Adjuvante activiteit van mycobacterium paratuberculosis bij het verbeteren van de immunogeniciteit van autoantigenen tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis

Summary

Hier presenteren we een alternatief protocol om actief experimentele auto-immuun encefalomyelitis te induceren bij C57BL / 6-muizen, met behulp van het immunogene epitoop myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) _35-55 gesuspendeerd in onvolledig Freund's adjuvans met de hitte-gedode Mycobacterium avium ondersoort paratuberculosis.

Abstract

Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) geïnduceerd door myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) vereist immunisatie door een MOG-peptide geëmulgeerd in volledig Freund's adjuvans (CFA) met geïnactiveerde Mycobacterium tuberculosis. De antigene componenten van de mycobacterie activeren dendritische cellen om T-cellen te stimuleren om cytokines te produceren die de Th1-respons bevorderen via toll-like receptoren. Daarom zijn de hoeveelheid en soorten mycobacteriën die aanwezig zijn tijdens de antigene uitdaging direct gerelateerd aan de ontwikkeling van EAE. Dit methodedocument presenteert een alternatief protocol om EAE te induceren in C57BL / 6-muizen met behulp van een gemodificeerd onvolledig Freund-adjuvans dat de door hitte gedode Mycobacterium avium-ondersoort paratuberculosestam K-10 bevat.

M. paratuberculosis, een lid van het Mycobacterium avium-complex, is de veroorzaker van de ziekte van Johne bij herkauwers en is geïdentificeerd als een risicofactor voor verschillende menselijke T-cel-gemedieerde aandoeningen, waaronder multiple sclerose. Over het algemeen vertoonden muizen geïmmuniseerd met Mycobacterium paratuberculosis een eerder begin en een grotere ernst van de ziekte dan muizen geïmmuniseerd met CFA die de stam van M. tuberculosis H37Ra bevatten in dezelfde doses van 4 mg / ml. De antigene determinanten van Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) stam K-10 waren in staat om een sterke Th1 cellulaire respons te induceren tijdens de effectorfase, gekenmerkt door significant hogere aantallen T-lymfocyten (CD4+ CD27+), dendritische cellen (CD11c+ I-A/I-E+), en monocyten (CD11b+ CD115⁺) in de milt in vergelijking met muizen geïmmuniseerd met CFA. Bovendien bleek de proliferatieve T-celrespons op het MOG-peptide het hoogst te zijn bij M. paratuberculosis-geïmmuniseerde muizen. Het gebruik van een encefalitogeen (bijv. MOG_35-55) geëmulgeerd in een adjuvans met M. paratuberculose in de formulering kan een alternatieve en gevalideerde methode zijn om dendritische cellen te activeren voor het primen van myeline-epitoopspecifieke CD4⁺ T-cellen tijdens de inductiefase van EAE.

Introduction

Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is een gemeenschappelijk model voor de studie van menselijke demyeliniserende aandoeningen¹. Er zijn verschillende modellen van EAE: actieve immunisatie met behulp van verschillende myelinepeptiden in combinatie met krachtige adjuvantia, passieve immunisatie door in vitro overdracht van myeline-specifieke CD4 ⁺ lymfocyten en transgene modellen van spontane EAE². Elk van deze modellen heeft specifieke kenmerken waarmee verschillende aspecten van EAE kunnen worden bestudeerd, zoals het begin, de effectorfase of de chronische fase. Het myeline oligodendroc....

Protocol

Alle muizenexperimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Juntendo University School of Medicine (goedkeuringsnummer 290238) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines for Animal Experimentation.

1. Algemene opmerkingen over het experiment

1. Plaats de muizen in individuele kooien in de dierenfaciliteit onder gecontroleerde, pathogeenvrije omstandigheden bij 23 °C ± 2 °C met 50% ± 10% vochtigheid en een licht/donkercyclus van 12 uur met ad libitum toegang tot voedsel en water.
2. Injecteer de muizen met fosfaat-ge....

Results

Groepen C57BL/6-muizen (totaal n = 15/groep) werden geïmmuniseerd met MOG_35-55 in een emulsie die M. paratuberculose bevatte of volgens de gebruikelijke methode met CFA. Alle groepen muizen manifesteerden een acute monofasische ziekte gekenmerkt door een enkele piek van invaliditeit waargenomen na 14-17 dagen, gevolgd door een gedeeltelijk herstel van de symptomen gedurende de volgende 10 dagen (figuur 1A). Muizen geïmmuniseerd met het adj.......

Discussion

We demonstreerden een robuust alternatief protocol om actief ernstige EAE te induceren in C57BL / 6J-muizen met behulp van het peptide MOG_35-55 geëmulgeerd in een adjuvans dat M. paratuberculosis¹⁰ bevat. De inductie van EAE door deze methode resulteerde in een ernstiger ziekte dan die veroorzaakt door het gemeenschappelijke protocol met CFA. Dit verschil kan te wijten zijn aan de verschillende lipidecomponenten in de celwand van de mycobacteriën¹¹. In f.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	for cytofluorimetry 1:1,000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	for cytofluorimetry 1:1,000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	for isolation and cultivation of mycobacteria
C57BL/6J mice	Charles River Laboratory, Japan		3 weeks old, male and female
FBS 10279-106	Gibco Life Techologies, USA	42F9155K	for cell culture, warm at 37 °C before use
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	for bacteria lyophilization
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	for use in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	help in the growth of Mycobacteria
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteria from bovine origin
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Desiccated	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	for use in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		growth promoter
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalotigenic peptide
Ovalbumin (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negative control antigen  for proliferative assay
pertussis toxin solution	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	From gram-negative bacteria Bordetella pertussi, increases blood-brain barrier permeability
Polytron homogenizer PT 3100	Kinematica		for mixing the antigen with the adjuvant
RPMI 1640 with L-glutamine	Gibco Life Techologies, USA	11875093	For cell culture
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	for proliferation assay, use (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetry, for cell viability