Methodenartikel

Een verbeterde methode om mitochondriale contactplaatsen te isoleren

DOI:

10.3791/65444

⸱

16 juni 2023

 ,  , 
1Department of Cell Biology, Biomedical Center, Medical Faculty, Ludwig-Maximilians University Munich, 2Cardio-Metabolic Diseases, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale contactplaatsen zijn eiwitcomplexen die interageren met mitochondriale binnen- en buitenmembraaneiwitten. Deze plaatsen zijn essentieel voor de communicatie tussen de mitochondriale membranen en dus tussen het cytosol en de mitochondriale matrix. Hier beschrijven we een methode om kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor deze specifieke klasse van eiwitten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën zijn aanwezig in vrijwel alle eukaryote cellen en vervullen essentiële functies die veel verder gaan dan energieproductie, bijvoorbeeld de synthese van ijzer-zwavelclusters, lipiden of eiwitten, Ca2+ -buffering en de inductie van apoptose. Evenzo resulteert mitochondriale disfunctie in ernstige ziekten bij de mens, zoals kanker, diabetes en neurodegeneratie. Om deze functies uit te voeren, moeten mitochondriën communiceren met de rest van de cel over hun omhulsel, dat uit twee membranen bestaat. Daarom moeten deze twee membranen constant op elkaar inwerken. Eiwitachtige contactplaatsen tussen de mitochondriale binnen- en buitenmembranen zijn in dit opzicht essentieel. Tot nu toe zijn er verschillende contactlocaties geïdentificeerd. In de hier beschreven methode worden Saccharomyces cerevisiae-mitochondriën gebruikt om contactplaatsen te isoleren en zo kandidaten te identificeren die in aanmerking komen voor contactplaatseiwitten. We gebruikten deze methode om het mitochondriale contactplaats en cristae organizing system (MICOS) -complex te identificeren, een van de belangrijkste contactplaatsvormende complexen in het mitochondriale binnenmembraan, dat wordt geconserveerd van gist tot mens. Onlangs hebben we deze methode verder verbeterd om een nieuwe contactplaats te identificeren die bestaat uit Cqd1 en het Por1-Om14-complex.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriën vervullen verschillende functies in eukaryoten, waarvan de meest bekende de productie van ATP door oxidatieve fosforylering is. Andere functies zijn onder meer de productie van ijzer-zwavelclusters, lipidensynthese en in hogere eukaryoten, Ca2+-signalering en de inductie van apoptose 1,2,3,4. Deze functies zijn onlosmakelijk verbonden met hun complexe ultrastructuur.

De mitochondriale ultrastructuur werd voor het eerst beschreven door elektronenmicroscopie5. Er werd aangetoond dat mitochondriën vrij complexe organellen zijn die uit twee membranen bestaan: het mitochondriale buitenmembraan en het mitochondriale binnenmembraan. Door deze membranen worden dus twee waterige compartimenten gevormd: de intermembraanruimte en de matrix. Het mitochondriale binnenmembraan kan nog verder worden onderverdeeld in verschillende secties. Het binnenste grensmembraan blijft in de nabijheid van het buitenste membraan en de cristae vormen invaginaties. Zogenaamde crista-juncties verbinden het binnenste grensmembraan en de cristae (Figuur 1). Bovendien onthullen elektronenmicrofoto's van osmotisch gekrompen mitochondriën dat er plaatsen bestaan waar de mitochondriale membranen nauw met elkaar verbonden zijn 6,7. Deze zogenaamde contactplaatsen worden gevormd door eiwitcomplexen die de twee membranen overspannen (Figuur 1). Er wordt gedacht dat deze interactieplaatsen essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van cellen vanwege hun belang voor de regulatie van mitochondriale dynamiek en overerving, evenals de overdracht van metabolieten en signalen tussen het cytosol en de matrix8.

Het MICOS-complex in het mitochondriale binnenmembraan is waarschijnlijk het best gekarakteriseerde en het meest veelzijdige contactplaatsvormende complex. MICOS werd in 2011 beschreven in gist en bestaat uit zes subeenheden 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 en Mic10. Deze vormen een complex van ongeveer 1,5 MDa dat zich lokaliseert op de crista-knooppunten 9,10,11. Het verwijderen van een van beide kernsubeenheden, Mic10 of Mic60, leidt tot de afwezigheid van dit complex 9,11, wat betekent dat deze twee subeenheden essentieel zijn voor de stabiliteit van MICOS. Interessant is dat MICOS niet slechts één, maar meerdere contactplaatsen vormt met verschillende mitochondriale buitenmembraaneiwitten en -complexen: het TOM-complex 11,12, het TOB/SAM-complex 9,12,13,14,15,16, het Fzo1-Ugo1-complex9,Por1 10, OM45 10 en Miro 17. Dit wijst er sterk op dat het MICOS-complex betrokken is bij verschillende mitochondriale processen, zoals eiwitimport, fosfolipidenmetabolisme en de vorming van de mitochondriale ultrastructuur18. De laatste functie is waarschijnlijk de belangrijkste functie van MICOS, aangezien de afwezigheid van het MICOS-complex geïnduceerd door de deletie van MIC10 of MIC60 leidt tot een abnormale mitochondriale ultrastructuur die vrijwel volledig geen regelmatige cristae heeft. In plaats daarvan hopen interne membraanblaasjes zonder verbinding met het binnenste grensmembraanzich op 19, 20. Belangrijk is dat MICOS in vorm en functie geconserveerd blijft van gist tot mens21. De associatie van mutaties in MICOS-subeenheden met ernstige ziekten bij de mens benadrukt ook het belang ervan voor hogere eukaryoten22,23. Hoewel MICOS zeer veelzijdig is, moeten er extra contactsites zijn (op basis van onze niet-gepubliceerde observaties). Er zijn inderdaad verschillende andere contactplaatsen geïdentificeerd, bijvoorbeeld de mitochondriale fusiemachines Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 of Mdm31-Por1, die betrokken zijn bij de biosynthese van het mitochondriaal-specifieke fosfolipide cardiolipine 27. Onlangs hebben we de methode verbeterd die ons heeft geleid tot de identificatie van MICOS om Cqd1 te identificeren als onderdeel van een nieuwe contactplaats gevormd met het buitenste membraancomplex Por1-Om1428. Interessant is dat deze contactplaats ook betrokken lijkt te zijn bij meerdere processen, zoals de homeostase van het mitochondriale membraan, het fosfolipidenmetabolisme en de distributie van co-enzym Q28,29.

Hier gebruikten we een variatie op de eerder beschreven fractionering van mitochondriën 9,30,31,32,33. Osmotische behandeling van mitochondriën leidt tot de verstoring van het mitochondriale buitenmembraan en tot een krimp van de matrixruimte, waardoor de twee membranen alleen dicht bij elkaar blijven op contactplaatsen. Dit maakt het mogelijk om blaasjes te genereren die uitsluitend bestaan uit mitochondriaal buitenmembraan of mitochondriaal binnenmembraan of op contactplaatsen van beide membranen door middel van milde sonicatie. Omdat het mitochondriale binnenmembraan een veel hogere eiwit-lipideverhouding heeft, vertonen mitochondriale binnenmembraanblaasjes een hogere dichtheid in vergelijking met mitochondriale buitenmembraanblaasjes. Het verschil in dichtheid kan worden gebruikt om de membraanblaasjes te scheiden door middel van sucrose opwaartse dichtheidsgradiëntcentrifugatie. Zo hopen de mitochondriale buitenste membraanblaasjes zich op bij lage sucroseconcentraties, terwijl de mitochondriale binnenmembraanblaasjes worden verrijkt bij hoge sucroseconcentraties. De blaasjes die contactplaatsen bevatten, concentreren zich op intermediaire sacharoseconcentraties (figuur 2). Het volgende protocol beschrijft deze verbeterde methode, die minder gespecialiseerde apparatuur, tijd en energie vereist in vergelijking met onze eerder vastgestelde32, in detail en biedt een nuttig hulpmiddel voor de identificatie van mogelijke contactplaatseiwitten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Buffers en voorraadoplossingen

  1. Maak een oplossing van 1 M 3-morfolinopropaan-1-sulfonzuur (MOPS) in gedeïoniseerd water, pH 7,4. Bewaren bij 4 °C.
  2. Bereid 500 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in gedeïoniseerd water, pH 8.0. Bewaren bij kamertemperatuur.
  3. Bereid 2,4 M sorbitol in gedeïoniseerd water. Na het autoclaveren bij kamertemperatuur bewaren.
  4. Bereid 2,5 M sacharose in gedeïoniseerd water. Na het autoclaveren bij kamertemperatuur bewaren.
  5. Bereid 200 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) in isopropanol. Bewaren bij -20 °C.
    LET OP: PMSF is giftig bij inslikken en veroorzaakt ernstige brandwonden en oogletsel. Adem het stof niet in en draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril.
  6. Bereid 72% trichloorazijnzuur (TCA) in gedeïoniseerd water. Bewaren bij 4 °C.
    LET OP: TCA kan irritatie van de luchtwegen, ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken. Adem het stof niet in en draag beschermende handschoenen en een veiligheidsbril.
  7. Bereid de SM-buffer voor: 20 mM MOPS en 0,6 M sorbitol, pH 7,4.
  8. Bereid de zwellingsbuffer voor: 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF en proteaseremmercocktail, pH 7,4.
  9. Bereid de sucrosegradiëntbuffers voor: 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M en 1,3 M sucrose in 20 mM MOPS en 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
    OPMERKING: Alle buffers kunnen worden opgeslagen bij 4 °C; het wordt echter aanbevolen om de sucrosehoudende buffers op te slaan bij -20 °C om schimmelgroei te voorkomen. De proteaseremmers moeten voor gebruik vers worden toegevoegd.

2. Generatie van submitochondriale blaasjes

  1. Isoleer ruwe gistmitochondriën vers volgens vastgestelde protocollen34,35.
    OPMERKING: Voor dit experiment werden mitochondriën geïsoleerd uit Saccharomyces cerevisiae. Het genereren van gradiëntzuivere mitochondriën zonder andere organellen is niet nodig.
  2. Resuspendeer 10 mg vers geïsoleerde mitochondriën in 1,6 ml SM-buffer (4 °C) door te pipetteren (Figuur 2, stap 1).
  3. Breng de mitochondriale suspensie over in een voorgekoelde erlenmeyer van 100 ml.
  4. Voeg langzaam 16 ml zwelbuffer toe met behulp van een glazen pipet van 20 ml. Breng tijdens de toevoeging constant mild roeren op ijs aan. Deze osmotische behandeling resulteert in wateropname in de matrixruimte. De zwelling van het mitochondriale binnenmembraan zal het buitenmembraan verstoren. Beide membranen blijven echter in contact op de contactplaatsen9 (Figuur 2, stap 2).
  5. Incubeer de monsters onder constant mild roeren gedurende 30 minuten op ijs.
  6. Voeg langzaam 5 ml 2,5 M sucrose-oplossing toe met behulp van een glazen pipet van 5 ml om de sacharoseconcentratie in de monsters te verhogen tot ongeveer 0,55 M. Deze osmotische behandeling resulteert in een wateruitvloeiing uit de matrix36. De krimp van het binnenmembraan is bedoeld om de afstand tot de resterende fragmenten van het buitenmembraan te maximaliseren. Dit verkleint de kans op het genereren van kunstmatige hybride blaasjes van binnen- en buitenmembranen door middel van sonicatie (Figuur 2, stap 3).
  7. Incubeer de monsters onder licht roeren gedurende 15 minuten op ijs.
  8. Onderwerp de mitochondriën aan sonicatie om submitochondriale membraanblaasjes te genereren (Figuur 2, stap 4).
    1. Breng de mitochondriale suspensie over naar een voorgekoelde rozetcel.
    2. Sonificeer de mitochondriale suspensie met een amplitude van 10% gedurende 30 s terwijl de rozetcel wordt gekoeld in een ijsbad.
    3. Laat de suspensie 30 s rusten in een ijsbad.
    4. Herhaal stap 2.8.2 en stap 2.8.3 nog drie keer.
      NOTITIE: De sonicatiecondities zijn afhankelijk van de gebruikte sonicator. Optimalisatie zal nodig zijn voor individuele machines. Sonicatie die te hard is, zal leiden tot de kunstmatige vorming van blaasjes die bestaan uit mitochondriale binnen- en buitenmembranen.

3. Scheiding van submitochondriale blaasjes

  1. Scheid de gegenereerde blaasjes van de resterende intacte mitochondriën door centrifugatie bij 20.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. De intacte mitochondriën zullen pelleteren terwijl de blaasjes in het bovenliggende blijven.
  2. Concentreer het blaasjesmengsel.
    1. Breng het supernatans over in verse ultracentrifugatiebuizen.
    2. Plaats een kussen van 0,3 ml 2,5 M sucroseoplossing op de bodem van de tube met behulp van een spuit van 1 ml die is uitgerust met een canule van 0,8 mm x 120 mm.
    3. Centrifugeer bij 118.000 x g gedurende 100 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Hier werd een zwenkbare bakrotor met een maximale radius van 153,1 mm gebruikt. De centrifugatieomstandigheden zijn sterk afhankelijk van de rotor en zullen moeten worden aangepast wanneer een andere rotor wordt gebruikt.
  3. De blaasjes verschijnen na het centrifugeren als een schijf op de bovenkant van het sacharosekussen. Gooi ongeveer 90% van het supernatant weg. Oogst nu de geconcentreerde blaasjes door ze opnieuw te suspenderen in de resterende buffer, inclusief de 2,5 M sucrose, door op en neer te pipetteren. Breng de suspensie over naar een ijskoude Dounce-homogenisator.
  4. Homogeniseer de suspensie met minimaal 10 slagen met behulp van een polytetrafluorethyleen pottenbakker.
  5. Bereid de sucrosegradiënt voor.
    1. Voor een stapgradiënt van 11 ml met vijf stappen (1,3 M, 1,13 M, 1,02 M, 0,96 M en 0,8 M sucrose in 20 mM MOPS en 0,5 mM EDTA, pH 7,4), heeft elke laag 2,2 ml sucrose-oplossing.
      OPMERKING: Een refractometer wordt aanbevolen om de sucroseconcentraties te meten en aan te passen; Het is echter niet essentieel. Breng 10 μL van de buffer aan op de refractometer en detecteer de respectievelijke brekingsindices. De berekening van de sacharoseconcentratie is als volgt:
      figure-protocol-1
      1,3333 vertegenwoordigt de brekingsindex van water. 0,048403 is een sucrose-specifieke conversie-index die wordt verkregen uit de lineaire schaling van de molaire brekingscoquiviteit ten opzichte van de sucroseconcentratie in waterige oplossingen 37.
    2. Voeg de hoogste sacharoseconcentratie toe aan de centrifugatiebuis en zet de buis op -20 °C. Wacht tot de laag volledig bevroren is voordat u de volgende aanbrengt. Ga dienovereenkomstig te werk totdat de laatste laag is toegevoegd en bewaar de gradiënten bij -20 °C.
      OPMERKING: Vergeet niet om de bevroren gradiënten over te brengen naar 4 °C bij het starten van het experiment om de gradiënten te laten ontdooien. Dit duurt ongeveer 3 uur. Voor het centrifugeren hier werd een zwenkbare emmerrotor met een capaciteit van 13,2 ml gebruikt. Wanneer een andere rotor wordt gebruikt, moeten de volumes van de hellingsstappen dienovereenkomstig worden aangepast.
  6. Meet de sacharoseconcentratie van de monsters met behulp van een refractometer. Als er geen toegang is tot een refractometer, kan men ook aannemen dat de sacharoseconcentratie 2 M is. Deze veronderstelde sucroseconcentratie zal dan de basis vormen voor de volgende stap.
  7. Pas de sucroseconcentratie aan op 0,6 M door toevoeging van een geschikte hoeveelheid 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF en proteaseremmercocktail, pH 7,4. Als de sacharoseconcentratie wordt geschat op 2 M in plaats van te worden gemeten, wordt aanbevolen om te testen of de concentratie na aanpassing laag genoeg is. Breng een kleine hoeveelheid van het monster (ca. 50 μl) aan op 200 μl 0,8 M sacharose in een reageerbuis. Het monster moet bovenop de 0,8 M sacharose blijven.
  8. Laad de monsters (ongeveer 1 ml) bovenop de sucrosegradiënt (bewaar 10% voor later gebruik). Zorgvuldig pipetteren is belangrijk om verstoring van de gradiënt te voorkomen (Figuur 2, stap 5).
  9. Scheid de blaasjes door centrifugeren bij 200.000 x g en 4 °C gedurende 12 uur. Stel de centrifuge indien mogelijk in op langzame versnelling en vertraging om verstoring van de helling te voorkomen (Figuur 2, stap 6).
    OPMERKING: Hier werd een zwenkbare bakrotor met een maximale radius van 153,1 mm gebruikt. De centrifugatieomstandigheden zijn sterk afhankelijk van de rotor en zullen moeten worden aangepast wanneer een andere rotor wordt gebruikt.
  10. Oogst de gradiënt van boven naar beneden in fracties van 700 μL met behulp van een pipet van 1 ml. Dit resulteert in 17 breuken, wat een voldoende resolutie mogelijk maakt.

4. Analyse van submitochondriale blaasjes

  1. Concentreer de eiwitten door elke fractie te onderwerpen aan twee achtereenvolgens uitgevoerde TCA-precipitaties38 om de SDS-PAGE-monsters voor te bereiden.
    1. Voeg 200 μL 72% TCA toe aan de afzonderlijke fracties en meng tot de oplossing homogeen is. Incubeer de fracties gedurende 30 minuten op ijs en pelleteer de neergeslagen eiwitten door centrifugatie bij 20.000 x g en 4 °C gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg, voeg 500 μl 28 % TCA-oplossing toe, meng goed en herhaal de centrifugatiestap.
    2. Was de pellets met 1 ml aceton (-20°C) en centrifugeer gedurende 10 minuten op 20.000 x g en 4 °C. Gooi het supernatant weg en laat de pellets aan de lucht drogen. Resuspendeer de pellets in 60 μL SDS-monsterbuffer en incubeer de monsters gedurende 5 minuten bij 95 °C.
      OPMERKING: Er zal een grote hoeveelheid sacharose achterblijven, vooral in de fracties met een hoge dichtheid, na de eerste TCA-precipitatie. Dit wordt verwijderd door de extra TCA-neerslag.
  2. Analyseer 20 μL van elke fractie met SDS-PAGE39 en immunoblotting40,41,42,43.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is relatief eenvoudig om mitochondriale binnen- en buitenmembranen te scheiden. Het genereren en scheiden van blaasjes die de contactplaats bevatten, is echter veel moeilijker. Naar onze mening zijn twee stappen cruciaal en essentieel: de sonicatiecondities en de gebruikte gradiënt.

Gewoonlijk wordt aangenomen dat lineaire gradiënten een betere resolutie hebben in vergelijking met stapsgewijze gradiënten. Hun reproduceerbare productie is echter vervelend en vereist speciale apparatuur. Daa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale subfractionering is een ingewikkeld experiment met verschillende zeer complexe stappen. Daarom hebben we ernaar gestreefd om onze gevestigde methode verder te verbeteren en, tot op zekere hoogte, te vereenvoudigen32. Hier waren de uitdagingen de behoefte aan gecompliceerde en zeer gespecialiseerde apparatuur, die vaak individuele constructies zijn, en het enorme tijd- en energieverbruik. Daartoe hebben we geprobeerd de pompen en individuele constructies die worden gebruikt voor het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E.H. erkent de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projectnummer 413985647, voor financiële steun. De auteurs danken Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians Universiteit, München, voor zijn genereuze en uitgebreide steun. We zijn Walter Neupert dankbaar voor zijn wetenschappelijke inbreng, nuttige discussies en voortdurende inspiratie. J.F. bedankt de Graduate School Life Science Munich (LSM) voor de steun.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Instruments, Germany344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mmBeckman Instruments, Germany363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x gBeckman Instruments, Germany363055
Abbe refractometerZeiss, Germanydiscontinued,
any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet ControllerBrandtech, USABR26320discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mLDWK Life Science, GermanyC118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 DBranson Ultrasonics, USAFIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIPBranson Ultrasonics, USA101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling CellBranson Ultrasonics, USA15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26Beckman Instruments, GermanyB37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Germany8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche, Switzerland11697498001
D-SorbitRoth, Germany6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)Roth, Germany8043
Erlenmeyer flask, 100 mLRoth, GermanyX747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1Hirschmann, Germany1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05Hirschmann, Germany1180153
ice bathneoLab, Germany S12651
Magnetic stirrer RCT basicIKA-Werke GmbH, GermanyZ645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)Gerbu, Germany1081
MyPipetman Select P1000Gilson, USAFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, USAFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, USAFP10005S
Omnifix 1 mLBraun, Germany4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Serva, Germany32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mmBraun, Germany4022495052414
stirring bar, 15 mmVWR, USA442-0366
SucroseMerck, GermanyS8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Instruments, Germany331362
Test tubesEppendorf, Germany3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vesselVWR, USA432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tipVWR, USA432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)Sigma Aldrich, Germany33731discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Germany4855

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863(2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria - Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399(2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769(2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA - Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1(2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van mitochondri nsub mitochondriale vesikelssucrosegradi ntgistmitochondri nMICOS complexmembraanarchitectuurmilde sonicatieSDS PAGEimmunoblotting

Gerelateerde artikelen