Adjuvante activiteit van mycobacterium paratuberculosis bij het verbeteren van de immunogeniciteit van autoantigenen tijdens experimentele auto-immune encefalomyelitis

Samenvatting

Hier presenteren we een alternatief protocol om actief experimentele auto-immuun encefalomyelitis te induceren bij C57BL / 6-muizen, met behulp van het immunogene epitoop myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) _35-55 gesuspendeerd in onvolledig Freund's adjuvans met de hitte-gedode Mycobacterium avium ondersoort paratuberculosis.

Samenvatting

Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) geïnduceerd door myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) vereist immunisatie door een MOG-peptide geëmulgeerd in volledig Freund's adjuvans (CFA) met geïnactiveerde Mycobacterium tuberculosis. De antigene componenten van de mycobacterie activeren dendritische cellen om T-cellen te stimuleren om cytokines te produceren die de Th1-respons bevorderen via toll-like receptoren. Daarom zijn de hoeveelheid en soorten mycobacteriën die aanwezig zijn tijdens de antigene uitdaging direct gerelateerd aan de ontwikkeling van EAE. Dit methodedocument presenteert een alternatief protocol om EAE te induceren in C57BL / 6-muizen met behulp van een gemodificeerd onvolledig Freund-adjuvans dat de door hitte gedode Mycobacterium avium-ondersoort paratuberculosestam K-10 bevat.

M. paratuberculosis, een lid van het Mycobacterium avium-complex, is de veroorzaker van de ziekte van Johne bij herkauwers en is geïdentificeerd als een risicofactor voor verschillende menselijke T-cel-gemedieerde aandoeningen, waaronder multiple sclerose. Over het algemeen vertoonden muizen geïmmuniseerd met Mycobacterium paratuberculosis een eerder begin en een grotere ernst van de ziekte dan muizen geïmmuniseerd met CFA die de stam van M. tuberculosis H37Ra bevatten in dezelfde doses van 4 mg / ml. De antigene determinanten van Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) stam K-10 waren in staat om een sterke Th1 cellulaire respons te induceren tijdens de effectorfase, gekenmerkt door significant hogere aantallen T-lymfocyten (CD4+ CD27+), dendritische cellen (CD11c+ I-A/I-E+), en monocyten (CD11b+ CD115⁺) in de milt in vergelijking met muizen geïmmuniseerd met CFA. Bovendien bleek de proliferatieve T-celrespons op het MOG-peptide het hoogst te zijn bij M. paratuberculosis-geïmmuniseerde muizen. Het gebruik van een encefalitogeen (bijv. MOG_35-55) geëmulgeerd in een adjuvans met M. paratuberculose in de formulering kan een alternatieve en gevalideerde methode zijn om dendritische cellen te activeren voor het primen van myeline-epitoopspecifieke CD4⁺ T-cellen tijdens de inductiefase van EAE.

Inleiding

Experimentele auto-immune encefalomyelitis (EAE) is een gemeenschappelijk model voor de studie van menselijke demyeliniserende aandoeningen¹. Er zijn verschillende modellen van EAE: actieve immunisatie met behulp van verschillende myelinepeptiden in combinatie met krachtige adjuvantia, passieve immunisatie door in vitro overdracht van myeline-specifieke CD4 ⁺ lymfocyten en transgene modellen van spontane EAE². Elk van deze modellen heeft specifieke kenmerken waarmee verschillende aspecten van EAE kunnen worden bestudeerd, zoals het begin, de effectorfase of de chronische fase. Het myeline oligodendrocyte glycoproteïne (MOG) model van EAE is een goed model om de immuungemedieerde mechanismen van chronische neuro-inflammatie en demyelinisatie te bestuderen, omdat het wordt gekenmerkt door mononucleaire inflammatoire infiltratie, demyelinisatie in perifere witte stof en verminderd herstel na de ziektepiek¹.

MOG-EAE wordt geïnduceerd door immunisatie van gevoelige muizen met het peptide MOG_35-55 in volledig Freund's adjuvans (CFA), gevolgd door een intraperitoneale injectie van kinkhoesttoxine. Dit verhoogt de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière en zorgt ervoor dat myeline-specifieke T-cellen die in de periferie worden geactiveerd, het centrale zenuwstelsel (CZS) bereiken, waar ze worden gereactiveerd³. CFA speelt een sleutelrol in de inductie van EAE door het verbeteren van de antigeenopname door antigeen-presenterende cellen en de expressie van cytokines gerelateerd aan humorale- en celgemedieerde responsen⁴. Dit mechanisme is voornamelijk te wijten aan de aanwezigheid van gedode Mycobacterium tuberculosis geëmulgeerd in olie, waarvan de componenten een sterke stimulans vormen voor het immuunsysteem⁵. In feite is de inductie van EAE direct gerelateerd aan de hoeveelheid mycobacterie die aanwezig is tijdens de antigene uitdaging⁶.

De toevoeging van andere gedode mycobacteriën, zoals Mycobacterium butyricum, aan het onvolledige adjuvans⁷ van Freund, evenals het effect van adjuvante combinaties⁸, kan het klinische beloop van EAE moduleren en bijgevolg de reproduceerbaarheid van de resultaten beïnvloeden. Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP), de etiologische verwekker van de ziekte van Johne bij herkauwers, is in verband gebracht met ontstekingsstoornissen van het menselijk CZS 9, omdat de antigene componenten ervan in staat zijn om een sterke humorale en celgemedieerde respons op te wekken bij patiënten met multiple sclerose en neuromyelitis optica spectrum stoornis⁹. Daarom tonen we in dit protocol een alternatieve en reproduceerbare methode om MOG-EAE te induceren door M. tuberculosis in CFA te vervangen door M. paratuberculosis.

Protocol

Alle muizenexperimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Juntendo University School of Medicine (goedkeuringsnummer 290238) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guidelines for Animal Experimentation.

1. Algemene opmerkingen over het experiment

1. Plaats de muizen in individuele kooien in de dierenfaciliteit onder gecontroleerde, pathogeenvrije omstandigheden bij 23 °C ± 2 °C met 50% ± 10% vochtigheid en een licht/donkercyclus van 12 uur met ad libitum toegang tot voedsel en water.
2. Injecteer de muizen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder antigeen en CFA, en gebruik ze als respectievelijk negatieve en positieve controles.

2. Bereiding van mycobacteriële antigenen

1. Kweek de M. paratuberculosis K-10 stam in Middlebrook vloeibaar medium 7H9 verrijkt met 10% OADC (oliezuur, albumine, dextrose, catalase), 0,005% Tween 80 en 2 mg/L mycobactine J gedurende 2 weken in T25 weefselkweekkolven bij 37 °C. Beoordeel de koloniegroei regelmatig door visuele inspectie.
   LET OP: Behandel M. paratuberculose in een bioveiligheidsniveau 2 (BSL-2) faciliteit.
2. Kweek de verrijkingscultuurina erlenmeyer van 500 ml met een suspensie van 1,7 × 10⁵ kolonievormende eenheden (CFU)/ml in een eindvolume van 200 ml (zelfde medium als stap 2.1) gedurende 1 week in een schudincubator.
   OPMERKING: Aangezien verontreinigende organismen de resultaten kunnen beïnvloeden, moeten de bacteriën worden ingeënt op Middlebrook 7H10 vaste media om de morfologie van de kolonie te bepalen en de zuiverheid te verifiëren door conventionele polymerasekettingreactie (PCR) detectiekits voor M. paratuberculosis.
3. Inactiveer de bacteriële suspensies gedurende 5-10 minuten bij 70 °C en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 3.000 × g . Was de gewogen pellet tweemaal in PBS, verstoor door ultrasoonapparaat en bewaar bij -20 °C.
4. Breng de pellet over in een steriele container en vries deze in met droogijs of vloeibare stikstof. Breng onmiddellijk over naar een vriesdroogkamer.
5. Vriesdroog (4 uur bij -50 °C onder vacuüm) M. paratuberculose volgens de machinehandleiding.
6. Aan het einde van de lyofilisatie verwijdert u de roestvrijstalen container uit de vriesdroger en brengt u deze over naar een bioreinigingsbank. Gebruik een roestvrijstalen spatel om de gedroogde MAP-klonten die aan de binnenwand van de roestvrijstalen container hechten los te maken en verpulver ze zo fijn mogelijk.
7. Weeg de verpulverde cellen met behulp van een elektronische balans en plaats ze handmatig in een aseptische injectieflacon van 10 ml in een concentratie van 10 mg / ml.
   OPMERKING: De celdichtheid werd gekwantificeerd als gram drooggewicht per liter monster. Na 3 weken bevat 1 mg (nat gewicht) bacteriële celpellet ongeveer 2,5 × 10⁸ kve.

3. Bereiding van MOG _35-55 emulsie

1. Maal de inhoud van één injectieflacon gedroogde M. paratuberculosis (10 mg) tot een fijn poeder met een vijzel en stamper en voeg 10 ml toe aan het adjuvans van Freund om een stamoplossing van 10 mg / ml te verkrijgen. Bewaren bij -4 °C.
2. Verdun vóór immunisatie de stamoplossing tot een eindconcentratie van 4 mg / ml.
3. Verdun het peptide MOG_35-55 in ddH 2 O tot een eindconcentratie van₂mg/ml en bewaar bij -20 °C.
4. Meng met behulp van een homogenisator de MOG_{35-55-oplossing} (2 mg / ml) met een gelijk volume adjuvans (4 mg / ml) vanaf stap 3.2 in een buis van 5 ml totdat een dikke emulsie is gevormd. Na elke 10 s mengen, plaats de oplossing gedurende 20 s op ijs en draai de buis om alle oplossing te herstellen.
5. Breng de emulsie over in een spuit van 1 ml, verwijder alle lucht en voeg een naald van 27 G toe. De emulsie is nu klaar voor injectie.
   NOTITIE. Aangezien er tijdens de bereiding enig verlies van de viskeuze emulsie van MOG_35-55 optreedt, is het het beste om 1,5 keer de benodigde hoeveelheid te bereiden.

4. Immunisatie van dieren

1. Verdoof de dieren met inademing van isofluraan om stress op de dieren te minimaliseren.
2. Injecteer de emulsie (200 μL met 200 μg/muis van MOG_35-55) subcutaan in de onderrug.
3. Dien een dosis kinkhoesttoxine (100 μL met 200 ng/muis) intraperitoneaal toe op dag 0 en 2 na immunisatie.
   LET OP: Kinkhoest toxine heeft een meervoudig onderdrukkend effect op het immuunsysteem; Vermijd inname en contact met ogen en huid.

5. Klinische evaluatie

1. Controleer de muizen dagelijks op gewicht en klinische symptomen. Gebruik het volgende scoresysteem: 0 = geen klinische symptomen; 1 = slappe staart; 2 = aantasting van de rechtrichtreflex en zwakte van de achterpoten; 3 = volledige verlamming van de achterpoten; 4 = volledige verlamming van de achterpoten met gedeeltelijke verlamming van de voorpoten; 5 = zieltogend.
   OPMERKING: Bij de eerste waarneming van klinische symptomen krijgen dieren meer toegang tot water en voedsel. Knaagdier chow wordt verzacht en bevochtigd en vervolgens op de kooivloer van de voedseltrechter geplaatst. In het geval van gedehydrateerde dieren wordt suppletie met onderhuidse vloeistof toegediend of wordt een knaagdier chow-slurry toegediend via orale maagsonde. Als een muis dit soort hulp langer dan 3 dagen nodig heeft, wordt euthanasie uitgevoerd.
2. Om pijn en angst bij dieren te voorkomen of te minimaliseren, gebruikt u de volgende menselijke eindpunten: gewichtsverlies van meer dan 20%, klinische score ≥4,0, afwezigheid van de rechtrichtreflex bij score 3 en wanneer het dier gedurende 24 uur geen toegang heeft tot voer of water.
   OPMERKING: De muizen werden geëuthanaseerd op dag 30 na EAE-inductie door intraperitoneale injecties van pentobarbital (≥150 mg / kg).

Resultaten

Groepen C57BL/6-muizen (totaal n = 15/groep) werden geïmmuniseerd met MOG_35-55 in een emulsie die M. paratuberculose bevatte of volgens de gebruikelijke methode met CFA. Alle groepen muizen manifesteerden een acute monofasische ziekte gekenmerkt door een enkele piek van invaliditeit waargenomen na 14-17 dagen, gevolgd door een gedeeltelijk herstel van de symptomen gedurende de volgende 10 dagen (figuur 1A). Muizen geïmmuniseerd met het adj...

Discussie

We demonstreerden een robuust alternatief protocol om actief ernstige EAE te induceren in C57BL / 6J-muizen met behulp van het peptide MOG_35-55 geëmulgeerd in een adjuvans dat M. paratuberculosis¹⁰ bevat. De inductie van EAE door deze methode resulteerde in een ernstiger ziekte dan die veroorzaakt door het gemeenschappelijke protocol met CFA. Dit verschil kan te wijten zijn aan de verschillende lipidecomponenten in de celwand van de mycobacteriën¹¹. In f...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
anti-mouse CD115 antibody	Biolegend, USA	135505	voor cytofluorimetrie 1:1.000
anti-mouse CD11b antibody	Biolegend, USA	101215	voor cytofluorimetrie 1:1.000
anti-mouse CD11c antibody	Biolegend, USA	117313	voor cytofluorimetrie 1:1.000
anti-mouse CD16/32  antibody	Biolegend, USA	101302	voor cytofluorimetrie 1:1.000
anti-mouse CD4  antibody	Biolegend, USA	116004	voor cytofluorimetrie 1:1.000
anti-mouse CD8a  antibody	Biolegend, USA	100753	voor cytofluorimetrie 1:1.000
anti-mouse I-A/I-E antibody	Biolegend, USA	107635	voor cytofluorimetrie 1:1.000
anti-mouse Ly-6C  antibody	Biolegend, USA	128023	voor cytofluorimetrie 1:1.000
BBL Middlebrook OADC Enrichment	Thermo Fisher Scientific, USA	BD 211886	voor isolatie en cultivatie van mycobacteriën
C57BL/6J muizen	Charles River Laboratory, Japan		3 weken oud, mannelijk en vrouwelijk
FBS 10279-106	Gibco Life Technologies, USA	42F9155K	voor celcultuur, opwarmen op 37 °C voor gebruik
Freeze Dryer machine	Eyela, Tokyo, Japan	FDU-1200	voor bacteriën lyofilisatie
incomplete e Freund’s adjuvant	Difco Laboratories, MD, USA	263810	voor gebruik in adjuvant
Middlebrook 7H9 Broth	Difco Laboratories, MD, USA	90003-876	helpt bij de groei van Mycobacteriën
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis K-10	ATCC, USA	BAA-968	bacteriën van boviene oorsprong
Mycobacterium tuberculosis H37 Ra, Gedesiceerd	BD Biosciences, USA	743-26880-EA	voor gebruik in adjuvant
Mycobactin J	Allied Laboratory, MO, USA		groei bevorderend
Myelin Oligodendrocyte Glycolipid (MOG) 35-55	AnaSpec, USA	AS-60130-10	encephalogenetisch peptide
Ovalbumine (257-264)	Sigma-Aldrich, USA	S7951-1MG	negatief controle-antigeen  voor proliferatietest
pertussis toxine oplossing	Fujifilm Wako, Osaka Japan	168-22471	Van gram-negatieve bacteriën Bordetella pertussis, verhoogt doorlaatbaarheid bloed-hersenbarrière
Polytron homogenisator PT 3100	Kinematica		voor het mengen van het antigeen met het adjuvant
RPMI 1640 met L-glutamine	Gibco Life Technologies, USA	11875093	Voor celcultuur
Thymidine, [Methyl-3H], in 2% ethanol, 1 mCi	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	NET027W001MC	voor proliferatietest, gebruik (1 μCi/well)
Zombie NIR Fixable Viability Kit	Biolegend, USA	423105	cytofluorimetrie, voor celviabiliteit