Detectie van rabiës IgG- en IgM-antilichamen met behulp van de Rabiës Indirect Fluorescerende Antilichaamtest

Samenvatting

Het doel van dit manuscript is om het gebruik van de rabiës indirecte fluorescerende antilichaamtest voor de detectie van rabiës-specifieke IgG- en IgM-antilichamen te onderzoeken.

Samenvatting

De rabiës indirecte fluorescerende antilichaam (IFA) test is ontwikkeld om verschillende rabiës-specifieke antilichaamisotypes in sera of cerebrale spinale vloeistof te detecteren. Deze test levert snelle resultaten op en kan worden gebruikt om antilichamen tegen hondsdolheid in verschillende scenario's te detecteren. De rabiës IFA-test is vooral nuttig voor de snelle en vroege detectie van antilichamen om de immuunrespons te evalueren bij een patiënt die hondsdolheid heeft ontwikkeld. Hoewel andere methoden voor antemortem rabiësdiagnose voorrang hebben, kan deze test worden gebruikt om recente blootstelling aan het rabiësvirus aan te tonen door middel van antilichaamdetectie. De IFA-test geeft geen virusneutraliserende antilichaamtiter (VNA), maar de pre-exposure profylaxerespons (PrEP) kan worden geëvalueerd aan de hand van positieve of negatieve aanwezigheid van antilichamen. Deze test kan in verschillende situaties worden gebruikt en kan resultaten opleveren voor een aantal verschillende doelen. In deze studie gebruikten we verschillende gepaarde serummonsters van personen die PrEP kregen en toonden we hun aanwezigheid van rabiësantilichamen in de loop van de tijd aan met behulp van de IFA-test.

Inleiding

De rabiës indirecte fluorescerende antilichaam (IFA) test wordt gebruikt om verschillende rabiës-specifieke antilichaamisotypes in sera of cerebrale spinale vloeistof te detecteren. Het is een van een arsenaal aan tests die beschikbaar zijn voor het monitoren van een antemortem rabiëspatiënt. Het is vooral nuttig voor de vroege detectie van antilichamen om de immuunrespons van een patiënt op rabiësinfectie te evalueren. Bij gebruik in combinatie met andere tests, casusgeschiedenis en de vaccinatiestatus van de patiënt, kan de IFA-test helpen bij het bepalen van de blootstelling aan het rabiësvirus of een vaccin¹. Aangezien de IFA-test IgM en/of IgG meet, kunnen de waarden van het specifieke antilichaam een geschat tijdsbestek aangeven vanaf blootstelling aan het antigeen¹. Deze test kan nuttig zijn in de vermelde toepassingen of andere die nog niet zijn onderzocht.

Er zijn verschillende serologische tests voor hondsdolheid beschikbaar. De snelle fluorescerende focusremmingstest (RFFIT), fluorescerende antilichaamvirusneutralisatietest (FAVN) of modificaties hiervan zijn de primaire methoden voor het meten van rabiësvirusneutraliserende antilichamen (RVNA's)¹. Deze tests maken echter geen onderscheid tussen IgM- en IgG-antilichamen. Wanneer het differentiëren van het antilichaamisotype belangrijk is bij het bewaken van de rabiës-immuunrespons, worden de rabiës-IFA- en de rabiës-enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) -tests gebruikt, maar ze meten geen RVNA's. Hoewel de IFA- en ELISA-tests kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van rabiësspecifieke antilichamen in een monster te bepalen, zijn er enkele verschillen in de manier waarop ze worden uitgevoerd. De IFA-test maakt gebruik van een in cellen gekweekt levend virus als antigeensubstraat, terwijl een typische ELISA voor de detectie van hondsdolheid een of meer van de virale eiwitten gebruikt. In een laboratoriumomgeving waar het rabiësvirus kan worden gekweekt, kan de IFA-test gemakkelijker worden uitgevoerd in plaats van individuele virale eiwitten voor de ELISA te kopen of te kweken. Bij het bepalen van de keuze van de serologische rabiëstest moet rekening worden gehouden met het doel van de tests en de informatie die is verkregen uit de resultaten van een serologische rabiëstest².

IgM is de eerste die reageert, toenemend totdat rond dag 28 klassewisseling wordt waargenomen, waarna IgG het overheersende circulerende antilichaam³ wordt. Daarom zou IgM slechts gedurende een beperkte tijd worden verwacht na blootstelling aan het rabiësvirus of vaccinatie. Het testen van zowel serum als hersenvocht (CSF) kan aangeven of de blootstelling plaatsvond door vaccinatie, waarbij antilichamen alleen in sera zouden worden gezien, of door een virale infectie, die mogelijk antilichamen in CSF¹ zou vertonen.

Er is vastgesteld dat rabiësantilichamen enkele jaren aanhouden na pre-expositieprofylaxe (PrEP)⁴. De IFA-test kan een handig hulpmiddel zijn om dit op verschillende tijdstippen na vaccinatie of blootstelling aan te tonen.

Protocol

Het volgende protocol is goedgekeurd voor het ethische gebruik van menselijke monsters door het Wadsworth Center van het New York State Department of Health voor de ontwikkeling van tests, protocolgoedkeuringsnummer #03-019.

1. Veiligheid

1. Trek persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) aan, minimaal oogbescherming (bril of gelaatsscherm), een chirurgisch masker en latexvrije handschoenen.
2. Zorg ervoor dat het personeel is ingeënt tegen hondsdolheid en dat in de afgelopen 6 maanden een titer van ≥0,5 IE/ml is aangetoond.

2. Voorbereiding van antigeenglaasjes

NOTITIE: Voer alle virus-, CSF- en serummanipulaties uit in een bioveiligheidskast (BSC) met behulp van universele voorzorgsmaatregelen.

1. Bereid 20 ml muizenneuroblastoom of BHK-21-cellen in een concentratie van 3,0 x 10⁵ cellen/ml in Eagle's minimale essentiële media aangevuld met 10% foetaal runderserum (EGM) en bewaar koud tot gebruik.
2. Bereid het CVS-11-virus voor door het te verdunnen in EGM tot een werkverdunning van 1,0 x 10^6,5 50% infectieuze weefselkweekdosis (TCID₅₀) per milliliter en bewaar koud tot het klaar is voor gebruik.
   OPMERKING: TCID₅₀ wordt bepaald door de eerder gepubliceerde riet- en münchmethode⁵.
3. Reinig een kamer met vochtigheidsglaasjes en met polytetrafluorethyleen (PTFE) gecoate putmicroscoopglaasjes met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen in de BSC.
4. Voeg gedestilleerd water (dH₂O) toe aan stroken absorberend papier in de objectglaasjeskamer om ervoor te zorgen dat de luchtvochtigheid gedurende de hele procedure constant blijft.
5. Label met een potlood elk te gebruiken glaasje met het lotnummer, de datum, het celtype en alle andere identificerende informatie die nodig is voor opslag, en plaats het in de objectglaasjeskamer.
   OPMERKING: De meeste markers, pennen of etiketten zijn niet bestand tegen de toekomstige acetonfixatiestap (stap 2.9).
6. Breng 50 μL virusverdunning aan op elk putje op de microscoopglaasjes met een repeterende pipet. Breng vervolgens 50 μL celverdunning aan op elk putje en zorg ervoor dat de pipetpunt niet wordt besmet met het virus dat zich al op het putje bevindt.
7. Sluit de vochtigheidsschuifkamer en plaats deze in de vochtige incubator bij 34-36 °C. Beoordeel de celinfectiviteit na 24 uur.
   OPMERKING: Voer stap 2.8-2.12 uit op slechts één objectglaasje.
8. Verwijder het glaasje uit de vochtigheidskamer en zuig het supernatant voorzichtig op. Was het glaasje gedurende 2 minuten in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gevulde Coplin-pot en laat het glaasje vervolgens aan de lucht drogen.
9. Plaats het glaasje in de Coplin-pot en fixeer het glaasje minimaal 1 uur in koude aceton in een vriezer van -20 °C die is goedgekeurd voor brandbare materialen. Voer alle acetongiet- en luchtdroogprocedures uit in een zuurkast.
10. Laat de aceton uitdampen en schuif om te drogen. Breng rabiës direct fluorescerend antilichaam (DFA) conjugaat bereid volgens de instructies van de fabrikant aan op de putjes van het objectglaasje en incubeer gedurende 30 minuten in een vochtige incubator van 34-36 °C.
11. Was het glaasje in Coplin-potten PBS twee keer gedurende 2 minuten. Laat de glijbaan aan de lucht drogen.
12. Monteer een dekglaasje met 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) en 20% glycerol-mountant en lees het objectglaasje af met een fluorescentiemicroscoop met een vergroting van 200x om de besmettelijkheid te beoordelen. Als de cellen niet voor ongeveer 50% geïnfecteerd zijn, herhaal dan stap 2.7-2.12 de volgende dag totdat de gewenste besmettelijkheid is bereikt.
    OPMERKING: De celinfectiviteit wordt geschat op basis van een visuele beoordeling van de verhouding tussen negatieve cellen en rabiës-positieve cellen op de objectglaasje. Negatieve cellen lijken rood van kleur, terwijl positieve cellen groene fluorescerende kleuring vertonen.
13. Verwijder de resterende objectglaasjes uit de incubator en de vochtigheidskamer. Zuig het supernatans voorzichtig op uit elk putje en plaats de objectglaasjes vervolgens gedurende 1-2 minuten in een Coplin-pot(ten) met PBS. Laat de dia's ongeveer 30 minuten aan de lucht drogen. Bewaar de glaasjes bij -80 °C tot gebruik.

3. Voorbereiding van het monster

1. Bereid verdunningen van het serum of het CSF-monster van de patiënt voor om te testen. Bereid het nodige conjugaat voor een goede werkconcentratie verdund in PBS met 0,05% Evans-blauw.
   NOTITIE: Bewaar het conjugaat in het donker om de fluorofoorintegriteit te behouden voordat u het aanbrengt

4. IFA-procedure

1. Verwijder het benodigde aantal voorbereide antigeenglaasjes dat nodig is voor elke test en laat de objectglaasjes ontdooien en volledig drogen.
2. Plaats de glaasjes in een Coplin-pot(ten) en fixeer de glaasjes gedurende 2 uur tot een nacht in koude aceton in een vriezer van -20 °C die is goedgekeurd voor brandbare materialen. Verwijder de glaasjes van de aceton en laat ze aan de lucht drogen.
3. Plaats de objectglaasjes in een vochtigheidskamer in de BSC met dH₂O-gedrenkte absorberende strips om de luchtvochtigheid op peil te houden. Breng 50 μL van elke monsterverdunning, controlemonster of PBS aan op het vooraf bepaalde putje.
   OPMERKING: Elk glaasje moet een geschikt aantal patiëntmonsterputjes, positieve controle, negatieve controle en PBS-celcontroleputje bevatten.
4. Plaats de gesloten vochtigheidsschuifkamer in een vochtige incubator van 37 °C, 5% CO₂ . Incubeer de objectglaasjes gedurende 30 minuten, verwijder vervolgens de vochtigheidsschuifkamer uit de incubator en plaats deze in een BSC.
5. Gebruik een afzuigtip om het supernatans voorzichtig uit elk putje op te zuigen, waarbij u ervoor zorgt dat de monolaag van de cel niet wordt verstoord. Gebruik een steriele druppelpipet om één druppel PBS op elk putje aan te brengen.
6. Herhaal de zorgvuldige aspiratie, plaats vervolgens elk glaasje in een met PBS gevulde Copilin-pot en was twee keer gedurende in totaal 15 minuten.
7. Plaats de objectglaasjes terug in de doos van de vochtigheidskamer en breng 50 μL van het juiste anti-menselijke antilichaamconjugaat aan op elk putje. Herhaal stap 4.4 tot en met 4.6.
8. Laat de objectglaasjes aan de lucht drogen, monteer een dekglaasje met montagemedia en lees de glaasjes af onder een fluorescerende microscoop.

5. Analyse van objectglaasjes

1. Sorteermonsters op basis van het kleuringspatroon en de fluorescentie-intensiteit in vergelijking met positieve controlemonsters met bevestigde hoge antirabiësantilichaamtiter.
2. Beoordeel de monsters op een schaal van negatief, 1+, 2+, 3+ en 4+, met een negatief resultaat dat geen fluorescerende kleuring laat zien en 4+ dat staat voor een heldergroene appelkleurige fluorescentie met een kleuringspatroon dat lijkt op positieve controlemonsters¹.
   OPMERKING: De groene appelkleur is alleen van toepassing op FITC-gelabelde antilichamen; De kleur varieert afhankelijk van de selectie van fluoroforen.
3. Wijs de monsters een eindpuntwaarde toe die wordt weergegeven door de verdunningsfactor waarbij het monster een 1-2+ graad vertoont. Test de monsters bij een hogere verdunningsfactor als het eindpunt niet wordt bereikt in de eerste test.

Resultaten

Alle serummonsters werden verzameld bij de patiënten op ongeveer hetzelfde tijdsbestek na PrEP. De monsters werden getest van vijf verschillende patiënten op de volgende tijdstippen: 2 weken na de laatste inenting tegen hondsdolheid, 6 maanden na de rabiësvaccinserie en 18 maanden na de rabiësvaccinserie. Elk serummonster werd in serie verdund en beoordeeld op zowel IgM- als IgG-aanwezigheid, zoals beschreven in protocolstappen 5.2 en 5.3. De toegekende antilichaamwaarde vertegenwoordigt de verdunningsfactor waarbij het monster een eindpunt van 1-2+ bereikte.

De resultaten van het testen van elk tijdstip na PrEP tonen aan dat de test in staat is om verschillende niveaus van aanwezigheid van antilichamen te detecteren. Kort na de eerste vaccinatie waren hoge niveaus van zowel IgM als IgG aanwezig in de patiëntenmonsters, zoals te zien is in figuur 1. Gebieden met felgroene fluorescerende celkleuring duiden op de aanwezigheid van positieve antilichamen; Rode bloedcellen zijn rabiës-negatieve cellen waaraan geen antilichaam kan binden. Ongeveer 6 maanden na vaccinatie waren significant lagere niveaus van zowel IgM als IgG aanwezig in de patiëntenmonsters, maar IgM was bijna volledig uitgevallen. Op het laatste tijdstip, 18 maanden na vaccinatie, werden IgM-antilichamen niet gedetecteerd in patiëntenmonsters, zoals aangetoond in figuur 2 waar geen groene fluorescerende celkleuring wordt waargenomen. De IgG-niveaus bleven echter aanhouden en bleven vergelijkbaar met de niveaus die werden gedetecteerd op het tijdstip van 6 maanden na de aanvankelijke daling vanaf het tijdstip van 2 weken. De resultaten voor IgG- en IgM-detectie in monsters van 2 weken na vaccinatie, 6 maanden na vaccinatie en 18 maanden na vaccinatie staan vermeld in respectievelijk tabel 1, tabel 2 en tabel 3. Figuur 3 toont het stroomschema van de uitvoeringsfasen.

Figuur 1: Rabiës IgM IFA positieve kleuring. Serum van de patiënt in een verdunning van 1:8 vertoonde een positief kleuringspatroon kort na voltooiing van de PrEP-vaccinreeks. De schaalbalk op de afbeelding staat voor 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Hondsdolheid IgM IFA negatieve kleuring. Serum van de patiënt in een verdunning van 1:2 vertoonde ongeveer 18 maanden na voltooiing van de PrEP-vaccinreeks geen positieve kleuring. De schaalbalk op de afbeelding staat voor 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Hondsdolheid IFA-stroomschema. Stroomdiagram met uitvoeringsfasen van de belangrijkste stappen in de IFA-procedure om te helpen bij procesvisualisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Patiënt Sample	Igm	IgG
PS1-1	1:32	1:512
PS2-1	1:8	1:128
PS3-1	1:16	1:256
PS4-1	1:64	1:512
PS5-1	1:16	1:128

Tabel 1: Resultaten 2 weken na vaccinatie. Patiëntmonsterresultaten van serummonsters die ongeveer 2 weken na voltooiing van de PrEP-vaccinreeks zijn verzameld.

Patiënt Sample	Igm	IgG
PS1-2	1:2	1:128
PS2-2	1:1	1:128
PS3-2	1:1	1:64
PS4-2	1:1	1:256
PS5-2	1:1	1:32

Tabel 2: Resultaten 6 maanden na vaccinatie. Patiëntmonsterresultaten van serummonsters die ongeveer 6 maanden na voltooiing van de PrEP-vaccinreeks zijn verzameld.

Patiënt Sample	Igm	IgG
PS1-3	Niet gedetecteerd	1:128
PS2-3	Niet gedetecteerd	1:128
PS3-3	Niet gedetecteerd	1:64
PS4-3	Niet gedetecteerd	1:64
PS5-3	Niet gedetecteerd	1:32

Tabel 3: Resultaten 18 maanden na vaccinatie. Patiëntmonsterresultaten van serummonsters die ongeveer 18 maanden na voltooiing van de PrEP-vaccinreeks zijn verzameld.

Discussie

De IFA-test maakt gebruik van een antigeen-antilichaamcomplex, waardoor een etiketteringsplaats rabiës-specifieke antilichamen kan visualiseren. Neuroblastoom- of BHK-cellen worden gezaaid op multi-well PTFE-gecoate microscoopglaasjes en geïnoculeerd met rabiësviruslaboratoriumstam CVS-11. Zodra de monolaag samenvloeit en de cellen de gewenste besmettelijkheid van ongeveer 50% bereiken, worden de objectglaasjes bewaard tot ze klaar zijn voor gebruik⁶.

Patiëntenserum of CSF wordt aangebracht op de geïnfecteerde celmonolaag en geïncubeerd om eventuele rabiës-specifieke antilichamen aan het virusantigeen⁷ te laten hechten. Na een wasprocedure wordt een fluorescerend gelabeld anti-humaan IgG- of IgM-antilichaam aangebracht dat zich bindt aan elk virusgebonden antilichaam uit de monstertoepassing. Gelabelde antilichamen kunnen vervolgens worden gevisualiseerd onder een fluorescerende microscoop.

Bij de voorbereiding van het uitvoeren van deze test is het belangrijk om de beste voorbereiding van patiëntmonsters, controles en conjugaten te bepalen. De eerste patiëntmonsters werden gescreend met een lage verdunningsfactor of onverdund om te testen op de aanwezigheid van antilichamen. Gepaarde monsters of eerder gescreende monsters die een hoog niveau van antilichamen vertoonden, werden vervolgens verder verdund tot het eindpunt. De eerste verdunningen van patiëntenmonsters voor IgG-testen werden bereid in in de handel verkrijgbaar IFA-verdunningsmiddel. IgM-testmonsters werden aanvankelijk bereid in een in de handel verkrijgbaar IgG-blokkerend reagens. Latere seriële verdunningen voor beide tests werden vervolgens bereid in PBS.

De controles die voor het testen werden gebruikt, werden verkregen van bekende ontvangers van rabiës PrEP of van personen zonder voorgeschiedenis van vaccinatie tegen hondsdolheid. Alle controlemonsters werden vóór gebruik getest op de aanwezigheid van antilichamen. De IgG-controle werd verkregen van een ontvanger van een rabiësvaccin met een vastgestelde rabiësneutraliserende antilichaamtiter bevestigd door FAVN. Het IgM-positieve controlemonster werd ongeveer 2 weken na voltooiing van de vaccinatie verkregen van een ontvanger van het rabiësvaccin.

Het gebruik van de juiste conjugaat is een ander essentieel aspect van het uitvoeren van de IFA-test. Het conjugaat dat voor elke test wordt gebruikt, hangt af van het antilichaamisotypedoel voor die test. In dit geval werden in de handel verkrijgbare FITC-gelabelde anti-menselijke IgG- en anti-menselijke IgM-antilichamen gebruikt. Werkende antilichaamconjugaatverdunningen werden voorafgaand aan de test bepaald op basis van de aanbeveling van de fabrikant.

Er zijn verschillende belangrijke stappen in de procedure die een succesvolle uitvoering van de IFA-test zullen garanderen, misschien wel de belangrijkste is de voorbereiding van antigeenglaasjes. Het bereiken van een besmettelijkheid van ongeveer 50% zorgt voor overvloedige bindingsplaatsen voor beschikbare antilichamen, terwijl het ook duidelijkheid schept bij het lezen en beoordelen van monsters. De rabiës-negatieve cellen creëren een contrasterende achtergrond om gelabelde antilichamen beter te visualiseren. Niet-specifieke kleuring kan ook een probleem vormen bij het uitvoeren van fluorescerende kleuring met behulp van complexe monstermatrices, zoals serum. Het gebruik van IgG-inactivatiereagentia (bijv. Gullsorb) helpt bij het verminderen van niet-specifieke kleuring als gevolg van storende IgG-antilichamen bij het beoordelen van de aanwezigheid van IgM⁸. De juiste voorbereiding van materialen en de integratie van speciale reagentia in de procedure helpen problematische kleuring te verminderen met behoud van hoogwaardige resultaten.

Er is een groot aantal testmethoden ontwikkeld die zich richten op de detectie, kwantificering en identificatie van rabiësantilichamen. Elk van deze tests biedt resultaten die op verschillende manieren kunnen worden gebruikt, afhankelijk van de gezochte informatie. Hondsdolheid IFA-testen zijn een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van virusspecifieke antilichaamisotypen, en de resultaten kunnen in relatief korte tijd klaar zijn in vergelijking met andere testmethoden, zoals de RFFIT- en FAVN-tests.

Hoewel de IFA-test rabiës-antilichamen in een monster kan detecteren, biedt het geen gestandaardiseerde kwantificering van de antilichamen. De IFA-test levert een serumverdunningsfactor op waarbij de detectie van antilichamen eindigt. Ter vergelijking: de RFFIT- en FAVN-tests kwantificeren het neutraliserende vermogen van antilichamen in een monster, wat resulteert in een titer van internationale eenheden (IE), wat een gedetailleerder en gestandaardiseerd resultaat oplevert. Resultaten van een FAVN- of een RFFIT-test tonen de aanwezigheid aan van neutraliserende antilichamen, waarvan is vastgesteld dat het IgG-antilichamen^{zijn 9}. De rol van IgM bij het neutraliseren van activiteit wordt als beperkt beschouwd vanwege zijn structuur¹⁰. Daarom detecteren deze tests niet specifiek de aanwezigheid van IgM.

Het type test en het resultaat ervan kunnen enigszins problematisch zijn bij het toepassen ervan op een specifiek probleem. Het concept van een beschermend niveau van antilichaambescherming tegen rabiësvirusinfectie wordt niet langer gebruikt om de immuunrespons op rabiësvaccinatie te evalueren. Voorheen werd een beschermende respons gedefinieerd als ≥0,5 IE. In de huidige publicaties wordt de antilichaamrespons na immunisatie echter doorgaans aanvaardbaar (≥0,5 IE) of onaanvaardbaar (<0,5 IE) genoemd. Zoals gezegd, geeft de IFA-test geen antilichaamtiter in IE en mag deze niet worden gebruikt om een niveau van bescherming tegen hondsdolheid af te leiden. Het gebruik van de IFA-test bij het evalueren van een patiënt die hondsdolheid heeft ontwikkeld, resulteert mogelijk niet altijd in een positieve aanwezigheid van antilichamen als gevolg van variaties in de immuunrespons gedurende de ziekte. Vanwege de bijna 100% dodelijkheid van een rabiësinfectie, is het belangrijk om de test te overwegen en hoeveel informatie veilig uit deze resultaten kan worden afgeleid¹¹. Om deze redenen is het altijd het beste om alle testmethoden voor rabiësantilichamen te evalueren en te bepalen welke het beste werkt in een bepaald scenario.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
25x55mm glass cover slips	Any
Acetone	Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate	Sigma-Aldrich	F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate	SeraCare	5230-0286
Aspirating pipette tip	Any
BHK-21 Cells	ATCC	CCL-10
BION IFA Diluent	MBL BION	DIL-9993
Cell Culture water	Sigma-Aldrich	W3500	EGM
Coplin Jars	Any
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442	EGM
Fluorescent microscope with FITC filter	Any
Glycerol	Sigma-Aldrich	G7893	Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent	Fisher Scientific	23-043-158	IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G-7513	EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	M0643	EGM
Mouse Neuroblastoma Cells	ATCC	CCL-131
Multi-well PTFE coating glass slides	Any
PBS	Any		pH 7.6
Penicillin	Sigma	P-3032	EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate	Millipore Sigma	5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S-5761	EGM
Sodium Chloride crystals	Sigma-Aldrich	S5886	Mountant
Sterile dropper	Any
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S9137	EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0	Sigma-Aldrich	S9693	Mountant
Tryptose Phosphate Broth	BD	260300	EGM
Vitamin mix	Sigma-Aldrich	M6895	EGM