Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Afbakening van het metabole fenotype van biopsie-afgeleide niercellen

641 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65457

⸱

17 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Soham and Shaila Ajmera Family Transplant Centre, University Health Network, 2Division of Nephrology, The Hospital for Sick Children, 3Division of General Surgery, University Health Network, 4Institute of Medical Science, University of Toronto, 5Program in Cell Biology, The Hospital for Sick Children Research Institute, 6Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 7Division of Nephrology, Tallaght University Hospital, 8Trinity Kidney Centre, Trinity College Dublin, 9Department of Immunology, University of Toronto, 10Division of Nephrology, McMaster University and St. Joseph's Healthcare, 11Division of Nephrology, Department of Medicine, University Health Network, 12Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een unieke methode om metabole profilering van biopsie-afgeleide niercellen uit te voeren. De gepresenteerde aanpak is geoptimaliseerd bij gezonde volwassen mannelijke varkens en heeft het potentieel om de real-time beoordeling van de levensvatbaarheid van niertransplantaten te verbeteren. Deze methode kan ook helpen bij het ontdekken van nieuwe biologie over meerdere op metabolisme gebaseerde nierziekten.

Samenvatting

Niertransplantatie is de optimale behandeling voor nierziekte in het eindstadium; Getransplanteerde nieren gaan echter vaak voortijdig verloren, met tot 50% transplantaatverlies 10 jaar na de transplantatie. Een van de belangrijkste oorzaken van voortijdig verlies van het transplantaat is de verwonding die het transplantaat oploopt op het moment van transplantatie, bekend als ischemie-reperfusieschade (IRI). Vertraagde transplantaatfunctie (DGF), gedefinieerd als de noodzaak van dialyse in de eerste week na transplantatie, is een manifestatie van ernstige IRI die functionele en histologische kenmerken van acuut nierletsel (AKI) vertoont. Hoewel de mechanismen die AKI aansturen onduidelijk blijven, suggereert toenemend bewijs dat een veranderde metabole functie in het allotransplantaat AKI medieert en de reden kan zijn voor DGF. Het ontcijferen en monitoren van de metabole onderbouwing van IRI zal dus ons vermogen om AKI te diagnosticeren en te voorkomen verbeteren. Dit artikel beschrijft een unieke methode om mitochondriale ademhaling (door middel van zuurstofverbruik), glycolyse (extracellulaire verzuringssnelheid) en intracellulaire ATP-niveaus in niercelsuspensies afkomstig van naaldbiopsie te beoordelen. De methodologie is geoptimaliseerd in gezonde volwassen mannelijke varkens en gevalideerd in een varkensmodel van autotransplantatie. De gepresenteerde aanpak heeft het potentieel om de real-time beoordeling van de levensvatbaarheid van niertransplantaten in de kliniek te verbeteren. Het profileren van het metabolisme in van de patiënt afgeleide biopsieën kan ook nieuwe biologie aan het licht brengen in andere op metabolisme gebaseerde nierziekten.

Inleiding

Niertransplantatie is de optimale behandeling voor nierziekte in het eindstadium 1,2,3,4; Getransplanteerde nieren gaan echter vaak voortijdig verloren, met tot 50% transplantaatverlies 10 jaar na transplantatie5. Getroffen patiënten hebben een verhoogde morbiditeit en mortaliteit en vormen een grote economische last voor de gezondheidszorgstelsels6. Een belangrijke oorzaak van voortijdig verlies van het transplantaat is het letsel dat het transplantaat oploopt op het moment van transplantatie, bekend als ischemie-reperfusieschade (IRI). IRI is een onvermijdelijke verwonding die wordt veroorzaakt door een verminderde bloedstroom, gevolgd door reperfusie7. Ischemie wordt gekenmerkt door accumulatie van weefselsuccinaat, die de omgekeerde elektronenstroom in de mitochondriale ademhalingsketen aandrijft, wat leidt tot de productie van superoxide en daaropvolgend letsel vroeg na reperfusie8. IRI in getransplanteerde organen verhoogt het risico op primaire niet-functie, vertraagde transplantaatfunctie (DGF), afstoting en inferieure transplantaatresultaten 8,9. DGF, gedefinieerd als de noodzaak van dialyse in de eerste week na transplantatie9, is een manifestatie van ernstige IRI10. Histologisch manifesteert IRI-geassocieerde DGF zich als acute tubulaire necrose (ATN) en beschadiging van de microvasculatuur. Functioneel is er een afname van de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) en urineproductie, kenmerken van acuut nierletsel (AKI) in het allotransplantaat11. Ondanks het belang ervan zijn er momenteel geen behandelingen voor ischemie-reperfusie-geassocieerde AKI na transplantatie. Het gebrek aan behandelingen komt voort uit een onvolledig begrip van ziektemechanismen en een gebrek aan markers om patiënten met het hoogste risico op transplantaatdisfunctie te identificeren tijdens de kritieke tijdstippen waarop letsel omkeerbaar kan zijn12.

Toenemend bewijs suggereert dat een veranderd energiemetabolisme in het allotransplantaat AKI medieert en ten grondslag kan liggen aan DGF 13,14,15. Niercellen genereren energie via twee belangrijke mechanismen: mitochondriale ademhaling en glycolyse16. Bij IRI leidt reperfusie tot mitochondriale disfunctie17. Bijgevolg wordt glycolyse de belangrijkste energiebron 13,18,19,20. De metabole verschuiving in IRI bevordert tubulaire en microvasculaire endotheelceldood, wat leidt tot AKI 21,22,23,24. In een eerder werk werd ATN geassocieerd met verhoogde expressie van glycolytische enzymen en veranderde niveaus van mitochondriale eiwitten25, in overeenstemming met IRI in het transplantaat13,18. Bovendien leidde ischemie gevolgd door koude opslag in een autotransplantatiemodel van de varkensnier tot verlaagde niveaus van mitochondriale eiwitten in de nieren en een verhoogde lactaatuitscheiding26. Al met al versterken deze bevindingen het klinische belang van het monitoren van het metabole fenotype van niertransplantaten, zelfs vóór transplantatie, aangezien basale metabole kenmerken in het transplantaat voorspellend kunnen zijn voor allograftdisfunctie27.

Er zijn klinische voorspellingsmodellen ontwikkeld voor het kortetermijnrisico op afstoting en verlies van het transplantaat: 28,29. Deze modellen missen echter precisie en houden geen rekening met de moleculaire kenmerken van het transplantaat 30,31,32. Recente studies waren gericht op het aanpakken van deze onvervulde behoefte door de identificatie van moleculaire patronen op weefselniveau die geassocieerd zijn met inferieure transplantaatresultaten, zoals disfunctie en afstoting van transplantaten 13,14,15,25,33,34. Deze studies zijn gebaseerd op steady-state moleculaire metingen op het gen 33,34,35, eiwit25,26 en metabolietniveau13,14, waardoor een onvolledig beeld ontstaat van het metabole fenotype van het allotransplantaat. Deze lacune in de kennis is deels te wijten aan het onvermogen om de metabolische functie en de energietoestand van van niermonsters op een bepaald moment te meten. De ontwikkeling van een gestandaardiseerd protocol om het metabole fenotype van biopsie-afgeleide niercellen te bepalen, dat mogelijk kan worden vertaald in de studie van patiëntenmonsters, is gerechtvaardigd. Dit artikel beschrijft een unieke workflow voor het beoordelen van mitochondriale ademhaling (door middel van zuurstofverbruik), glycolyse (extracellulaire verzuringssnelheid) en intracellulaire ATP-niveaus in van biopsie afgeleide niercelsuspensies. De methodologie is geoptimaliseerd met behulp van nierbiopsiekernen van gezonde volwassen mannelijke varkens. Om toekomstige klinische implementatie te vergemakkelijken, werden de biopsiekernen verkregen met behulp van een naald van 18 G, zoals in de standaard klinische protocollen voor het bemonsteren van niertransplantaten36,37. Ten slotte was het nut van de protocolimplementatie in discriminerende experimentele omstandigheden gevalideerd in een varkensmodel van autotransplantatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door het Animal Care Committee van het Toronto General Research Institute (Animal Use Protocol nummer: 3652). Dieren werden verzorgd in overeenstemming met de National Society of Medical Research and Guide for the care of laboratory animals, National Institute of Health (NIH), Ontario, Canada. In dit onderzoek werden vijf mannelijke Yorkshire-varkens van 3 maanden oud, met een gewicht van ongeveer 30 kg per stuk, gebruikt. Het protocol voor deze methodologie is onderverdeeld in de volgende stappen: (1) Dissociatie van enkele nierbiopsiekernen in celsuspensies; (2) Metabole profilering van van biopsie afgeleide niercellen; en (3) Meting van het ATP-gehalte in van biopsie afgeleide niercellen. Alle biopsiemonsters die werden verzameld voor metingen van de metabole functie of ATP-inhoud, werden binnen 3 uur na het ophalen gedissocieerd in een bioveiligheidskast. De workflow van de methodologie is weergegeven in figuur 1. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Dissociatie van enkele nierbiopsiekernen in celsuspensies

  1. Verzamel drie biopsiekernen van weefsel uit de nierschors met behulp van het pistoolsysteem38 van de coaxiale naald (d.w.z. een buitenste geleidingsnaald en een binnenste biopsienaald). Voor klinische vertaling wordt het gebruik van een 18 G biopsienaaldpistool aanbevolen39.
    OPMERKING: Wees consistent met de hoek van het biopsienaaldpistool (~45 °C) en de diepte van de punctie (~20 mm) bij het uitvoeren van biopsieën van de niercortex.
  2. Plaats elke biopsiekern voorzichtig in een buisje van 15 ml met 2 ml RPMI 1640 op ijs.
    1. Fragmenteer biopsieweefsel in kleine stukjes (≤2 mm lang) met behulp van een scalpel op een petrischaaltje van 6 cm dat op ijs is geplaatst. Gebruik een ultradun gebogen pincet met fijne punt om de weefselfragmenten van elke biopsie in een ander buisje van 1,5 ml met 1 ml dissociatiemedia te plaatsen.
      OPMERKING: Het dissociatiemedium bestaat uit RPMI 1640-medium dat 0,1 mg/ml DNase I, 10 mg/ml collagenase en 2990 eenheden/ml neutraal protease van Bacillus polymyxa bevat. Het is bewezen dat dissociatie van menselijke nierbiopten met behulp van deze mediasamenstelling de levensvatbaarheid van cellen maximaliseert en de representatie van zeldzame en fragiele celpopulaties behoudt40.
  3. Laat de dissociatie 30 minuten plaatsvinden bij 37 °C (verwarmingsblok) met intermitterend roeren (het wordt aanbevolen om de buizen elke 5 minuten te vortexen).
  4. Filtreer de celsuspensies na dissociatie door de klikbuisjes van de 35 μm celzeef.
  5. Spoel de zeef af met 1:1 volume 100% foetaal runderserum (FBS).
  6. Bundel de drie van biopsie afgeleide niercelsuspensies in één buisje van 15 ml.
  7. Pellet de cellen door centrifugatie (400 x g, 5 min, 4 °C) en suspendeer ze opnieuw in 1 ml RPMI 1640 met 10% FBS. Deze celsuspensie levert normaal gesproken 0,8-1,2 × 106 cellen op.

2. Metabole profilering van biopsie-afgeleide niercellen

OPMERKING: De metabole profileringsstap integreert de meting van glycolyse (ECAR) en zuurstofverbruik (OCR) in een metabole functieanalysator, evenals de intracellulaire ATP-niveaus met behulp van een commerciële kit.

  1. Hydratatie en kalibratie van de cartridge op de gebruiksplaat
    1. Voeg een dag voordat het monster wordt genomen 200 μL ddH2O toe aan elk putje van de patroonplaat van de metabolische functieanalysator.
    2. Incubeer de patroonplaat een nacht in een CO2-vrije broedstoof bij 37 °C.
    3. Verwijder op de dag van het monster de ddH2O door aspiratie met behulp van een pasteurpipet die is aangesloten op een vacuümsysteem en voeg 200 μL kalibrantoplossing (pH =7.4) toe aan elk putje van de patroonplaat.
    4. Incubeer de patroonplaat een nacht in een CO2-vrije broedmachine bij 37 °C.
  2. Celplating en bereiding van analysemedia en stressorverbindingen voor metingen van de metabolische functie
    1. Voeg 100 μL RPMI met 10% FBS toe aan elk putje van een testplaat met 96 putjes voor de metabolische functie.
    2. Scheid een klein aliquoot (bv. 10 μl) van de celsuspensie (verkregen in stap 1) af in een ander buisje en kleur de cellen met een trypanblauwe kleurstof voor de levensvatbaarheid van de uitsluiting.
    3. Bepaal met behulp van een telkamer de concentratie van levende cellen (trypanblauw negatief)41 in de oorspronkelijke suspensie.
    4. Zaai de cellen in elk van de onderzoeksputjes van de metabolische functietestplaat, met een dichtheid van 1,0 x 105 levende cellen/putje. Dit celnummer is bepaald na optimalisatie (zie sectie Representatieve resultaten).
      OPMERKING: Zaai geen cellen in een van de vier hoeken van de testplaat voor de metabolische functie, aangezien deze als blanco's worden gebruikt.
    5. Laat de cellen zich hechten door de metabolische functietestplaat een nacht (~16 uur) in een 37 °C, 5% CO2 incubator te incuberen.
    6. Bevestig de volgende dag onder de microscoop dat de cellen een minimale samenvloeiing van 70%-80% hebben (een gezonde celmonolaag is belangrijk voor een optimale bepaling van metabolische functieparameters).
    7. Ontdooi een hoeveelheid (40-50 ml) fenolroodvrije basale media bij 37 °C gedurende ten minste 15 minuten.
    8. Bereid 35 ml analysemedia voor door 2 mM glutamine (350 μL), 1 mM pyruvaat (350 μL) en 5,55 mM glucose (385 μL) toe te voegen aan 33,915 ml voorontdooide basale media.
    9. Verwijder met behulp van een enkel- of meerkanaalspipet voorzichtig de RPMI-media uit elk onderzoeksputje van de metabolische functietestplaat. Voeg vervolgens 100 μL basale media toe om de cellen te wassen.
    10. Verwijder de basale media voorzichtig en voeg 150 μL analysemedia toe aan elk putje, inclusief de putjes zonder cellen.
      OPMERKING: Het achterlaten van putjes zonder analysemedia kan de vochtigheidsomstandigheden in de plaatomgeving beïnvloeden en leiden tot inconsistente metingen van de metabolische functie (aanvullende figuur 1).
    11. Plaats de metabolische functietestplaat in een CO2-vrije incubator bij 37 °C gedurende ~1 uur (acclimatiseringsstap). Breng de patroonplaat (eerder geïncubeerd in calibrantoplossing) terug naar de bioveiligheidskast.
    12. Bereid tijdens de acclimatisatie de volgende vier oplossingen van stressorverbindingen, in testmedia: 7 μM oligomycine (7x, voor een eindconcentratie 1 μM oligomycine); 2,4 μM Carbonylcyanide-4 (trifluormethoxy) fenylhydrazon (FCCP) (8x, voor een eindconcentratie 0,3 μM FCCP); 450 mM 2-deoxyglucose (2-DG) (9x, voor een eindconcentratie 50 mM 2-DG); 10 μM Rotenon en 10 μM Antimycine A (Rot + AA) (10x, voor een eindconcentratie 1 μM Rot + 1 μM AA).
      OPMERKING: Oligomycine remt de activiteit van ATP-synthase en onderbreekt daardoor de elektronentransportketen (ETC). Dit verlaagt OCR en de ATP-synthase-gedreven instroom van protonen in de mitochondriën. Als gevolg hiervan wordt glycolyse de belangrijkste bron van ATP-productie42. FCCP is een cyanidegeneesmiddel (negatieve lading) dat fungeert als een ontkoppelaar van oxidatieve fosforylering, door protonen (positieve lading) aan te trekken en een continue protoninstroom in de mitochondriën te induceren, waardoor zuurstofverbruik door het ETC mogelijk is, onafhankelijk van ATP-synthase-activiteit43. 2-DG is een synthetisch structureel analoog van glucose waarin de 2-hydroxylgroep is vervangen door waterstof en fungeert als een competitieve remmer van glycolyse44. Rot en AA zijn remmers van de complexen I en III van de elektronentransportketen, respectievelijk45. De effecten van het injecteren van elk geneesmiddel in verschillende stappen van de metabole functietest worden weergegeven in aanvullende figuur 2.
    13. Laad 25 μl van elk medicijn in de overeenkomstige poort bovenop elk putje van de patroonplaat, inclusief de putjes zonder cellen. Laad de medicijnen volgens de volgende volgorde: 7x oligomycine (poort A), 8x FCCP (poort B), 9x 2-DG (poort C), 10x Rot + AA (poort D).
    14. Incubeer de patroonplaat in de CO2-vrije incubator totdat deze nodig is om de metabolische functietest in te stellen.
  3. Bepaling van zuurstofverbruik en glycolytische snelheden in biopsie-afgeleide niercellen
    1. Controleer of de metabolische functie-analysator is ingeschakeld en is aangesloten op de controllersoftware in een accessoirecomputer.
    2. Start de software.
    3. Klik op de knop Sjabloon > Leeg.
    4. Klik in het eerste tabblad op de knop Injectiestrategie. Klik op elke knop met de letters A, B, C of D die overeenkomen met de vier injectiepoorten. Noteer de naam van het medicijn dat via elke poort zal worden geïnjecteerd: oligomycine (poort A), FCCP (poort B), 2-DG (poort C), Rot + AA (poort D).
    5. Definieer op het tweede tabblad alle experimentele omstandigheden. Klik op de knop Voorwaarde toevoegen om een nieuwe voorwaarde in te voeren. De software wijst automatisch een kleur toe aan elke voorwaarde. Klik op de knop Plaatkaart en wijs aan elke put de bijbehorende experimentele toestand toe, die dienovereenkomstig wordt gekleurd.
      OPMERKING: De vier hoekputten moeten als leeg (zwarte kleur) toegewezen blijven, omdat deze worden gebruikt om het achtergrondsignaal af te trekken.
    6. Klik in het derde tabblad vier keer op de knop Injectie, zodat de vier injecties (poorten A, B, C en D) aan de reeks worden toegevoegd. De test kan worden uitgevoerd met behulp van de standaard injectievolgorde (A, B, C, D), het aantal metingen (3 basale metingen + 3 metingen na elke injectie) en de tijd tussen de metingen (3 min).
    7. Vul in het vierde tabblad de vakjes in met de essentiële studie-informatie en klik op Uitvoeren. De lade gaat open en de software vraagt de gebruiker om de patroonplaat te monteren. Zorg ervoor dat u het groene deksel verwijdert voordat u het bord op de lade plaatst.
    8. Na kalibratie (~15 min) gaat de lade weer open en vraagt de software de gebruiker om de gebruiksplaat van de cartridge te verwijderen en de analyseplaat met metabolische functie op de lade te plaatsen. Verwijder opnieuw het deksel van de plaat voordat u de plaat op de lade monteert. De gebruiksplaat van de cartridge kan worden weggegooid.
    9. De test is na ongeveer 2 uur klaar. Sla na die tijd het bijbehorende '.asyr'-bestand op. Analyseer de .asyr-bestanden computationeel om de ECAR- en OCR-curven te onderzoeken. Exporteer gegevens naar het gewenste formaat.
  4. Meting van DNA-inhoud voor normalisatie van metabolische functiegegevens
    1. Bepaal de hoeveelheid DNA in de cellen in elk putje na de metabolische functietest met behulp van de gespecificeerde celproliferatietestkit (zie materiaaltabel).
    2. Bereid het vereiste volume van 1x cel-lysebuffer voor door 20x cellysebuffer te verdunnen in gedeïoniseerd water.
    3. Om een standaardcurve voor te bereiden, bereidt u 100 μL-monsters van bacteriofaag λ DNA-standaard (opgenomen in de celproliferatietestkit) serieel verdund in cellysebuffer tot concentraties in het bereik van 0 ng/ml, 12,5 ng/ml, 25 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 400 ng/ml, 800 ng/ml. Laad elke verdunning in een ander putje van een zwarte microplaat met 96 putjes.
    4. Bereid 1x kleurstofbindoplossing voor door 400x kleurstofreagens te verdunnen in 1x cellysebuffer. Voor elke standaardcurve goed en goed onderzoek naar de metabole functietest is 100 μL vereist.
    5. Verdeel 100μL 1x verfoplossing in de eerste kolom, die al de standaarden bevat. OPMERKING: Het proces tot nu toe kan 30 minuten voor het einde van de metabolische functietest worden gestart.
    6. Verwijder de analysemedia van de analyseplaat voor de metabolische functie met behulp van een enkelvoudige of meerkanaals pipet.
    7. Voeg met een meerkanaalspipet 100 μL 1x kleurstofbindoplossing toe aan elk onderzoeksputje van de metabolische functietestplaat. Pipetteer een paar keer op en neer om de cellen te lyseren en breng de inhoud over naar de zwarte plaat.
    8. Bescherm de microtiterplaat tegen het licht en incubeer 2-5 minuten bij 37 °C.
    9. Meet de fluorescentie-intensiteit van elk monster met behulp van een fluorescentiemicroplaatlezer met excitatie bij 480 nm en emissiedetectie bij 520 nm.

3. Meting van het ATP-gehalte in van biopsie afgeleide niercellen

OPMERKING: Meet de hoeveelheid ATP in van biopsie afgeleide niercellen met behulp van de gespecificeerde ATP-detectiereagens en recombinante ATP (rATP)-standaard (zie materiaaltabel).

  1. Indien bevroren, ontdooi het ATP-detectiereagens dan een nacht bij 4 °C.
  2. Na verwerving van van biopsie afgeleide celsuspensies en celtelling, plaat 1,0 x 104 levende cellen/putje in elk putje van een witte microplaat met 96 putjes die 100 μL RPMI 1640-media bevat met 10% FBS. Laat de eerste kolom van de microplaat leeg, want deze zal de volgende dag worden gebruikt om een rATP-standaardcurve te laden.
  3. Incubeer de microtiterplaat een nacht bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator.
  4. Verwarm het ATP-detectiereagens de volgende dag voor op kamertemperatuur.
  5. Genereer de rATP-standaardcurve. Bereid 100 μL monsters van rATP-standaard serieel verdund in PBS tot de volgende concentraties: 0 nM, 0,001 nM, 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM.
  6. Laad 50 μL van elk rATP-standaardmonster in de eerste kolom van de microplaat.
  7. Verwijder de RPMI 1640-media met 10% FBS uit elk microplaatonderzoek met behulp van een enkel- of meerkanaalspipet.
  8. Was elk onderzoek goed met 100 μL PBS (voorverwarmd in een waterbad van 37°C).
  9. Verwijder de PBS en voeg 50 μL nieuwe PBS toe in elke studieput.
  10. Voeg 50 μL ATP-detectiereagens toe aan zowel de standaard- als de onderzoeksputjes.
  11. Meng, incubeer 2 minuten bij 37 °C en vervolgens 10 minuten bij RT.
  12. Lees en registreer luminescentie in een microplaatlezer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De workflow werd getest in van biopsie afgeleide niercellen van gezonde mannelijke Yorkshire-varkens van 3 maanden oud. Het protocol voor weefseldissociatie en celplating werd gevolgd zoals hierboven beschreven. Nadat de cellen 16 uur hadden laten hechten, werden OCR en ECAR in realtime gemeten in de van biopsie afgeleide varkensniercellen met behulp van een metabole functieanalysator, als markers van respectievelijk mitochondriale ademhaling en glycolyse.

Het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft een unieke methode om de metabole functie van niercellen verkregen uit biopsieën te beoordelen. Een protocol voor het verkrijgen van eencellige suspensies uit verse kernnierbiopten werd gekoppeld aan een analyse van de metabole functie en intracellulaire ATP-niveaus. Glycolyse wordt beoordeeld door ECAR te meten en mitochondriale ademhaling door OCR te meten. Porine nierbiopten werden gebruikt om de methodologie te optimaliseren.

Om de b...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen van de coauteurs heeft concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

AK werd ondersteund door de University Health Network Foundation (prijzen 579067450776, 579072310776 en 579068260776). SC-F werd ondersteund door het Kidney Research Scientist Core Education and National Training (KRESCENT) -programma (2019KPPDF637713 en 24KNIA-1291062).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-Deoxy-D-glucoseSigmaD6134Competitive remmer van glycolyse
5 mL Round Bottom Polystyrene
Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap		Falcon352235Dissociatiebuizen
Antimycin A from Streptomyces sp.SigmaA8674Remmer van complex III van de ademhalingsketen
AOF BP ProteaseVitaCyte003-1000Dissociatie-enzym
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)
phenylhydrazone (FCCP)		SigmaC2920Ontkoppelingsmiddel van oxidatieve fosforylering
CellTiter-Glo 2.0 Assay, 100mLPromegaG9242Meting van intracellulair ATP
Collagenase MAVitaCyte001-2030Dissociatie-enzym
CyQUANT Cell Proliferation Assay, for cells in cultureInvitrogenC7026Meting van intracellulair DNA
D-GLUCOSE, Anhydrous, Reagent GradeBioshopGLU501Metabolisch substraat
DNase IStemcell07469Dissociatie-enzym
Fetal Bovine Serum, Premium,
US Origin, Heat Inactivated, 500 mL		Wisent080-450Dissociatiemedium-supplement
L-Glutamine-200 mM (100x) liquid (100 mL)Gibco25030081Metabolisch substraat
Oligomycin ASigma75351Remmer van de ATP-synthase
PBS, -/-, 500 mLWisent311-010-CLCelwassing
rATP, 10 mM, 0?5 mLPromegaP1132Meting van intracellulair ATP
RotenoneSigmaR8875Remmer van complex I van de ademhalingsketen
RPMI 1640Gibco11875119Dissociatiemedium
Seahorse Wave Controller Software 2.6AgilentN/AInstellen van metingen van metabolische functie
Seahorse Wave Desktop Software 2.6AgilentN/AAnalyse van gegevens over metabolische functie
Seahorse XF base medium,  zonder fenolrood, 500 mLAgilent103335-100Meting van metabolische functie
Seahorse XFe96 FluxPak  (20 platen, 18 cartridges,
en 500mL van kalibratieoplossing)		Agilent102416-100Meting van metabolische functie
Seahorse XFe96 metabolische functie-analyzerAgilent101991-100Meting van metabolische functie
Sodium Pyruvate Solution 100 mM (100X), liquid 100 mLGibco11360070Metabolisch substraat

Referenties

  1. Tonelli, M., Wiebe, N., Knoll, G. Systematic review: Kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 11 (10), 2093-2109 (2011).
  2. Rana, A., Gruessner, A., Agopian, V. G. Survival benefit of solid-organ transplant in the United States. JAMA Surg. 150 (3), 252-259 (2015).
  3. Wolfe, R. A., Ashby, V. B., Milford, E. L. Comparison of mortality in all patients on dialysis, patients on dialysis awaiting transplantation, and recipients of a first cadaveric transplant. N Engl J Med. 341 (23), 1725-1730 (1999).
  4. Chadban, S. J., Ahn, C., Axelrod, D. A. Summary of the Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) clinical practice guideline on the evaluation and management of candidates for kidney transplantation. Transplantation. 104 (4), 708-714 (2020).
  5. Hariharan, S., Israni, A. K., Danovitch, G. Long-term survival after kidney transplantation. N Engl J Med. 385 (8), 729-743 (2021).
  6. Loupy, A., Hill, G. S., Jordan, S. C. The impact of donor-specific anti-HLA antibodies on late kidney allograft failure. Nat Rev Nephrol. 8 (6), 348-357 (2012).
  7. Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion-from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
  8. Chouchani, E. T., Pell, V. R., Gaude, E. Ischaemic accumulation of succinate controls reperfusion injury through mitochondrial ROS. Nature. 515 (7527), 431(2014).
  9. Mallon, D. H., Summers, D. M., Bradley, J. A. Defining delayed graft function after renal transplantation: Simplest is best. Transplantation. 96 (10), 885-889 (2013).
  10. Schröppel, B., Legendre, C. Delayed kidney graft function: From mechanism to translation. Kidney Int. 86 (2), 251-258 (2014).
  11. Basile, D. P., Anderson, M. D., Sutton, T. A. Pathophysiology of acute kidney injury. Compr Physiol. 2 (2), 1303(2012).
  12. Siew, E. D., Ware, L. B., Ikizler, T. A. Biological markers of acute kidney injury. J Am Soc Nephrol. 22 (5), 810-820 (2011).
  13. Legouis, D., Ricksten, S. E., Faivre, A. Altered proximal tubular cell glucose metabolism during acute kidney injury is associated with mortality. Nat Metab. 2 (8), 732-743 (2020).
  14. Lerink, L. J. S., de Kok, M. J. C., Mulvey, J. F. Preclinical models versus clinical renal ischemia reperfusion injury: A systematic review based on metabolic signatures. Am J Transplant. 22 (2), 344-370 (2021).
  15. Lindeman, J. H., et al. Results of an explorative clinical evaluation suggest immediate and persistent post-reperfusion metabolic paralysis drives kidney ischemia reperfusion injury. Kidney Int. 98 (6), 1476-1488 (2020).
  16. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nat Rev Nephrol. 13 (10), 629(2017).
  17. Ma, H., Guo, X., Cui, S. Dephosphorylation of AMP-activated protein kinase exacerbates ischemia/reperfusion-induced acute kidney injury via mitochondrial dysfunction. Kidney Int. 101 (2), 315-330 (2022).
  18. Huang, H., et al. Proteo-metabolomics reveals compensation between ischemic and non-injured contralateral kidneys after reperfusion. Sci Rep. 8, 8539(2018).
  19. Lan, R., Geng, H., Singha, P. K. Mitochondrial pathology and glycolytic shift during proximal tubule atrophy after ischemic AKI. J Am Soc Nephrol. 27 (11), 3356-3367 (2016).
  20. Li, X., Sun, X., Carmeliet, P. Hallmarks of endothelial cell metabolism in health and disease. Cell Metab. 30 (3), 414-433 (2019).
  21. Kim, J., Devalaraja-Narashimha, K., Padanilam, B. J. TIGAR regulates glycolysis in ischemic kidney proximal tubules. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (4), F298-F308 (2015).
  22. Kosieradzki, M., Rowiński, W. Ischemia/reperfusion injury in kidney transplantation: Mechanisms and prevention. Transplant Proc. 40 (10), 3279-3288 (2008).
  23. Leung, S. W. S., Shi, Y. The glycolytic process in endothelial cells and its implications. Acta Pharmacol Sin. 43, 251-259 (2021).
  24. Wong, B. W., Marsch, E., Treps, L. Endothelial cell metabolism in health and disease: Impact of hypoxia. EMBO J. 36 (15), 2187-2203 (2017).
  25. Clotet-Freixas, S., McEvoy, C. M., Batruch, I. Extracellular matrix injury of kidney allografts in antibody-mediated rejection: A proteomics study. J Am Soc Nephrol. 31 (11), 2705-2724 (2020).
  26. McEvoy, C. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion in a porcine auto-transplantation model preserves the expression of key mitochondrial proteins: An unbiased proteomics analysis. Mol Cell Proteomics. 20 (1), 100101(2021).
  27. Faitot, F., Besch, C., Battini, S. Impact of real-time metabolomics in liver transplantation: Graft evaluation and donor-recipient matching. J Hepatol. 68 (4), 699-706 (2018).
  28. Rehse, G., Halleck, F., Khadzhynov, D. Validation of the living kidney donor profile index in a European cohort and comparison of long-term outcomes with US results. Nephrol Dial Transplant. 34 (6), 1063-1070 (2019).
  29. Zens, T. J., Danobeitia, J. S., Leverson, G. The impact of kidney donor profile index on delayed graft function and transplant outcome: Gordons-a single-center analysis. Clin Transplant. 32 (3), e13190(2018).
  30. Parker, W. F., Thistlethwaite, J. R., Ross, L. F. Kidney donor profile index does not accurately predict the graft survival of pediatric deceased donor kidneys. Transplantation. 100 (11), 2471-2478 (2016).
  31. Schold, J. D., Kaplan, B. Living kidney donor profile index: Utility and limitations. Am J Transplant. 16 (7), 1951-1952 (2016).
  32. Shantier, M., Li, Y., Ashwin, M. Use of the living kidney donor profile index in the Canadian kidney transplant recipient population: A validation study. Can J Kidney Health Dis. 7, e906976(2020).
  33. Venner, J. M., Hidalgo, L. G., Famulski, K. S. The molecular landscape of antibody-mediated kidney transplant rejection: Evidence for NK involvement through CD16a Fc receptors. Am J Transplant. 15 (5), 1336-1348 (2015).
  34. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: An international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  35. Urbanellis, P., McEvoy, C. M., Škrtić, M. Transcriptome analysis of kidney grafts subjected to normothermic ex vivo perfusion demonstrates an enrichment of mitochondrial metabolism genes. Transplant Direct. 7 (8), e1157(2021).
  36. Ahmad, I. Biopsy of the transplanted kidney. Semin Intervent Radiol. 21 (4), 275-281 (2004).
  37. Schwarz, A., Gwinner, W., Hiss, M. Safety and adequacy of renal transplant protocol biopsies. Am J Transplant. 5 (8), 1992-1996 (2005).
  38. Patra, A., Keshava, S. N. Biopsy with side-cutting coaxial needle-knowing the "cutting length" and "throw length.". Indian J Radiol Imaging. 31 (4), 933(2022).
  39. Macginley, R., See, E. J. Renal biopsy. Evidence-Based Nephrology. 1, 2nd ed, 205-213 (2025).
  40. McEvoy, C. M., Murphy, J. M., Zhang, L. Single-cell profiling of healthy human kidney reveals features of sex-based transcriptional programs and tissue-specific immunity. Nat Commun. 13 (1), 35297(2022).
  41. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  42. Devenish, R. J., Prescott, M., Boyle, G. M. The oligomycin axis of mitochondrial ATP synthase: OSCP and the proton channel. J Bioenerg Biomembr. 32 (5), 507-515 (2000).
  43. To, M. S., Aromataris, E. C., Castro, J. Mitochondrial uncoupler FCCP activates proton conductance but does not block store-operated Ca(2+) current in liver cells. Arch Biochem Biophys. 495 (2), 152-158 (2010).
  44. Pajak, B., Siwiak, E., Sołtyka, M. 2-deoxy-d-glucose and its analogs: From diagnostic to therapeutic agents. Int J Mol Sci. 21 (1), 234(2019).
  45. Forkink, M., Basit, F., Teixeira, J. Complex I and complex III inhibition specifically increase cytosolic hydrogen peroxide levels without inducing oxidative stress in HEK293 cells. Redox Biol. 6, 607-618 (2015).
  46. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. J Vis Exp. (8), e2850(2018).
  47. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1493 (2012).
  48. Kaushik, N., Lee, S. J., Choi, T. G. Non-thermal plasma with 2-deoxy-D-glucose synergistically induces cell death by targeting glycolysis in blood cancer cells. Sci Rep. 5 (1), 8726(2015).
  49. Ruas, J. S., Siqueira-Santos, E. S., Amigo, I. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), e150967(2016).
  50. Hao, W., Chang, C. P. B., Tsao, C. C. Oligomycin-induced bioenergetic adaptation in cancer cells with heterogeneous bioenergetic organization. J Biol Chem. 285 (17), 12647-12654 (2010).
  51. Kawamura, M., Parmentier, C., Ray, S. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15 (1), 52140-52154 (2024).
  52. Galichon, P., Lannoy, M., Li, L. Energy depletion by cell proliferation sensitizes the kidney epithelial cells to injury. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (3), F326-F337 (2024).
  53. Hamed, M., Logan, A., Gruszczyk, A. V. Mitochondria-targeted antioxidant MitoQ ameliorates ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation models. Br J Surg. 108 (9), 1072-1081 (2021).
  54. Dubin, R. F., Rhee, E. P. Proteomics and metabolomics in kidney disease, including insights into etiology, treatment, and prevention. Clin J Am Soc Nephrol. 15 (3), 404-411 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Niertransplantatieischemie-reperfusieschadevertraagde graftfunctieacuut nierfalenmitochondriale respiratiezuurstofconsumptiesnelheidglycolysebeoordelingintracellulaire ATP-niveaus

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.