Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Tuina-manipulatie om ontsteking en kraakbeenverlies bij knieartroseratten te verminderen

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65451

⸱

30 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol voor Tuina-manipulatie uitgevoerd op gips-geïmmobiliseerde geïnduceerde knieartroseratten. Op basis van de voorlopige resultaten suggereerde het dat de werkzaamheid van de methode afhankelijk was van de vermindering van ontsteking en kraakbeenverlies.

Samenvatting

Klinische studies suggereren dat Tuina-manipulatie effectief is bij de behandeling van knieartrose (KOA), terwijl verdere studies nodig zijn om het mechanisme ervan te ontdekken. Daarom is de manipulatie van diermodellen van knieartrose van cruciaal belang. Dit protocol biedt een standaardproces voor Tuina-manipulatie op KOA-ratten en een voorlopige verkenning van het mechanisme van Tuina voor KOA. De pers- en kneedmanipulatiemethode (een soort Tuina-manipulatie die verwijst naar het persen en kneden van het specifieke gebied van het lichaamsoppervlak) wordt toegepast op 5 acupunten rond het kniegewricht van ratten. De kracht en frequentie van de manipulatie werden gestandaardiseerd door vingerdrukregistraties en de positie van de rat tijdens manipulatie wordt in detail beschreven in het protocol. Het effect van manipulatie kan worden gemeten door pijngedragstests en microscopische bevindingen in synoviaal en kraakbeen. KOA-ratten vertoonden een significante verbetering van het pijngedrag. De synoviale weefselinfiltratie was verminderd in de Tuina-groep en de expressie van tumornecrosefactor (TNF)-α was significant lager. In vergelijking met de controlegroep was chondrocytenapoptose minder in de Tuina-groep. Deze studie biedt een gestandaardiseerd protocol voor Tuina-manipulatie op KOA-ratten en voorlopig bewijs dat de therapeutische effecten van Tuina verband kunnen houden met het verminderen van synoviale ontsteking en vertraagde chondrocytenapoptose.

Inleiding

Knieartrose (KOA) is een degeneratieve ziekte die zich voornamelijk manifesteert in gewrichtspijn. Fibrose, kraken, ulceratie en verlies van gewrichtskraakbeen zijn de belangrijkste oorzaken van deze ziekte1. KOA heeft een hoge prevalentie en kan resulteren in een diepgaande impact op het dagelijks leven van patiënten, waardoor in ernstige gevallen invaliditeit ontstaat. Onder mensen van 45-84 jaar neemt de prevalentie van KOA toe met de leeftijd en de prevalentie onder mensen van 85 jaar en ouder is 15%, met een overwicht bij vrouwen 2,3. Bovendien kan KOA een ernstige economische last met zich meebrengen voor zowel het individu als de samenleving. Een enquête toonde aan dat de directe kosten van de gezondheidszorg op KOA per hoofd van de bevolking opliepen tot $ 8.858 ± $ 5.120 per jaar4. Met de vergrijzing van de samenleving is KOA een wereldwijd gezondheidsprobleem en een groot maatschappelijk probleem geworden, evenals een actueel onderwerp voor wetenschappelijk onderzoek.

Evidence-based studies hebben de effectiviteit van Tuina-manipulatie bij de behandeling van KOA5 aangetoond. Tuina-manipulatie kan pijn verlichten en disfunctie verbeteren bij KOA-patiënten, waarvan het mechanisme verband houdt met ontstekingsremmende effecten 6,7. Geleerden ontdekten dat Tuina-manipulatie effectief de expressie van ontstekingsfactoren interleukine (IL) -β en 5-hydroxytryptamine remde en de degeneratie van gewrichtskraakbeen in een konijn KOA model8 vertraagde. Het suggereerde dat Tuina de bloedcirculatie en het metabolisme op de laesieplaats kon bevorderen, wat hielp bij het verwijderen van ontstekingsfactoren zoals IL-1, IL-6 en tumornecrosefactor (TNF) -α, waardoor de klinische symptomen van KOA9 werden verlicht. Bovendien kan de passieve beweging van het gewricht door Tuina-manipulatie de penetratie en diffusie van synoviale vloeistof in het gewrichtskraakbeen bevorderen en het metabolisme van weefselvoedingsstoffen verbeteren10. Andere studies suggereerden dat Tuina-manipulatie de biomechanische indexen bij KOA-patiënten effectief kan verbeteren11. Manipulaties toegepast op zachte weefsels kunnen de stressverdeling over ledematen verbeteren en de balansfunctie verbeteren12,13. Tegelijkertijd kan met sommige gewrichtsaanpassingsmanipulaties ook de uitlijning van de onderste ledematen worden aangepast om abnormale gangen te corrigeren14,15.

Het werkingsmechanisme van Tuina-manipulatie bij de behandeling van KOA moet nog worden onderzocht en daarom is een experimentele studie noodzakelijk. De sleutel tot de toepassing van Tuina bij proefdieren is de standaardisatie van modellerings-, dierfixatie- en interventiemethoden16. De modelleringsmethode bepaalt of het proefdier de kenmerken van de ziekte kan vertonen. Ondertussen kunnen geschikte fixatiemethoden de interventie van de Tuina-manipulatie vergemakkelijken en het effect van Tuina beter weerspiegelen. De standaardisatie van interventiemethoden is het moeilijkste deel van Tuina-manipulatie. In 2010 vermeldde het basissysteem van Chinese acupunctuurstandaarden de acupunctuurpuntnormen voor proefdieren, die de mogelijkheid bieden voor acupunctuur en Tuina-operaties in dierproeven17. Er zijn echter nog steeds problemen bij het standaardiseren van Tuina-manipulatie. Er zijn meerdere soorten Tuina-manipulatie18. De keuze van de specifieke manipulatie hangt voornamelijk af van de te behandelen ziekte en de therapeutische theorieën die de uitvoerder verkiest. In de studie van Tuina voor KOA is meer aandacht besteed aan de puntdrukkende manipulatie (het indrukken van de specifieke acupunten met de duim of elleboog), Yizhichan duwende manipulatie (een duwende manipulatie door met de duim te wiebelen) en pers- en kneedmanipulatie (wat verwijst naar het drukken en kneden van het specifieke gebied van het lichaamsoppervlak met de vinger of handpalm)19. Pers- en kneedmanipulatie is een van de meest gebruikte Tuina-manipulaties, die persen en kneden combineert om het onderhuidse weefsel te verplaatsen20. Pers- en kneedmanipulatie toegepast op acupunten kan de bloedcirculatie bevorderen en pijn verlichten en vertegenwoordigt het therapeutische effect van Tuina op KOA19.

In dit protocol zal de werking van pers- en kneedmanipulatie op KOA-ratten in detail worden beschreven, inclusief geselecteerde acupunten, intensiteit en frequentie van de manipulatie en de lichaamspositie van de rat, om een referentie te bieden voor toekomstig onderzoek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deze studie is geslaagd voor de dierethische beoordeling uitgevoerd door de experimentele dierethische commissie van het Yueyang-ziekenhuis van geïntegreerde traditionele Chinese en westerse geneeskunde verbonden aan de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (YYLAC-2022-166).

1. Voorbereiding en groepering van proefdieren

  1. Voorbereiding van dieren
    1. Grootbrengen in totaal 10 gezonde SPF SD vrouwelijke ratten van 200-220 g bij kamertemperatuur (18-21 °C), vochtigheid 40% -50%, 12 uur: 12 uur circadiane ritmewisselingen. Pijngerelateerde dierproeven uitvoeren in strikte overeenstemming met de relevante bepalingen van dierethische richtlijnen en richtlijnen.
  2. Groepering van dieren
    1. Verdeel de ratten willekeurig in de Tuina-groep en de controlegroep. Behandel ratten van de Tuina-groep met pers- en kneedmanipulatie gedurende 21 dagen na het modelleren. Zet ratten van de controlegroep in dezelfde Tuina-kamer en plaats ze tegelijkertijd in een zwarte stoffen zak terwijl de Tuina-groep een behandeling ondergaat.

2. Modellering van dieren

  1. Het dier verdoven
    1. Gebruik isofluraan voor gasanesthesie. Plaats de rat in de inductiebox met een inductieconcentratie van 3%. Wiebel de doos na het neerleggen van de rat en bevestig de verdoving wanneer de rat omrolt zonder te proberen terug te keren naar de buikligging.
    2. Verwijder de rat uit de inductiedoos en bevestig zijn neus in het verdovingsmasker. Stel de isofluraanconcentratie in op 2% om de anesthesie te behouden. Bevestig de verdoving wanneer de rat niet reageert bij het knijpen van zijn poten. Breng oogzalf aan op de ratten om uitdroging te voorkomen wanneer ratten worden verdoofd, omdat de oogleden niet kunnen worden gesloten.
  2. Modelleringsmethode21
    1. Gebruik een scheermachine om het haar van de rechterachterpoot te verwijderen. Plaats een medisch wattenschijfje tussen de rechterenkel en het heupgewricht van de rat. Bevestig het rechter kniegewricht op 180° extensie met 5-6 lagen nat gipsverband gelijkmatig. Spiraalwikkel het gipsverband vanaf de enkel en bedek 1/3 van het vorige. Gebruik een föhn om de pleister te drogen en uit te harden.
    2. Externe wikkel de pleister met basismateriaal van de kunstgebit nadat het gipsverband droogt en uithardt om de pleister te fixeren en te voorkomen dat deze knaagt.
    3. Meng de basismaterialen van het kunstgebit om het plakkerig te maken en hecht het mengsel aan de buitenkant van de pleister (het mengsel mag de rand van het verband niet overschrijden, figuur 1). Nadat het mengsel hard is geworden, schakelt u het anesthesieapparaat uit en wacht u tot het dier op natuurlijke wijze wakker wordt. Houd toezicht op de ratten om anesthesie-ongelukken te voorkomen voordat de ratten wakker worden.
    4. Bevestig de pleister op de juiste achterpoot van de rat, omdat een strakke fixatie de bloedcirculatie beperkt, terwijl een losse fixatie de neiging heeft om af te vallen. Observeer de bloedcirculatie in de terminale ledemaat. Als zwelling van de terminale extremiteit of een paarse teint wordt gedetecteerd, snijd dan onmiddellijk een deel van de pleister af om de bloedsomloop te helpen herstellen. Maak de pleister opnieuw als deze is gebroken en de extensie van de onderste ledematen niet kan behouden.
    5. Verwijder de pleister na 3 weken continue immobilisatie. Gebruik een chirurgische schaar om het basismateriaal van de prothese buiten en het gipsverband af te knippen. Spoel de onderste ledemaat van de rat af met zoutoplossing en droog deze af met gaas. Als er lokale huidlaesies zijn, steriliseer dan met jodophor.
  3. Modelverificatie22
    1. Verificatie op basis van röntgenstraling
      1. Voer 1 dag na het einde van de modellering een röntgenonderzoek van de rechterknie uit. Maak anteroposterieure röntgenfoto's in rugligging met heupflexie bij 30°, knie-extensie bij 0° en heupabductie bij 15°. Houd de patella direct voor de knie en plaats de radiatorbuis op 110 mm van het kniegewricht.
      2. Maak laterale röntgenfoto's in de rechter laterale decubituspositie met rechterheupflexie bij 30° en rechterknie-extensie bij 0°. Maak de heupflexie van de linkerledemaat op 70° en knieflexie op 45° en plaats de radiatorbuis op 110 mm afstand van het kniegewricht. Stel de detectieparameters in als blootstellingsspanning 50 kV, stroom 250 mA, blootstellingsdosis 32 mAs en blootstellingstijd 128 ms.
      3. Vergelijk met de röntgenfoto van normale ratten, controleer of de gemodelleerde röntgenfoto van de knie smallere gewrichtsruimte laat zien met osteofytenhyperplasie aan de rand.
    2. Osteoarthritis Research Society International (OARSI) score23
      1. Plaats de rat in de euthanasiebox en perfuseer CO2 met een snelheid van 30% -70% kooivolume per minuut. Stop met het perfuseren van CO2 nadat is vastgesteld dat de rat onbeweeglijk is, niet ademt en dat de pupil verwijd is. Observeer nog eens 2 minuten om de dood te bevestigen.
        OPMERKING: Cervicale dislocatie kan worden uitgevoerd na op CO2 gebaseerde euthanasie als een secundaire vorm om de dood te bevestigen. Bevestig de rat op de tafel en pak zijn staart met één hand vast. Druk met de duim en wijsvinger van de andere hand op de kop van de rat. Bevestig de dood bij het horen van het geluid van een barst en de rat verliest tegelijkertijd beweging en hartslag.
      2. Bevestig de rat in rugligging met een spuitnaald op een schuimplaat met de rechter achterpoot gebogen in abductie en externe rotatie. Knijp de huid rond het kniegewricht dicht met een chirurgische schaar. Stel de spieren rond het kniegewricht bloot door de huid te snijden en vervolgens de onderhuidse fascia te snijden.
      3. Knip de dijbeen- en scheenbeendiafyse af met een botschaar en verwijder het rechter kniegewricht. Verwijder voorzichtig de extra zachte weefsels, zoals spieren en ligamenten, buiten het gewricht.
      4. Bevestig de verbinding in 4% paraformaldehyde gedurende 24-48 uur bij 4 °C. Ontkalk het gewricht gedurende 3 dagen in 10% mierenzuuroplossing totdat het botweefsel gemakkelijk met een naald kan worden geprikt.
      5. Plaats en trim het ontkalkte weefsel in de zuurkast en breng het over naar een uitdrogingsbox in de uitdrogingsmachine. Voeg 75% ethanol toe gedurende 4 uur, dan 90% ethanol gedurende 2 uur, gevolgd door 95% ethanol gedurende 1 uur, absolute ethanol gedurende 30 minuten, nog een ronde verse absolute ethanol gedurende 30 minuten, alcoholbenzeen gedurende 5-10 minuten, xyleen gedurende 5-10 minuten, nog een ronde verse xyleen gedurende 5-10 minuten, was gedurende 1 uur, nog een ronde verse was gedurende 1 uur, en laatste ronde verse was gedurende 1 uur voor uitdroging en transparante wasonderdompeling.
      6. Plaats vervolgens het weefsel in de machine voor inbedding. Snijd het wasblok in plakjes was van 4 μm nadat de paraffine is uitgehard en druk het plakje plat in warm water. Leg de plak op een glazen glaasje en droog. Bewaar het bij kamertemperatuur.
      7. Observeer het kraakbeenmonster en scoor het volgens de beoordeling van de artrose kraakbeenhistopathologiegraad (tabel 1)23. Als de score van ratten na modellering significant hoger is dan die van de normale ratten, was modellering succesvol.

Tabel 1. OA kraakbeen histopathologie graad beoordeling. Graad is diepteprogressie in kraakbeen. Totaalscore = Grade x Staging. 0 voor normale gewrichten, 24 voor ernstige artritis. Klik hier om deze tabel te downloaden.

figure-protocol-1
Figuur 1. Ratten geïmmobiliseerd in gips. Nadat de ratten waren verdoofd, werden hun rechter onderste ledematen omwikkeld met gipsverbanden, gefixeerd in de hyperextended positie en bedekt met een laag kunstgebitbasismaterialen buiten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Tuina manipulatie

  1. Toepassingsgebied
    1. Selecteer in totaal 5 acupunten op de rechterachterpoot van ratten, waaronder ST34, ST35, SP10, EX-LE4 en BL40 (figuur 2). Lokaliseer de acupunten volgens de principes van acupuntpositionering in 24.
  2. Positie voor toepassing
    1. Knip een zwarte doek in een zak van 9 cm x 15 cm met één zijopening en span de opening aan met een touw. Voor de Tuina-manipulatie trek je voorzichtig aan de staart van de rat om hem in de zak te laten graven en zijn achterpoten buiten de zak bloot te leggen.
    2. Gebruik één hand om de rat in buikligging te houden, waarbij hij zijn staart en achterpoot vasthoudt, terwijl de andere hand druk- en kneedmanipulatie toepast op een specifiek acupunt (figuur 3).
  3. Tuina manipulatie
    1. Bedien pers- en kneedmanipulatie op de 5 acupunten op de rechterachterpoot gedurende elk 2 minuten. Plaats de duim van de performer op het geselecteerde acupunctuurpunt om ritmisch te drukken en te kneden, waarbij de huid en het onderhuidse weefsel in een cirkelvormige beweging samen worden gedreven.
    2. Gebruik vingerdrukregistraties (eenheden in Newton) om een consistente intensiteit en frequentie van de manipulatie te garanderen. Houd de intensiteit tussen 3-5 N en de frequentie op 2 Hz (figuur 4). Breng de manipulatie eenmaal per dag gedurende 21 dagen aan.

figure-protocol-2
Figuur 2. Acupunten positie. SP10 bevindt zich 5 mm boven het binnenste kniegewricht bij ratten. ST34 bevindt zich 5 mm boven het buitenste kniegewricht bij ratten. EX-LE4 bevindt zich in de mediale zijde van het knieband, bij ratten. ST35 bevindt zich in de laterale kant van het knieband, bij ratten. BL40 bevindt zich in het midden van de dwarse popliteale streep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3. Tuina manipulatie toegepast op ratten. De ratten werden in een zwarte zak gehouden met hun achterpoten bloot. De performer hield de staart van de rat vast met de linkerhand terwijl de rechterhand de manipulatie uitvoerde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-4
Figuur 4. Vingerdruk opnames. Een apparaat dat de kracht en frequentie van vingerdruk registreert, wordt gebruikt voor realtime feedback over de intensiteit en frequentie in het proces van Tuina-manipulatie. (A) Druksensor en transmissieapparatuur. (B) Opname van vingerdruk. (C) De kracht die wordt geregistreerd tijdens Tuina-manipulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Pijngedragstests

  1. Test pijngedrag voor en na het modelleren, en op 1 dag na (D1), 7 dagen na (D7), 14 dagen na (D14) en 21 dagen na (D21) de Tuina-manipulatie, inclusief mechanische ontwenningsdrempel en pootontwenningslatentietests.
  2. Mechanische opnamedrempel (MWT)
    1. Plaats de ratten in een transparante cabine van 20 cm x 10 cm x 20 cm van gehard glas op een 40 cm hoog podium dat bestaat uit een draadrooster met een opening van 10 mm x 10 mm. Houd de kamertemperatuur op 23 °C ± 2 °C.
    2. Plaats de ratten ten minste 2 uur per dag in het gedragslaboratorium tijdens de gedragstestfase om interferentie met de testresultaten te voorkomen als gevolg van het gebrek aan aanpassing van de dieren aan de omgeving aan het begin van de formele test. Plaats de ratten 30 minuten voor aanvang van de formele test in het gedragslaboratorium om hun aanpassing aan de omgeving te vergemakkelijken en afleidende factoren te verminderen.
    3. Gebruik elektronische Von Frey-vezels om de MWT te meten. Stimuleer de rat met de vezel in het midden van zijn voet en trek de vezel terug wanneer de rat duidelijke bewegingen vertoont, zoals het optillen van het been en vermijden. De machine kan op dit moment automatisch de maximale drukwaarde (N) registreren.
    4. Start de volgende stimulatie bij dezelfde rat minstens 15 s na de huidige stimulatie. Niet meer dan 5 s tijdens elke stimulatie om sensibilisatie voor tactiele stimuli in de poten van ratten te voorkomen. Herhaal de test 5x totdat het verschil tussen de drie opeenvolgende metingen onbeduidend is (binnen 10 N).
    5. Verwijder de waarden met grote verschillen (de maximum- en de minimumwaarden) en neem het gemiddelde van de resterende drie waarden als de mechanische opnamedrempel.
  3. Paw withdrawal latency (PWL)
    1. Plaats de ratten in een klein compartiment van transparant gehard glas met een afmeting van 20 cm x 10 cm x 20 cm. Bedek de bovenkant van het compartiment met een transparante glazen afdekking met ventilatiegaten. Houd de temperatuur van de transparante glasplaat op 28-30 °C, waarop het compartiment wordt geplaatst.
    2. Laat de ratten minstens 30 minuten in deze omgeving rusten om te acclimatiseren voor het begin van elke formele test. Als ratten in het compartiment plassen of poepen, reinig het dan op tijd met absorberend papier om te voorkomen dat de daaropvolgende warmteoverdracht van lichtstraling wordt beïnvloed.
    3. Richt de schijnwerper op het midden van de voet van de rat en druk op de Start-knop . Druk op de stopknop wanneer de rat duidelijk gedrag vertoont, zoals het terugtrekken van de voet of het likken van de poot en noteer de tijd op dit punt. De bestralingstijd van de spot mag niet langer zijn dan 20 s om schade aan de huid van de rat te voorkomen.
    4. Voer de volgende bestraling uit op dezelfde rat na ten minste 10 minuten om sensibilisatie te voorkomen. Meet 5x op elke rat.
    5. Verwijder de waarden met grote verschillen (de maximale en de minimale waarde). Neem het gemiddelde van de resterende waarden als de PWL.

5. Monstervoorbereiding

  1. Voer euthanasie uit op de muis zoals beschreven in 2.3.2.1.
  2. Synoviaal membraanpreparaat
    1. Bevestig de rat in rugligging met een spuitnaald op een schuimplaat met de rechter achterpoot gebogen in de abductie en externe rotatie. Knijp de huid rond het kniegewricht met een chirurgische schaar en leg de spieren rond het kniegewricht van ratten bloot door de huid te knippen en vervolgens de onderhuidse fascia te knippen.
    2. Neem het patella-ligament als oriëntatiepunt om de spiergroepen boven het patella-ligament te strippen. Snijd het uiteinde van het patella-ligament (bij de tibiale tuberositeit) zorgvuldig in en vind het synoviale membraan wanneer het ligament van onderaf naar boven wordt geknepen.
    3. Knip het synoviale weefsel voorzichtig af met een oogheelkundige schaar en was het bloed en de synoviale vloeistof af met een voorgekoelde zoutoplossing. Bevestig het synoviale membraan in 4% paraformaldehyde gedurende ten minste 48 uur na het absorberen van water van het weefseloppervlak met schoon gaas.
    4. Bereid het monster voor zoals in de stappen 2.3.2.5- 2.3.2.6. Voer scores uit zoals in stap 2.3.2.7.
  3. Hematoxyline en eosine kleuring uitvoeren
    1. Dewax tot water met xyleen gedurende 20 minuten, vervang door een andere ronde vers xyleen gedurende 20 minuten, gevolgd door behandeling met watervrije ethanol gedurende 5 minuten, vervang door een andere ronde verse watervrije ethanol gedurende 5 minuten, voeg vervolgens 90% ethanol per volume toe gedurende 5 min, 80% ethanol per volume gedurende 5 min, 70% ethanol per volume gedurende 5 minuten, en ten slotte gedestilleerd water gedurende 5 minuten.
    2. Dompel de dia gedurende 3-8 minuten onder in hematoxyline-kleuringsoplossing. Verwijder de dia en spoel de vlek af met gedestilleerd water. Verplaats het gedurende bijna 30 s in de differentiatievloeistof (1% zoutzuuralcohol), zodat de dia vervaagt tot lichtblauw. Spoel het af met gedestilleerd water en plaats het gedurende 1-3 minuten in een eosinekleuringsoplossing.
    3. Droog de dia gedurende 5 minuten uit met 95% ethanolvolumefractie, vervang deze gedurende 5 minuten door nog een ronde verse 95% ethanol, gevolgd door watervrije ethanol gedurende 5 minuten, vervang deze gedurende 5 minuten door een nieuwe ronde verse watervrije ethanol.
    4. Maak de dia transparant door 5 minuten xyleen toe te voegen, vervang deze gedurende 5 minuten door een ander rondje vers xyleen en sluit het vervolgens af met neutrale hars.
  4. Terminal-deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde nick end labeling (TUNEL) op kraakbeen
    1. Droog het kraakbeenmonster uit in watervrije ethanol, 90% ethanol, 85% ethanol en 75% ethanol totdat de hydratatie van de was is voltooid. Laat 5 minuten weken in PBS. Voeg 3% H2 O2 druppelsgewijs toe gedurende 10 min.
    2. Voeg druppelsgewijs proteïnase K-werkoplossing toe en verteer gedurende 10 minuten bij 37 °C. Voeg 20 μL etiketteringsbuffer per plak toe om het vochtig te houden en schud overtollige vloeistof af na het bereiden van de werkoplossing. Voeg 20 μL werkoplossing toe aan elke dia en incubeer gedurende 2 uur bij 37 °C in een natte doos.
    3. Voeg druppelsgewijs 50 μL van de sluitingsoplossing toe en sluit gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens druppelsgewijs 50 μL verdund gebiotinyleerd anti-digoxineantilichaam (1:100 verdunning) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur in een natte doos. Voeg druppelsgewijs 10 μL SABC-antilichaamverdunningsmiddel (1:100 verdunning) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur in een natte doos.
    4. Voeg DAB-kleurontwikkelingsoplossing (50 μL elk van reagentia A, B en C in 1000 μL gedestilleerd water) druppelsgewijs gedurende 10-15 minuten toe. De kleurontwikkeling wordt voltooid wanneer deze bruingeel korrelig is.
    5. Opnieuw beitsen met hematoxyline gedurende 3 s. Na gradiëntuitdroging en transparante behandeling, droog bij kamertemperatuur en sluit de glijbaan zorgvuldig af met neutrale gom. Let op om te voorkomen dat er bubbels en overlopende lijm achterblijven.
  5. Immunohistochemische analyse van IL-1β en TNF-α
    1. Dewax de glaasjes routinematig in xyleen en hydrateer ze in gradiëntalcohol. Inactiveer het endogene peroxidase in de secties met 3% H2 O2. Plaats de schuifhouder in een citraatbuffer van 95 °C (pH 6,0) en incubeer gedurende meer dan 20 minuten in een waterbad boven 95 °C. Haal de incubatiebox eruit en laat deze minstens 20 minuten op kamertemperatuur staan.
    2. Incubeer 5% normaal geitenserum met PBS gedurende 10 minuten bij 37 °C en schud overtollig vocht af. Voeg druppelsgewijs 150 μL antilichaam I toe en laat 1 uur bij 37 °C staan en bewaar het vervolgens een nacht bij 4 °C. De volgende dag opnieuw opwarmen bij 37 °C gedurende 45 min.
    3. Was 3x met PBS gedurende 5 min elk. Bedek het weefsel op de dia met 3% BSA en sluit het gedurende 30 minuten af bij 37 °C. Voeg druppelsgewijs 150 μL antilichaam II toe en laat 1 uur op kamertemperatuur staan. Was 3x met PBS gedurende 5 minuten elk en voeg 150 ml DAB-kleurontwikkelingsvloeistof druppelsgewijs toe. Observeer de mate van kleuring onder de microscoop totdat het monster bruingeel wordt, zelfs met het blote oog.
    4. Spoel onmiddellijk af met PBS gedurende 10 minuten. Beits opnieuw met hematoxyline, droog uit in gradiëntalcohol, maak dia's transparant in xyleen en sluit af met neutrale gom.
  6. Statistische analyse
    1. Immunohistochemisch gekleurde secties met positieve expressie van het geassocieerde eiwit zijn geel of bruingeel. Scoor de intensiteit van positieve expressie door Image J-software voor elke groep immunohistochemische secties en gebruik de evaluatiecriteria van gemiddelde optische dichtheid (AOD), berekend door IOD gedeeld door gebied.
    2. Gebruik analysesoftware voor statistische analyse. Gebruik t-test als de gegevens overeenkwamen met de normale verdeling en chi-kwadraat en gebruik een niet-parametrische test als ze niet overeenkwamen met de normale verdeling. Analyseer herhaalde meetgegevens door gegeneraliseerde schattingsvergelijkingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Pijngedragstesten
De MWT-resultaten toonden aan dat de MWT van de rechter achterpoot na modellering significant lager was dan voorheen (p<0,05). Vergeleken met de controlegroep was de MWT van ratten significant verhoogd na Tuina (p<0,05; Figuur 5 en tabel 2).

figure-results-1
Figuur 5

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie biedt een protocol voor Tuina-manipulatie op KOA-ratten. Door middel van pijngedragstests en histomorfologische bevindingen suggereerde het dat een dergelijke reeks Tuina-manipulatie toegepast op KOA-ratten synoviale ontsteking en kraakbeenapoptose zou kunnen verminderen, wat een referentie zou kunnen zijn van Tuina-manipulatie op diermodellen van KOA.

Er zijn verschillende kritieke procedures tijdens het protocol. Ten eerste is het belangrijk om een geschikte methode te kiezen voo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door Shanghai Critical Clinical Specialties Construction Project (Grant Number: Shslczdzk04001); het zeilprogramma van de Shanghai Science and Technology Commission (subsidienummer: 22YF1444300); Projecten binnen het budget van Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Grant Number: 2021LK091).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
absolute ethanolSupelcoPHR1070Voor het maken van specimen
ALMEMO meetapparatuurahlborn2450-1Voor mechanische terugtrekkingsdrempeltest
Anti-Digoxin antilichaamSigma-AldrichSAB4200669Voor HE-kleuring IHC of TUNEL
Anti-IL-1 betaabcamab283818Voor HE-kleuring IHC of TUNEL
DAB SubstraatkitSolarbioDA1010Voor HE-kleuring IHC of TUNEL
Grondstoffen voor kunstgebittenShanghai New Century20000356Voor modelmaken
eosinebioswamp PAB180016 Voor HE-kleuring IHC of TUNEL
VingerdrukregistratiesSuzhou Changxian Optoelectronic TechnologyCX1003wVoor Tuina-manipulatie
forminezuuroplossingSigma-Aldrich695076Voor decalcificatie
H2O2Sigma-Aldrich386790-MVoor HE-kleuring IHC of TUNEL
hematoxylinenbioswamp PAB180015Voor HE-kleuring IHC of TUNEL
IsofluraanShanghai Yuyan Scientific Instrument CompanyS10010533Voor gasanesthesie
neutrale harsenbioswamp PAB180017Voor HE-kleuring IHC of TUNEL
Paraformaldehyde Fix-oplossingSigma-Aldrich100496Voor histologie
PBSSigma-AldrichP3813Voor HE-kleuring IHC of TUNEL
Plantaars testapparaatIITC Life Science/Voor Paw Withdrawal Latency test
Plaster of Paris bandageWANDE20150023Voor modelmaken
Proteinase KSigma-Aldrich124568Voor HE-kleuring IHC of TUNEL
TNF Alpha Monoklonaal antilichaamProteintech60291-1-IgVoor HE-kleuring IHC of TUNEL
TUNEL ServicebioGDP1042Voor HE-kleuring IHC of TUNEL
WasSigma-Aldrich327204Voor het maken van specimen
xyleenShanghai Sinopharm Group100092Voor het maken van specimen

Referenties

  1. Joint Surgery Group of Chinese Orthopaedic Association, Chinese Association of Orthopaedic Surgeons, National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese Journal of Orthopaedics. Chinese Osteoarthritis Treatment Guidelines (2021 Edition). Chinese Journal of Orthopaedics. 41 (18), 24(2021).
  2. David, S., et al. Epidemiology of knee osteoarthritis in general practice: a registry-based study. BMJ Open. 10 (1), 031734(2020).
  3. Callahan, L. F., Cleveland, R. J., Allen, K. D., Golightly, Y. Racial/Ethnic, Socioeconomic, and Geographic Disparities in the Epidemiology of Knee and Hip Osteoarthritis. Rheumatic Disease Clinics of North America. 47 (1), 1-20 (2021).
  4. Wang, K., Dong, X., Lin, J. H. Investigation of Medical Costs of Disease In Patients With Osteoarthritis of the Knee Joint. National Medical Journal of China. 97 (1), 4(2017).
  5. Perlman, A., et al. Efficacy and Safety of Massage for Osteoarthritis of the Knee: a Randomized Clinical Trial. Journal of General Internal Medicine. 34 (3), 379-386 (2019).
  6. Xing, H., et al. Therapeutic massage for knee osteoarthritis: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Journal of Acupuncture and Tuina Science. 19 (5), 354-363 (2021).
  7. Seo, B. R., et al. Skeletal muscle regeneration with robotic actuation-mediated clearance of neutrophils. Science translational medicine. 13 (614), (2021).
  8. Wu, J. H., Zhang, C., Dong, S. J., Yin, H. Effects of Massage with #34;Relaxing Tendons" Technique on the Interleukin-1B and 5-hydroxytryptamine Levels in the Joint Fluid of a Rabbit Knee Osteoarthritis Model. Chinese General Practice. 21 (6), 688-693 (2018).
  9. Luo, R. The effects of IL-1B,IL-6,IL-13,IL-26,TNF-a by patellar manipulations on rabbit knee osteoarthritis model. Guangxi University of Traditional Chinese Medicine. , (2017).
  10. Qiu, F., Li, C., Wu, X., Liu, Y., Zhang, X. Effect of Massage on the Function of Foot-Yangming Meridian-Muscle in Patients with Knee Osteoarthritis. Acta Chinese Medicine. 36 (3), 649-655 (2021).
  11. Yang, B., Li, S. Research Progress of Massage in Improving Biomechanical Indexes of Knee Osteoarthritis. Acta Chinese Medicine. 37 (12), 2571-2576 (2022).
  12. Li, C., Qiu, F., Ding, J., Hu, G., Zhang, X. Curative Observation of Retaining of Heated Needle at Trigger Points Combined with Manipulation for Muscles along Meridians in Treating Knee Osteoarthritis. Journal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. 37 (11), 2157-2162 (2020).
  13. Ding, X., Zhang, X., Hou, Y., Zhao, Z., Ye, X. Effect of massage manipulation on joint stiffness of knee osteoarthritis patients based on "spine-pelvis-knee" holistic diagnosis and treatment pattern. Shanghai Journal of Traditional Chinese Medicine. 55 (08), 54-57 (2021).
  14. Fu, Y., Gong, L., Li, Y. The clinical studies of Rolling combined with Pulling Manipulation on Early and Middle-term. Jilin Journal of Chinese Medicine. 40 (07), 958-962 (2020).
  15. Jiang, J., Hu, X., Tang, R., Qiu, F., Huang, L. Change of lower limb force line in treating knee osteoarthritis with manipulation. Journal of Changchun University of Chinese Medicine. 34 (01), 129-132 (2018).
  16. Liang, Y., et al. Some issues on animal experiments standardization of acupuncture and moxibustion. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research. 25 (09), 2299-2300 (2014).
  17. Guo, Y., Liu, Y., Liu, Q., Chen, Z., Zhao, X. Basic System of Chinese Acupuncture Standard. Chinese Acupuncture & Moxibustion. 31 (6), 549-550 (2011).
  18. YAN, X., Yan, J. Study on the Standardization of Classification of Tuina Manipulation. Acta Chinese Medicine. 32 (5), 875-878 (2017).
  19. Aikebaier, G., Lu, X., Liu, J., Liu, l, Wang, S. Analysis on Manipulation and Acupoint Selection Laws of Massage for Treatment of Knee Osteoarthritis Based on Data Mining Technology. Chinese Journal of Information on Traditional Chinese Medicine. 29 (5), 23-29 (2022).
  20. Gong, L., Wuquan, S., Zhang, H., Chen, Z. Research of Yan Juntao's Academic Experiences of Differential Treatment and Manipulation for Treating of Knee Osteoarthritis. Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology & Orthopedics. 24 (7), 16-19 (2016).
  21. Qian, J., Xing, X., Liang, J. Two Methods to Establish Rat Model of Osteoarthritis of the Knee. Research and Exploration in Laboratory. 33 (11), 23-27 (2014).
  22. Liu, J., et al. Experimental study of a modified Videman method for replicating knee osteoarthritis on rabbit. Rehabilitation Medicine. 30 (03), 212-219 (2020).
  23. Moskowitz, R. W. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 1-2 (2005).
  24. Shen, M., Li, Z., Shen, J. Preliminary Exploration of Experiment Teaching on Experiment Acupuncture Science. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 7 (02), 130-131 (2009).
  25. Jeong, J., et al. Anti-osteoarthritic effects of ChondroT in a rat model of collagenase-induced osteoarthritis. BMC complementary and alternative medicine. 18 (1), 131(2018).
  26. Hulth, A., Lindberg, L., Telhag, H. Experimental osteoarthritis in rabbits. Preliminary report. Acta orthopaedica Scandinavica. 41 (5), 522-530 (1970).
  27. Tawonsawatruk, T., Sriwatananukulkit, O., Himakhun, W., Hemstapat, W. Comparison of pain behaviour and osteoarthritis progression between anterior cruciate ligament transection and osteochondral injury in rat models. Bone & Joint Research. 7 (3), 244-251 (2018).
  28. Zhou, Q., et al. Cartilage matrix changes in contralateral mobile knees in a rabbit model of osteoarthritis induced by immobilization. BMC musculoskeletal disorders. 16, 224(2015).
  29. Zeng, J., et al. Establishment and identification of experimental rabbit model of knee osteoarthritis. Chinese Journal of Clinical Research. 29 (5), 679-682 (2016).
  30. Shang, P., et al. Comparison with two kind osteoarthritis animal models reduced by plaster immobilization in extend excessive position and bend excessive position respectively. Orthopaedic Biomechanics Materials and Clinical Study. (1), 11-14 (2006).
  31. He, Y., et al. Evaluation of the effect of improved cast immobilization method on rabbit knee osteoarthritis model. Chinese Imaging Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 18 (2), 198-219 (2020).
  32. Pengfei, S., et al. Possible mechanism underlying analgesic effect of Tuina in rats may involve piezo mechanosensitive channels within dorsal root ganglia axon. Journal of Traditional Chinese Medicine. 38 (6), 834-841 (2018).
  33. Wang, Y. Mechanisms of Massage Mediating Chondrocyte Apoptosis in Knee Osteoarthritis Through Piezo 1/JAK2 Signaling Pathway. Shandong University of Traditional Chinese Medicine. , (2019).
  34. Liu, J. Effect of Massage on TLR4/MyD88 Signal Transduction Pathway in Rat Knee Osteoarthritis Model. Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine. , (2019).
  35. Yu, S., Zhou, J., Pang, X. Advances in induced animal models of knee osteoarthritis. Journal of Guangxi University of Chinese Medicine. 25 (5), 50-55 (2022).
  36. Tan, Q., et al. Acupuncture combined with moxibustion regulates the expression of circadian clock protein in the synovium of rats with osteoarthritis. Chinese Journal of Tissue Engineering Research. 26 (11), 1714-1719 (2022).
  37. Zhang, Z., et al. A Review of Massage Therapy for Knee Osteoarthritis. Henan Traditional Chinese Medicine. 39 (1), 146-149 (2019).
  38. Gong, L., Sun, W., Zhang, H., Chen, Z. Research of Yan Juntao's Academic Experiences of Differential Treatment and Manipulation for Treating of Knee Osteoarthritis. Chinese Journal of Traditional Medical Traumatology & Orthopedics. 24 (7), 16-19 (2016).
  39. Chen, C., Zhang, H. Research on the rules of acupoint selection for the treatment of knee osteoarthritis with massage based on data mining. Hainan Medical Journal. 29 (18), 2617-2619 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Synoviale ontstekingpijngedragstestpositionering van acupunctuurpuntenchondrocytapoptosemechanische signaaltransductiedrukknedingsmethodeimmobilisatie van ratten
Tuina-manipulatie om ontsteking en kraakbeenverlies bij knieartroseratten te verminderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.