57BL / 6-muizen, met behulp van het immunogene epitoop myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) 35-55 gesuspendeerd in onvolledig Freund's adjuvans met de hitte-gedode Mycobacterium avium ondersoort paratuberculosis.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Adjuvante activiteit van mycobacterium paratuberculosis bij het verbeteren van de immunogeniciteit van autoantigenen tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) geïnduceerd door myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) vereist immunisatie door een MOG-peptide geëmulgeerd in volledig Freund's adjuvans (CFA) met geïnactiveerde Mycobacterium tuberculosis. De antigene componenten van de mycobacterie activeren dendritische cellen om T-cellen te stimuleren om cytokines te produceren die de Th1-respons bevorderen via toll-like receptoren. Daarom zijn de hoeveelheid en soorten mycobacteriën die aanwezig zijn tijdens de antigene uitdaging direct gerelateerd aan de ontwikkeling van EAE. Dit methodedocument presenteert een alternatief protocol om EAE te induceren in C57BL / 6-muizen met behulp van een gemodificeerd onvolledig Freund-adjuvans dat de door hitte gedode Mycobacterium avium-ondersoort paratuberculosestam K-10 bevat.
M. paratuberculosis, een lid van het Mycobacterium avium-complex, is de veroorzaker van de ziekte van Johne bij herkauwers en is geïdentificeerd als een risicofactor voor verschillende menselijke T-cel-gemedieerde aandoeningen, waaronder multiple sclerose. Over het algemeen vertoonden muizen geïmmuniseerd met Mycobacterium paratuberculosis een eerder begin en een grotere ernst van de ziekte dan muizen geïmmuniseerd met CFA die de stam van M. tuberculosis H37Ra bevatten in dezelfde doses van 4 mg / ml. De antigene determinanten van Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) stam K-10 waren in staat om een sterke Th1 cellulaire respons te induceren tijdens de effectorfase, gekenmerkt door significant hogere aantallen T-lymfocyten (CD4+ CD27+), dendritische cellen (CD11c+ I-A/I-E+), en monocyten (CD11b+ CD115+) in de milt in vergelijking met muizen geïmmuniseerd met CFA. Bovendien bleek de proliferatieve T-celrespons op het MOG-peptide het hoogst te zijn bij M. paratuberculosis-geïmmuniseerde muizen. Het gebruik van een encefalitogeen (bijv. MOG35-55) geëmulgeerd in een adjuvans met M. paratuberculose in de formulering kan een alternatieve en gevalideerde methode zijn om dendritische cellen te activeren voor het primen van myeline-epitoopspecifieke CD4+ T-cellen tijdens de inductiefase van EAE.
Inleiding
Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is een gemeenschappelijk model voor de studie van menselijke demyeliniserende aandoeningen1. Er zijn verschillende modellen van EAE: actieve immunisatie met behulp van verschillende myelinepeptiden in combinatie met krachtige adjuvantia, passieve immunisatie door in vitro overdracht van myeline-specifieke CD4 + lymfocyten en transgene modellen van spontane EAE2. Elk van deze modellen heeft specifieke kenmerken waarmee verschillende aspecten van EAE kunnen worden bestudeerd, zoals het begin, de effectorfase of de chronische fase. Het myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) model van EAE is een goed model om de immuungemedieerde mechanismen van chronische neuro-inflammatie en demyelinisatie te bestuderen, omdat het wordt gekenmerkt door mononucleaire inflammatoire infiltratie, demyelinisatie in perifere witte stof en verminderd herstel na de ziektepiek1.
MOG-EAE wordt geïnduceerd door immunisatie van gevoelige muizen met het peptide MOG35-55 in volledig Freund's adjuvans (CFA), gevolgd door een intraperitoneale injectie van kinkhoesttoxine. Dit verhoogt de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière en zorgt ervoor dat myeline-specifieke T-cellen die in de periferie worden geactiveerd, het centrale zenuwstelsel (CZS) bereiken, waar ze worden gereactiveerd3. CFA speelt een sleutelrol in de inductie van EAE door het verbeteren van de antigeenopname door antigeen-presenterende cellen en de expressie van cytokines gerelateerd aan humorale- en celgemedieerde responsen4. Dit mechanisme is voornamelijk te wijten aan de aanwezigheid van gedode Mycobacterium tuberculosis geëmulgeerd in olie, waarvan de componenten een sterke stimulans vormen voor het immuunsysteem5. In feite is de inductie van EAE direct gerelateerd aan de hoeveelheid mycobacterie die aanwezig is tijdens de antigene uitdaging6.
De toevoeging van andere gedode mycobacteriën, zoals Mycobacterium butyricum, aan het onvolledige adjuvans7 van Freund, evenals het effect van adjuvante combinaties8, kan het klinische beloop van EAE moduleren en bijgevolg de reproduceerbaarheid van de resultaten beïnvloeden. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), de etiologische verwekker van de ziekte van Johne bij herkauwers, is in verband gebracht met ontstekingsstoornissen van het menselijk CZS 9, omdat de antigene componenten ervan in staat zijn om een sterke humorale en celgemedieerde respons op te wekken bij patiënten met multiple sclerose en neuromyelitis optica spectrum stoornis9. Daarom tonen we in dit protocol een alternatieve en reproduceerbare methode om MOG-EAE te induceren door M. tuberculosis in CFA te vervangen door M. paratuberculosis.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle muizenexperimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Juntendo University School of Medicine (goedkeuringsnummer 290238) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines for Animal Experimentation.
1. Algemene opmerkingen over het experiment
- Plaats de muizen in individuele kooien in de dierenfaciliteit onder gecontroleerde, pathogeenvrije omstandigheden bij 23 °C ± 2 °C met 50% ± 10% vochtigheid en een licht/donkercyclus van 12 uur met ad libitum toegang tot voedsel en water.
- Injecteer de muizen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder antigeen en CFA, en gebruik ze als respectievelijk negatieve en positieve controles.
2. Bereiding van mycobacteriële antigenen
- Kweek de M. paratuberculosis K-10 stam in Middlebrook vloeibaar medium 7H9 verrijkt met 10% OADC (oliezuur, albumine, dextrose, catalase), 0,005% Tween 80 en 2 mg/L mycobactine J gedurende 2 weken in T25 weefselkweekkolven bij 37 °C. Beoordeel de koloniegroei regelmatig door visuele inspectie.
LET OP: Behandel M. paratuberculose in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) faciliteit. - Kweek de verrijkingscultuurina erlenmeyer van 500 ml met een suspensie van 1,7 × 105 kolonievormende eenheden (CFU)/ml in een eindvolume van 200 ml (zelfde medium als stap 2.1) gedurende 1 week in een schudincubator.
OPMERKING: Aangezien verontreinigende organismen de resultaten kunnen beïnvloeden, moeten de bacteriën worden ingeënt op Middlebrook 7H10 vaste media om de morfologie van de kolonie te bepalen en de zuiverheid te verifiëren door conventionele polymerasekettingreactie (PCR) detectiekits voor M. paratuberculosis. - Inactiveer de bacteriële suspensies gedurende 5-10 minuten bij 70 °C en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3.000 × g . Was de gewogen pellet tweemaal in PBS, verstoor door ultrasoonapparaat en bewaar bij -20 °C.
- Breng de pellet over in een steriele container en vries deze in met droogijs of vloeibare stikstof. Breng onmiddellijk over naar een vriesdroogkamer.
- Vriesdroog (4 uur bij -50 °C onder vacuüm) M. paratuberculose volgens de machinehandleiding.
- Aan het einde van de lyofilisatie verwijdert u de roestvrijstalen container uit de vriesdroger en brengt u deze over naar een bioreinigingsbank. Gebruik een roestvrijstalen spatel om de gedroogde MAP-klonten die aan de binnenwand van de roestvrijstalen container hechten los te maken en verpulver ze zo fijn mogelijk.
- Weeg de verpulverde cellen met behulp van een elektronische balans en plaats ze handmatig in een aseptische injectieflacon van 10 ml in een concentratie van 10 mg / ml.
OPMERKING: De celdichtheid werd gekwantificeerd als gram drooggewicht per liter monster. Na 3 weken bevat 1 mg (nat gewicht) bacteriële celpellet ongeveer 2,5 × 108 kve.
3. Bereiding van MOG 35-55 emulsie
- Maal de inhoud van één injectieflacon gedroogde M. paratuberculosis (10 mg) tot een fijn poeder met een vijzel en stamper en voeg 10 ml toe aan het adjuvans van Freund om een stamoplossing van 10 mg / ml te verkrijgen. Bewaren bij -4 °C.
- Verdun vóór immunisatie de stamoplossing tot een eindconcentratie van 4 mg / ml.
- Verdun het peptide MOG35-55 in ddH 2 O tot een eindconcentratie van2mg/ml en bewaar bij -20 °C.
- Meng met behulp van een homogenisator de MOG35-55-oplossing (2 mg / ml) met een gelijk volume adjuvans (4 mg / ml) vanaf stap 3.2 in een buis van 5 ml totdat een dikke emulsie is gevormd. Na elke 10 s mengen, plaats de oplossing gedurende 20 s op ijs en draai de buis om alle oplossing te herstellen.
- Breng de emulsie over in een spuit van 1 ml, verwijder alle lucht en voeg een naald van 27 G toe. De emulsie is nu klaar voor injectie.
NOTITIE. Aangezien er tijdens de bereiding enig verlies van de viskeuze emulsie van MOG35-55 optreedt, is het het beste om 1,5 keer de benodigde hoeveelheid te bereiden.
4. Immunisatie van dieren
- Verdoof de dieren met inademing van isofluraan om stress op de dieren te minimaliseren.
- Injecteer de emulsie (200 μL met 200 μg/muis van MOG35-55) subcutaan in de onderrug.
- Dien een dosis kinkhoesttoxine (100 μL met 200 ng/muis) intraperitoneaal toe op dag 0 en 2 na immunisatie.
LET OP: Kinkhoest toxine heeft een meervoudig onderdrukkend effect op het immuunsysteem; Vermijd inname en contact met ogen en huid.
5. Klinische evaluatie
- Controleer de muizen dagelijks op gewicht en klinische symptomen. Gebruik het volgende scoresysteem: 0 = geen klinische symptomen; 1 = slappe staart; 2 = aantasting van de rechtrichtreflex en zwakte van de achterpoten; 3 = volledige verlamming van de achterpoten; 4 = volledige verlamming van de achterpoten met gedeeltelijke verlamming van de voorpoten; 5 = zieltogend.
OPMERKING: Bij de eerste waarneming van klinische symptomen krijgen dieren meer toegang tot water en voedsel. Knaagdier chow wordt verzacht en bevochtigd en vervolgens op de kooivloer van de voedseltrechter geplaatst. In het geval van gedehydrateerde dieren wordt suppletie met onderhuidse vloeistof toegediend of wordt een knaagdier chow-slurry toegediend via orale maagsonde. Als een muis dit soort hulp langer dan 3 dagen nodig heeft, wordt euthanasie uitgevoerd. - Om pijn en angst bij dieren te voorkomen of te minimaliseren, gebruikt u de volgende menselijke eindpunten: gewichtsverlies van meer dan 20%, klinische score ≥4,0, afwezigheid van de rechtrichtreflex bij score 3 en wanneer het dier gedurende 24 uur geen toegang heeft tot voer of water.
OPMERKING: De muizen werden geëuthanaseerd op dag 30 na EAE-inductie door intraperitoneale injecties van pentobarbital (≥150 mg / kg).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Groepen C57BL/6-muizen (totaal n = 15/groep) werden geïmmuniseerd met MOG35-55 in een emulsie die M. paratuberculose bevatte of volgens de gebruikelijke methode met CFA. Alle groepen muizen manifesteerden een acute monofasische ziekte gekenmerkt door een enkele piek van invaliditeit waargenomen na 14-17 dagen, gevolgd door een gedeeltelijk herstel van de symptomen gedurende de volgende 10 dagen (figuur 1A). Muizen geïmmuniseerd met het adj...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We demonstreerden een robuust alternatief protocol om actief ernstige EAE te induceren in C57BL / 6J-muizen met behulp van het peptide MOG35-55 geëmulgeerd in een adjuvans dat M. paratuberculosis10 bevat. De inductie van EAE door deze methode resulteerde in een ernstiger ziekte dan die veroorzaakt door het gemeenschappelijke protocol met CFA. Dit verschil kan te wijten zijn aan de verschillende lipidecomponenten in de celwand van de mycobacteriën11. In f...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk kreeg steun van een subsidie van de Japanese Society for the promotion of Science (grant no. JP 23K14675).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| anti-mouse CD115 antibody | Biolegend, USA | 135505 | voor cytofluorimetrie 1:1.000 |
| anti-mouse CD11b antibody | Biolegend, USA | 101215 | voor cytofluorimetrie 1:1.000 |
| anti-mouse CD11c antibody | Biolegend, USA | 117313 | voor cytofluorimetrie 1:1.000 |
| anti-mouse CD16/32 antibody | Biolegend, USA | 101302 | voor cytofluorimetrie 1:1.000 |
| anti-mouse CD4 antibody | Biolegend, USA | 116004 | voor cytofluorimetrie 1:1.000 |
| anti-mouse CD8a antibody | Biolegend, USA | 100753 | voor cytofluorimetrie 1:1.000 |
| anti-mouse I-A/I-E antibody | Biolegend, USA | 107635 | voor cytofluorimetrie 1:1.000 |
| anti-mouse Ly-6C antibody | Biolegend, USA | 128023 | voor cytofluorimetrie 1:1.000 |
| BBL Middlebrook OADC Enrichment | Thermo Fisher Scientific, USA | BD 211886 | voor isolatie en cultivatie van mycobacteriën |
| C57BL/6J muizen | Charles River Laboratory, Japan | 3 weken oud, mannelijk en vrouwelijk | |
| FBS 10279-106 | Gibco Life Technologies, USA | 42F9155K | voor celcultuur, opwarmen op 37 °C voor gebruik |
| Freeze Dryer machine | Eyela, Tokyo, Japan | FDU-1200 | voor bacteriën lyofilisatie |
| incomplete e Freund’s adjuvant | Difco Laboratories, MD, USA | 263810 | voor gebruik in adjuvant |
| Middlebrook 7H9 Broth | Difco Laboratories, MD, USA | 90003-876 | helpt bij de groei van Mycobacteriën |
| Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10 | ATCC, USA | BAA-968 | bacteriën van boviene oorsprong |
| Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Gedesiceerd | BD Biosciences, USA | 743-26880-EA | voor gebruik in adjuvant |
| Mycobactin J | Allied Laboratory, MO, USA | groei bevorderend | |
| Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55 | AnaSpec, USA | AS-60130-10 | encephalogenetisch peptide |
| Ovalbumine (257-264) | Sigma-Aldrich, USA | S7951-1MG | negatief controle-antigeen voor proliferatietest |
| pertussis toxine oplossing | Fujifilm Wako, Osaka Japan | 168-22471 | Van gram-negatieve bacteriën Bordetella pertussis, verhoogt doorlaatbaarheid bloed-hersenbarrière |
| Polytron homogenisator PT 3100 | Kinematica | voor het mengen van het antigeen met het adjuvant | |
| RPMI 1640 met L-glutamine | Gibco Life Technologies, USA | 11875093 | Voor celcultuur |
| Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi | PerkinElmer, Waltham, MA, USA | NET027W001MC | voor proliferatietest, gebruik (1 μCi/well) |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend, USA | 423105 | cytofluorimetrie, voor celviabiliteit |
Referenties
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visualized Experiments. (86), e51275(2014).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Lu, C., et al. Pertussis toxin induces angiogenesis in brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroscience Research. 86 (12), 2624-2640 (2008).
- Awate, S., Babiuk, L. A., Mutwiri, G. Mechanisms of action of adjuvants. Frontiers in Immunology. 4, 114(2013).
- Kubota, M., et al. Adjuvant activity of Mycobacteria-derived mycolic acids. Heliyon. 6 (5), e04064(2020).
- Nicolo, C., et al. Mycobacterium tuberculosis in the adjuvant modulates the balance of Th immune response to self-antigen of the CNS without influencing a "core" repertoire of specific T cells. International Immunology. 18 (2), 363-374 (2006).
- O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. Journal of Immunology. 188 (5), 2093-2101 (2012).
- Libbey, J. E., Fujinami, R. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis as a testing paradigm for adjuvants and vaccines. Vaccine. 29 (17), 3356-3362 (2011).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Hattori, N. Conflicting role of Mycobacterium species in multiple sclerosis. Frontiers in Neurology. 8, 216(2017).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Momotani, E., Hattori, N. Adjuvant and antigenic properties of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis on experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Neuroimmunology. 330, 174-177 (2019).
- Biet, F., et al. Lipopentapeptide induces a strong host humoral response and distinguishes Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from M. avium subsp. avium. Vaccine. 26 (2), 257-268 (2008).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Tomizawa, Y., Momotani, E., Hattori, N. Altered humoral immunity to mycobacterial antigens in Japanese patients affected by inflammatory demyelinating diseases of the central nervous system. Scientific Reports. 7 (1), 3179(2017).
- Cossu, D., et al. A mucosal immune response induced by oral administration of heat-killed Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis exacerbates EAE. Journal of Neuroimmunology. 352, 577477(2021).
- Cossu, D., Yokoyama, K., Sakanishi, T., Sechi, L. A., Hattori, N. Bacillus Calmette-Guerin Tokyo-172 vaccine provides age-related neuroprotection in actively induced and spontaneous experimental autoimmune encephalomyelitis models. Clinical and Experimental Immunology. 6, (2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
