Methodenartikel

Microkolonievormende eenheidstest voor evaluatie van de werkzaamheid van vaccins tegen tuberculose

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65447

⸱

28 juli 2023

 , 
1Faculty of Medicine, Universidade Católica Portuguesa, 2Center for Interdisciplinary Research in Health, Universidade Católica Portuguesa, 3Host-Pathogen Interactions Unit, Research Institute for Medicines, iMed-ULisboa, Faculty of Pharmacy, Universidade de Lisboa

In dit artikel

Samenvatting

De bepaling van kolonievormende eenheden (CFU) is de gouden standaardtechniek voor het kwantificeren van bacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculosis, die weken nodig heeft om zichtbare kolonies te vormen. Hier beschrijven we een micro-CFU voor CFU-bepaling met verhoogde tijdsefficiëntie, lagere laboratoriumruimte en reagenskosten, en schaalbaarheid voor experimenten met gemiddelde en hoge doorvoer.

Samenvatting

Tuberculose (tbc), wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak door een infectieus agens, doodde in 2022 1,6 miljoen mensen en werd alleen overtroffen door COVID-19 tijdens de pandemie van 2019-2021. De ziekte wordt veroorzaakt door de bacterie Mycobacterium tuberculosis (M.tb). De Mycobacterium bovis-stam Bacillus Calmette-Guérin (BCG), het enige tbc-vaccin, is het oudste goedgekeurde vaccin ter wereld dat nog steeds in gebruik is. Momenteel zijn er 12 vaccins in klinische proeven en tientallen vaccins in preklinische ontwikkeling. De voorkeursmethode die wordt gebruikt om de werkzaamheid van tbc-vaccins in preklinische onderzoeken te beoordelen, is de telling van bacteriekolonies door middel van de kolonievormende eenheden (CFU)-test. Deze tijdrovende test duurt 4 tot 6 weken, vereist aanzienlijke laboratorium- en incubatorruimte, heeft hoge reagenskosten en is gevoelig voor contaminatie. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor kolonietelling, de micro-CFU (mCFU), die een eenvoudige en snelle oplossing biedt om de werkzaamheidsresultaten van het M.tb-vaccin te analyseren. De mCFU-test vereist tien keer minder reagentia, verkort de incubatietijd met een factor drie, duurt 1 tot 2 weken om te voltooien, vermindert de laboratoriumruimte en de reagenskosten en minimaliseert de gezondheids- en veiligheidsrisico's die gepaard gaan met het werken met grote aantallen M.tb. Om de werkzaamheid van een tbc-vaccin te evalueren, kunnen bovendien monsters worden verkregen uit verschillende bronnen, waaronder weefsels van gevaccineerde dieren die besmet zijn met mycobacteriën. We beschrijven ook een geoptimaliseerde methode om een eencellige, uniforme en hoogwaardige mycobacteriële cultuur te produceren voor infectiestudies. Ten slotte stellen we voor dat deze methoden universeel worden toegepast voor preklinische studies naar de bepaling van de werkzaamheid van vaccins, wat uiteindelijk leidt tot tijdsbesparing bij de ontwikkeling van vaccins tegen tuberculose.

Inleiding

Tuberculose (tbc) is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak door een enkel infectieus agens, bacterie Mycobacterium tuberculosis (M.tb), die meer mensen doodt dan welke andere ziekteverwekker dan ook. In 2021 was tuberculose verantwoordelijk voor 1,6 miljoen sterfgevallen en werd het overtroffen door COVID-19 tijdens de pandemie van 2019-20211. Bovendien was volgens het wereldwijde tbc-rapport van de Wereldgezondheidsorganisatie van 2022 de COVID-19-pandemie verantwoordelijk voor een toename van nieuwe tbc-gevallen. De WHO meldt ook grote dalingen in het aantal mensen met de diagnose tbc in deze periode, waardoor het aantal tbc-gevallenverder zou kunnen toenemen.

De Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is een levend verzwakte stam van de pathogene Mycobacterium bovis, die meer dan 100 jaar geleden voor het eerst als vaccin werd gebruikt. Dit is het enige vaccin tegen tuberculose en is het oudste goedgekeurde vaccin ter wereld dat nog steeds in gebruik is 2,3. Momenteel zijn er 12 vaccins in verschillende fasen van klinische proeven4, en tientallen vaccins zijn in preklinische ontwikkeling 5,6. Preklinische beoordeling van vaccins tegen tuberculose omvat de evaluatie van de veiligheid en immunogeniciteit7, die kan worden verkregen in diverse diermodellen zoals zebravissen, muizen, cavia's, konijnen, runderen en niet-menselijke primaten 8,9,10. Bovendien vereist het beoordelen van het vermogen van een vaccin om bescherming te induceren tegen M.tb-infectie en/of -overdracht, d.w.z. de werkzaamheid van het vaccin, een M.tb-provocatie in vivo 5,11. Interessant is dat BCG-vaccinatie niet-specifieke effecten induceert die de overleving van andere bacteriële en virale pathogenen beïnvloeden12,13 via het mechanisme van getrainde immuniteit14. Om de levensvatbare bacteriële belasting in een besmet dier te kwantificeren, is de voorkeursmethode de telling van bacteriekolonies door middel van de kolonievormende eenheden (CFU) assay 5,15. CFU is een eenheid die een schatting maakt van het aantal micro-organismen (bacteriën of schimmels) dat kolonies vormt onder specifieke groeiomstandigheden. CFU's zijn afkomstig van levensvatbare en replicatieve micro-organismen, en het absolute aantal levende micro-organismen in elke kolonie is moeilijk in te schatten. Het is onzeker of een kolonie is ontstaan uit één of meerdere micro-organismen. De CFU-eenheid weerspiegelt deze onzekerheid, vandaar dat er een grote variabiliteit kan worden waargenomen in replicaten van hetzelfde monster. Deze tijdrovende test vereist gespecialiseerde technici die zijn opgeleid om te werken in een faciliteit van bioveiligheidsniveau 3 (BSL3), een aanzienlijk laboratorium en incubatorruimte, duurt 4 tot 6 weken en is vatbaar voor besmetting.

In deze studie beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor kolonietelling, de micro-CFU (mCFU), en bieden we een eenvoudige en snelle oplossing om de resultaten 15,16,17,18,19,20 te analyseren. De mCFU-test vereist tien keer minder reagentia, verkort de incubatietijd met een factor drie, duurt 1 tot 2 weken om te voltooien, vermindert de laboratoriumruimte en de reagenskosten en minimaliseert de gezondheids- en veiligheidsrisico's die gepaard gaan met het werken met grote aantallen M.tb. We stellen voor dat deze methode universeel wordt toegepast voor preklinische studies naar het bepalen van de werkzaamheid van vaccins, wat uiteindelijk leidt tot een tijdsbesparing in de ontwikkeling van vaccins tegen tuberculose. Ten slotte is deze geoptimaliseerde methode van CFU-telling gebruikt om niet alleen mycobacteriën te kwantificeren, maar ook andere bacteriën, zoals Escherichia coli en Ralstonia solanacearum21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het hier beschreven protocol is voor BCG, maar kan worden toegepast op alle mycobacteriën. BCG kan worden gebruikt als surrogaatbacterie voor tbc-experimenten wanneer BSL3-faciliteiten niet beschikbaar zijn22. De volgende procedures waarbij BCG wordt gebruikt, moeten worden uitgevoerd in een laboratorium van bioveiligheidsniveau 2 (BSL2) en moeten de toepasselijke bioveiligheidsrichtlijnen en goede laboratoriumpraktijken voor de manipulatie van micro-organismen van gevarengroep 2 volgen.

1. Voorbereiding van de cultuurmedia

  1. Bereid Middlebrook 7H9-bouillon aangevuld met 10% (v/v) oliezuur, albumine, dextrose en catalase (OADC) verrijking, volgens de instructies van de leverancier. Vul de bouillon aan met 0,05% (v/v) tyloxapol.
    OPMERKING: Tyloxapol is een niet-ionisch vloeibaar polymeer dat is gebruikt als oppervlakteactieve stof om de vorming van bacteriële klonten te voorkomen16.
  2. Bereid Middlebrook 7H10 solid medium aangevuld met 10% (v/v) OADC-verrijking volgens de instructies van de leverancier.
  3. Verdeel 40 ml medium per vierkante petrischaal (120 mm x 120 mm). Laat de platen drogen om condensatie aan het oppervlak van de agar tot een minimum te beperken.
    OPMERKING: Deze specifieke grootte van de petrischaal is van fundamenteel belang om directe transponering van ten minste 96 druppels van een plaat met 96 putjes mogelijk te maken. Effectief drogen van de platen zal later het uitplateren van kleine druppeltjes bacteriële suspensie vergemakkelijken en voorkomen dat de druppels zich verspreiden.
  4. Bereid Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI 1640) of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) voor om het infectiemedium te produceren. Vul in beide gevallen het medium aan met 10% foetaal kalfsserum, 1% L-glutamine en 1 mM natriumpyruvaat. Voeg geen penicilline en streptomycine toe aan het medium.

2. Voorbereiding van het monster

  1. Verkrijg monsters uit verschillende bronnen. Om CFU te kwantificeren om de werkzaamheid van een tbc-vaccin te evalueren, moet u doorgaans monsters nemen van gevaccineerde en niet-gevaccineerde dierlijke weefsels. Bijvoorbeeld muizenlong en milt11 of makaaklong, thoracale en perifere lymfeklieren, milt, lever, huid, bloed, beenmerg en bronchoalveolaire spoeling23. U kunt ook monsters nemen van in vitro culturen van macrofagen/dendritische cellen/neutrofielen die zijn geïnfecteerd met BCG 18,19,20,24,25,26.

3. Productie van BCG-cultuur

OPMERKING: Voor in vivo studies van tbc-vaccins is het doel om de werkzaamheid van BCG te verbeteren. Daarom worden BCG-gevaccineerde groepen meestal als controle gebruikt. BCG-stammen die worden gebruikt voor vaccinatie bij mensen zijn ideaal om in diermodellen te testen. In dit geval moet een BCG-kweek worden gereconstitueerd volgens de instructies van de leverancier27. Een BCG-kweek voor in vivo studies kan echter ook intern worden geproduceerd11. De productie van eencellige, uniforme en hoogwaardige BCG-kweek voor in-vitro-infectieprotocollen is zeer succesvol geproduceerd in verschillende onderzoeken 11,16,18,19,20,26,28,29, met behulp van het volgende protocol, dat ook kan worden gebruikt voor dierprovocatiestudies.

  1. Kweek 50 ml BCG in 7H9 bouillon, bij 37 °C, met roeren bij 200 omw/min. Varieer het volume volgens de behoeften van het experiment.
  2. Verzamel elke dag, gedurende 8-10 dagen, 100 μL van de cultuur en verdun deze door 900 μL PBS toe te voegen aan een cuvet van 1 ml. Ga vervolgens verder met het meten van de optische dichtheid van bacteriën (OD bij λ=600 nm; OD600) in een spectrofotometer. Teken een groeicurve van die waarden. Identificeer de mid-log-fase van de cultuur (wanneer de OD consequent per tijdseenheid verdubbelt).
  3. Bereid een volgende cultuur voor en incubeer tot het bereiken van de midden/late groeifase van de stam, zoals in de stappen 3.1 en 3.2. Gebruik de waarden die in de vorige stap zijn verkregen als richtlijn. Zorg ervoor dat de cultuur niet de stationaire groeifase bereikt (wanneer de OD begint te stabiliseren) om een cultuur van goede kwaliteit van levensvatbare bacteriën te behouden.
  4. Verzamel de cultuur in de midden/late groeifase van de stam. Centrifugeer op 3000 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant.
  5. Voeg 10 ml PBS toe om de bacteriën te wassen. Centrifugeer op 3000 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant.
  6. Resuspendeer de bacteriën met 5 ml infectiemedium. Plaats de buis gedurende 15 minuten in een ultrasoon bad, vol vermogen bij 80 Hz.
  7. Centrifugeer op 1000 x g gedurende 10 min. Verzamel het supernatans en vermijd de pellet, want deze is rijk aan bacteriële klonten die moeten worden vermeden in een hoogwaardige BCG-cultuur en gooi het weg.
  8. Meet de OD van de supernatant. Hier zijn culturen in de exponentiële groeifase, met een OD600 van 0,1, gelijk aan 1 x 107 CFU/ml.
    OPMERKING: Elk laboratorium moet zijn eigen BCG-groeicurven produceren voordat met experimenten wordt begonnen om een lineaire regressie tussen OD600 en CFU vast te stellen met behulp van de spectrofotometer. Houd er rekening mee dat spectrofotometers verschillende lichtpadafstanden hebben, waardoor de metingen die voor hetzelfde monster worden verkregen, kunnen variëren.
  9. Voer eenvoudige berekeningen uit om het aantal bacteriën vast te stellen dat aan elke gastheercelcultuur moet worden toegevoegd. Het aantal bacteriën per gastheercel is de Multiplicity of Infection (MOI). Gebruik een MOI van 10 bacteriën per gastheercel, wat de meest voorkomende MOI is die wordt gebruikt voor BCG-infectie-experimenten.

4. Eenheidstest voor het vormen van microkolonies

OPMERKING: Nadat een in vivo of in vitro infectie-experiment is voltooid, kan de telling van bacteriën worden uitgevoerd door mCFU. Voor in-vivo-onderzoek moeten de monsters eerst worden gehomogeniseerd in een kralenklopper of een andere weefselhomogenisator. Voor in-vitroculturen van macrofagen/dendritische cellen/neutrofielen die zijn geïnfecteerd met BCG, moeten monsters worden gelyseerd met een niet-ionisch reinigingsmiddel (bijv. 0,05%-oplossing van niet-ionisch, niet-denaturerend reinigingsmiddel).

  1. Seriële verdunningen met behulp van een plaat met 96 putjes: voer seriële 10-voudige verdunningen van de lysaten uit in een steriele plaat met 96 putjes volgens het schema in figuur 1A. Verdeel de lysaten over de rijen A en E. Voor elke plaat is het maximum aantal monsters en/of replicaten 24.
  2. Voeg 180 μL dH2O toe aan de resterende putjes om de seriële verdunning uit te voeren.
  3. Resuspendeer met een 12-kanaals pipet de lysaten in rij A en breng 20 μl over naar rij B (20 μl lysaat + 180 μl dH2O). Homogeniseer goed. Herhaal deze stap achtereenvolgens voor rij B en C tot de laatste verdunning in rij D.
    OPMERKING: We voeren meestal drie verdunningen uit (100, 101, 102, 103), waarbij we 4 rijen van de plaat (AD of EH) gebruiken voor elke set van 12 monsters en/of replicaten.
  4. Microdruppelplating: gebruik een meerkanaalspipet van 0,5-10 μl (dunne punten hebben de voorkeur) om 5 μl over te brengen van elke rij van de plaat met 96 putjes naar de massieve middelgrote vierkante plaat, volgens figuur 1B.
  5. Terwijl je de druppels van 5 μL langzaam pipettert, laat je ze de agar lichtjes raken. Dit zal helpen om de druppel van de punt naar de agar te verwijderen en de kans op het vasthouden van de vloeistof in de punt te verminderen.
  6. Laat de druppels drogen, sluit de agarplaat en incubeer deze bij 37 °C terwijl u de bacteriegroei in de gaten houdt. Eventueel kunnen de agarplaten in een afgesloten plastic zak worden geïncubeerd om te voorkomen dat de platen uitdrogen.
  7. Microkolonietelling: na ongeveer 6-10 dagen incubatie, controleer op individuele kolonies die met het blote oog zichtbaar zijn (figuur 2).
  8. Tel de kolonies met behulp van het objectief met de laagste vergroting (4x of lager) van een omgekeerde optische microscoop of vergrootglas. De tellingen moeten worden uitgevoerd in de verdunningen waar het aantal kolonies lager is dan 300 en hoger dan 30. U kunt ook een camera gebruiken om een foto van de druppel te maken om handmatig kolonies op de computer te tellen of software zoals ImageJ gebruiken om het tellen van kolonies te automatiseren.
  9. Gebruik de volgende vergelijking om celgetallen in kve/ml uit te drukken:
    figure-protocol-1
    Waarbij C = aantal getelde kolonies, V = volume in μL en Dil = verdunning waarbij de kolonies werden geteld (100, 101, 102, 103). Als bijvoorbeeld 30 kolonies werden geteld in een druppel van 5 μL in verdunning 102, dan:
    figure-protocol-2

figure-protocol-3
Figuur 1. Schematische weergave van het mCFU-protocol. (A) Seriële 10-voudige verdunningen van de BCG-bevattende lysaten in een plaat met 96 putjes. (B) Vierkante petrischaal met vast kweekmedium en bedekt met 96 druppels van elk 5 μl. Druppels worden rechtstreeks vanaf de plaat met 96 putjes gepipetteerd met behulp van een meerkanaalspipet. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 2. Microkolonie die eenheden van BCG vormt na 10 dagen incubatie. Links een foto van een vierkante petrischaal met daaroverheen 96 druppels van elk 5 μL, zoals eerder weergegeven in figuur 1B. Aan de rechterkant komen individuele foto's van 3 druppels overeen met een origineel lysaat (100) en twee verdunningen (101, 102). De foto's zijn gemaakt met een DSRL-camera die is uitgerust met een 18-55 mm zoomlens (plaat) of een 105 mm macrolens (druppels). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Telling van microkolonies in Fiji (ImageJ)

OPMERKING: De mCFU-methode maakt kwantificering van CFU van grote sets monsters mogelijk. Foto's van de druppeltjes kunnen worden opgenomen voor analyse achteraf om het tellen van kolonies te vergemakkelijken. Verschillende fotografische apparaten kunnen voor dit doel afbeeldingen produceren met voldoende kwaliteit. Deze omvatten digitale camera's, webcams, aan de camera bevestigde microscopen en vergrootglazen, en mobiele telefoons. Gratis beeldanalysesoftware zoals ImageJ biedt de mogelijkheid om handmatig of geautomatiseerd kolonies te tellen in die beelden. Om beide methoden te demonstreren, zal Fiji worden gebruikt, een distributie van ImageJ die verschillende tools voor wetenschappelijke beeldanalyse bevat30. Fiji kan worden gedownload van https://fiji.sc/.

  1. Handmatige telmethode
    1. Open de afbeelding met de mCFU in Fiji. Selecteer Plug-ins > Analyseer > Cell Counter.
    2. Selecteer in het menu Celteller de optie Initialiseren en selecteer vervolgens een teller (bijvoorbeeld Type 1).
    3. Ga verder door op elke kolonie te klikken. Elke klik wordt op de afbeelding weergegeven en zal de teller bijwerken (Figuur 3). Als u onbedoelde klikken ongedaan wilt maken, selecteert u Verwijderen.
    4. Registreer de waarde die op de teller wordt weergegeven. Klik op de knop Opnieuw instellen om de telling opnieuw in te stellen en een nieuwe afbeelding te openen om extra monsters te tellen.
      OPMERKING: Verdere instructies over deze plug-in zijn te vinden op https://imagej.net/plugins/cell-counter.
  2. Geautomatiseerde telmethode
    1. Open de afbeelding met de mCFU in Fiji. Selecteer Afbeelding > Type > 8-bits. Hiermee wordt de afbeelding geconverteerd naar een 8-bits grijswaardenafbeelding.
    2. Selecteer het gereedschap Ovaal in de werkbalk en teken een ovaal rond het gebied met de kolonies (Figuur 4A). Het ovaal kan na het tekenen worden aangepast.
    3. Selecteer Bewerken > Buiten wissen om interferentie van de buitenruimte te verwijderen (Figuur 4B). Selecteer Afbeelding > pas > drempelwaarde aan.
    4. Verplaats de schuifregelaars in het drempelmenu totdat de kolonies rood worden weergegeven en achtergrondgeluid wordt geminimaliseerd (Figuur 4C).
    5. Selecteer Toepassen en sluit het drempelvenster. Er wordt een zwart-witbeeld gegenereerd (Figuur 4D).
    6. Selecteer Analyseren > Deeltjes analyseren. Geef in het venster deeltjes analyseren het bereik op voor koloniegebied (tussen 1 en oneindig, gemeten in vierkante pixels) en circulariteit (tussen 0 en 1, waarbij 1 een perfecte cirkel is; Figuur 4E).
    7. Selecteer Contouren in het pop-upmenu weergeven. Vink Weergaveresultaten aan voor gedetailleerde metingen voor elke kolonie in het resultatenvenster. Vink Resultaten wissen aan om eerdere metingen te wissen. Vink het vakje Samenvatten aan om de samengevatte resultaten van de metingen weer te geven (Figuur 4E).
    8. Start de analysator door OK te selecteren. Er verschijnt een nieuw venster met alle omlijnde kolonies die zijn gedetecteerd en geteld. Het resultatenvenster toont de details voor elke kolonie en het samengevatte resultatenvenster toont het totale aantal getelde kolonies (Figuur 4F).
      OPMERKING: De instellingen voor grootte en rondheid zijn afhankelijk van de resolutie en vergroting van de afbeelding en de grootte en vorm van de kolonies. Herhaal het proces meerdere keren totdat de beste instellingen zijn gevonden die alle kolonies detecteren. Verdere instructies over de plug-in voor het analyseren van deeltjes zijn te vinden op https://imagej.nih.gov/ij/docs/menus/analyze.html#ap.

figure-protocol-5
Figuur 3. Een handmatige methode voor het tellen van mCFU met behulp van de celteller-plug-in op Fiji-software. De blauwe stippen geven kolonies aan waarop de gebruiker al heeft geklikt. Het menu aan de rechterkant toont het aantal kolonies dat tot nu toe is geteld (het aantal is 41). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-6
Figuur 4. Een geautomatiseerde methode voor het tellen van mCFU met behulp van Fiji-software. (A, B) Het interessegebied met de kolonies wordt geselecteerd met behulp van het ovale selectiegereedschap en het buitengebied wordt verwijderd met het commando buiten wissen. (C, D) Met behulp van de drempeltool wordt een zwart-witbeeld van de kolonies gegenereerd. (E, F) Het aantal kolonies wordt gekwantificeerd met behulp van de tool deeltjes analyseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hier beschreven mCFU-test verhoogt de hoeveelheid informatie die uit een enkele petrischaal kan worden gehaald tot ten minste 96 keer. Figuur 5 toont een vergelijking van twee methoden voor medicijnafgifte voor het hergebruikte gebruik van saquinavir (SQV)31,32 als een op de gastheer gericht medicijn voor de behandeling van tuberculose. In deze test werden vier verschillende stammen van Mycobacterium tuberculosis gebruikt...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Tbc is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid dat steeds belangrijker wordt, vooral in lage- en middeninkomenslanden. De verstoring van zorginstellingen voor het diagnosticeren en behandelen van tuberculose tijdens de COVID-19-pandemie had een negatief effect op de incidentie van nieuwe gevallen1. Bovendien moeten de multi-drug en extensief resistente M.tb-stammen en de co-infectie van M.tb en HIV dringend worden aangepakt om deze epidemie onder controle te krijgen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

DP en PJGB verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die als een potentieel belangenconflict zouden kunnen worden opgevat.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door interne financiering van de Faculteit der Geneeskunde, Universidade Católica Portuguesa, en externe financiering van Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), in het kader van de subsidies UIDP/04279/2020, UIDB/04279/2020 en EXPL/SAU-INF/0742/2021.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well platesVWR734-2781
DSLR 15-55 mm lensNikonAF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR cameraNikonD3400
DSLR macro lensSigmaMACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serumGibco10270106
Fiji Softwarehttps://fiji.sc/Fiji is een open-source software ondersteund door verschillende laboratoria, instellingen en individuen. Alle vereiste plugins zijn inbegrepen.
Igepal CA-630Sigma-Aldrich18896
L-glutamineGibco25030-081
Middlebrook 7H10BD262710
Middlebrook 7H9BD271310
Multichannel pipette (0,5 - 10 µl)GilsonFA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)GilsonFA10011
Mycobacterium bovis BCG American Type Culture CollectionATCC35734strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichmentBD211886
Phosphate buffered saline (PBS)NZYTechMB25201
RPMI 1640 mediumGibco21875091
Sodium pyruvateGibco11360-070
Spectrophotometer UV-6300PCVWR634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mmCorningBP124-05
TyloxapolSigma-AldrichT8761
Ultrasound bath Elma P 30 HVWR142-0051

Referenties

  1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2022. , World Health Organization. Geneva. (2022).
  2. Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
  3. Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
  4. Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431(2020).
  5. McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
  6. Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199(2018).
  7. Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
  8. Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
  9. Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
  10. Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
  11. Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2(2020).
  12. Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
  13. Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808(2022).
  14. Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098(2016).
  15. Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
  16. Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
  17. Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
  18. Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819(2017).
  19. Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247(2016).
  20. Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19(2013).
  21. Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707(2023).
  22. Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
  23. Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
  24. Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
  25. Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202(2020).
  26. Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
  27. Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447(2012).
  28. Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478(2017).
  29. McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409(2018).
  30. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  31. Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944(2022).
  32. Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728(2021).
  33. Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
  34. Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
  35. Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691(2023).
  36. Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
  37. Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
  38. Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460(2020).
  39. Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
  40. Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Micro CFU assaytuberculosevaccinskolonievormende eenhedenMycobacterium tuberculosisBCG vaccinseri le verdunningincubatie op agarplatengeautomatiseerde kolonietellingImageJ analyseevaluatie van vaccineffici ntie

Gerelateerde artikelen