Genetische profilering en drop-outscreening op genoomschaal om therapeutische doelen te identificeren in muismodellen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren

Summary

We hebben een soortoverschrijdende vergelijkende oncogenomics-benadering ontwikkeld met behulp van genomische analyses en functionele genomische screenings om therapeutische doelen te identificeren en te vergelijken in tumoren die ontstaan in genetisch gemanipuleerde muismodellen en het overeenkomstige menselijke tumortype.

Abstract

Maligne perifere zenuwschedetumoren (MPNST's) zijn afgeleid van Schwann-cellen of hun voorlopers. Bij patiënten met het tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1) zijn MPNST's de meest voorkomende maligniteit en de belangrijkste doodsoorzaak. Deze zeldzame en agressieve wekedelensarcomen bieden een grimmige toekomst, met 5-jaars ziektevrije overlevingspercentages van 34-60%. Behandelingsopties voor personen met MPNST's zijn teleurstellend beperkt, waarbij ontsierende chirurgie de belangrijkste behandelingsoptie is. Veel ooit veelbelovende therapieën zoals tipifarnib, een remmer van Ras-signalering, hebben klinisch gefaald. Evenzo hebben fase II klinische onderzoeken met erlotinib, dat zich richt op de epidermale groeifactor (EFGR), en sorafenib, dat zich richt op de vasculaire endotheliale groeifactorreceptor (VEGF), van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor (PDGF) en Raf, in combinatie met standaard chemotherapie, ook geen respons opgeleverd bij patiënten.

In de afgelopen jaren zijn functionele genomische screeningsmethoden in combinatie met genetische profilering van kankercellijnen nuttig gebleken voor het identificeren van essentiële cytoplasmatische signaleringsroutes en de ontwikkeling van doelspecifieke therapieën. In het geval van zeldzame tumortypes wordt een variatie op deze benadering, bekend als cross-species comparative oncogenomics, steeds vaker gebruikt om nieuwe therapeutische doelen te identificeren. In cross-species vergelijkende oncogenomica worden genetische profilering en functionele genomica uitgevoerd in genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) en de resultaten worden vervolgens gevalideerd in de zeldzame menselijke specimens en cellijnen die beschikbaar zijn.

Dit artikel beschrijft hoe kandidaat-drivergenmutaties in MPNST-cellen van mensen en muizen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van whole exome sequencing (WES). Vervolgens beschrijven we hoe shRNA-screenings op genoomschaal kunnen worden uitgevoerd om kritieke signaalroutes in muizen en menselijke MPNST-cellen te identificeren en te vergelijken en geneeskrachtige doelen in deze routes te identificeren. Deze methodologieën bieden een effectieve benadering voor het identificeren van nieuwe therapeutische doelen in een verscheidenheid aan soorten kanker bij de mens.

Introduction

Maligne perifere zenuwschedetumoren (MPNST's) zijn zeer agressieve spindelcelneoplasmata die ontstaan in verband met het tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1), sporadisch in de algemene bevolking en op plaatsen van eerdere radiotherapie ^1,2,3. NF1-patiënten worden geboren met een wild-type kopie van het NF1-tumorsuppressorgen en een tweede NF1-allel met een mutatie met functieverlies. Deze toestand van haplo-insufficiëntie maakt NF1-patiënten vatbaar voor een tweede mutatie met functieverlies in hun wildtype NF1-gen, dat tumorigen....

Protocol

Laat voorafgaand aan de start van de onderzoeken dierprocedures en protocollen voor het omgaan met virale vectoren beoordelen en goedkeuren door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en de Institutional Biosafety Committee (IBC). De hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door de IACUC- en IBC-raden van de Medical University of South Carolina en werden uitgevoerd door goed opgeleid personeel in overeenstemming met de NIH-gids voor verzorging en gebruik van proefdieren en de institutionele richtlijnen voor dierenverzorging van MUSC.

1. WES-Seq-analyses en identificatie van pathogene varianten

1. I....

Results

Figuur 5 grafieken tonen uitputtingsscores van essentiële kerngenen (CEG's) gelabeld als WAAR in vergelijking met niet-CEG's (gelabeld als ONWAAR) in elke menselijke cellijn die werd gescreend. Punten vertegenwoordigen log2 van vouwuitputtingsscores voor individuele genen, die worden uitgezet over een boxplot-weergave van de totale scoreverdeling. De t-toets van de student werd gebruikt om te testen op een significant verschil in het gemiddelde van de uitputtingsscores tussen de twe.......

Discussion

De gedetailleerde methoden die hier worden gepresenteerd, zijn ontwikkeld om neoplasie van het perifere zenuwstelsel en MPNST-pathogenese te bestuderen. Hoewel we hebben vastgesteld dat deze methoden effectief zijn, moet worden erkend dat er enkele potentiële beperkingen zijn aan de methoden die we hier beschrijven. Hieronder bespreken we enkele van die beperkingen en mogelijke strategieën om ze in andere modelsystemen te overwinnen.

We hebben ontdekt dat sequencing van het hele exoom effectie.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioruptor Sonication System	Diagenode	UCD-600
CASAVA 1.8.2
Cbot	Illumina, San Diego, CA	N/A
Celigo Image Cytometer	Nexcelom	N/A
Cellecta Barcode Analyzer and Deconvoluter software
Citrisolve Hybrid	Decon Laboratories	5989-27-5
Corning 96-well Black Microplate	Millipore Sigma	CLS3603
Diagenode Bioruptor 15ml conical tubes	Diagenode	C30010009
dNTP mix	Clontech	639210
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Elution buffer	Qiagen	19086
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Excel	Microsoft
FWDGEX 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGA-3’
FWDHTS 5’-TTCTCTGGCAAGCAAAAGACGGCATA-3’
GexSeqS (5’ AGAGGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAA-3’			HPLC purified
GraphPad Prism	Dotmatics
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Illumina HiScanSQ	Illumina, San Diego, CA	N/A
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
PLUS Transfection Reagent	Thermo Scientific	11514015
Polybrene Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR1003G
PureLink Quick PCR Purification Kit	Invitrogen	K310001
Qiagen Buffer P1	Qiagen	19051
Qiagen Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
RevGEX 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3’
RevHTS1 5’-TAGCCAACGCATCGCACAAGCCA-3’
Titanium Taq polymerase	Clontech	639210
Trimmomatic software		www.usadellab.org