Het doel van dit manuscript is om het gebruik van de rabiës indirecte fluorescerende antilichaamtest voor de detectie van rabiës-specifieke IgG- en IgM-antilichamen te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Detectie van rabiës IgG- en IgM-antilichamen met behulp van de Rabiës Indirect Fluorescerende Antilichaamtest
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De rabiës indirecte fluorescerende antilichaam (IFA) test is ontwikkeld om verschillende rabiës-specifieke antilichaamisotypes in sera of cerebrale spinale vloeistof te detecteren. Deze test levert snelle resultaten op en kan worden gebruikt om antilichamen tegen hondsdolheid in verschillende scenario's te detecteren. De rabiës IFA-test is vooral nuttig voor de snelle en vroege detectie van antilichamen om de immuunrespons te evalueren bij een patiënt die hondsdolheid heeft ontwikkeld. Hoewel andere methoden voor antemortem rabiësdiagnose voorrang hebben, kan deze test worden gebruikt om recente blootstelling aan het rabiësvirus aan te tonen door middel van antilichaamdetectie. De IFA-test geeft geen virusneutraliserende antilichaamtiter (VNA), maar de pre-exposure profylaxerespons (PrEP) kan worden geëvalueerd aan de hand van positieve of negatieve aanwezigheid van antilichamen. Deze test kan in verschillende situaties worden gebruikt en kan resultaten opleveren voor een aantal verschillende doelen. In deze studie gebruikten we verschillende gepaarde serummonsters van personen die PrEP kregen en toonden we hun aanwezigheid van rabiësantilichamen in de loop van de tijd aan met behulp van de IFA-test.
Inleiding
De rabiës indirecte fluorescerende antilichaam (IFA) test wordt gebruikt om verschillende rabiës-specifieke antilichaamisotypes in sera of cerebrale spinale vloeistof te detecteren. Het is een van een arsenaal aan tests die beschikbaar zijn voor het monitoren van een antemortem rabiëspatiënt. Het is vooral nuttig voor de vroege detectie van antilichamen om de immuunrespons van een patiënt op rabiësinfectie te evalueren. Bij gebruik in combinatie met andere tests, casusgeschiedenis en de vaccinatiestatus van de patiënt, kan de IFA-test helpen bij het bepalen van de blootstelling aan het rabiësvirus of een vaccin1. Aangezien de IFA-test IgM en/of IgG meet, kunnen de waarden van het specifieke antilichaam een geschat tijdsbestek aangeven vanaf blootstelling aan het antigeen1. Deze test kan nuttig zijn in de vermelde toepassingen of andere die nog niet zijn onderzocht.
Er zijn verschillende serologische tests voor hondsdolheid beschikbaar. De snelle fluorescerende focusremmingstest (RFFIT), fluorescerende antilichaamvirusneutralisatietest (FAVN) of modificaties hiervan zijn de primaire methoden voor het meten van rabiësvirusneutraliserende antilichamen (RVNA's)1. Deze tests maken echter geen onderscheid tussen IgM- en IgG-antilichamen. Wanneer het differentiëren van het antilichaamisotype belangrijk is bij het bewaken van de rabiës-immuunrespons, worden de rabiës-IFA- en de rabiës-enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) -tests gebruikt, maar ze meten geen RVNA's. Hoewel de IFA- en ELISA-tests kunnen worden gebruikt om de aanwezigheid van rabiësspecifieke antilichamen in een monster te bepalen, zijn er enkele verschillen in de manier waarop ze worden uitgevoerd. De IFA-test maakt gebruik van een in cellen gekweekt levend virus als antigeensubstraat, terwijl een typische ELISA voor de detectie van hondsdolheid een of meer van de virale eiwitten gebruikt. In een laboratoriumomgeving waar het rabiësvirus kan worden gekweekt, kan de IFA-test gemakkelijker worden uitgevoerd in plaats van individuele virale eiwitten voor de ELISA te kopen of te kweken. Bij het bepalen van de keuze van de serologische rabiëstest moet rekening worden gehouden met het doel van de tests en de informatie die is verkregen uit de resultaten van een serologische rabiëstest2.
IgM is de eerste die reageert, toenemend totdat rond dag 28 klassewisseling wordt waargenomen, waarna IgG het overheersende circulerende antilichaam3 wordt. Daarom zou IgM slechts gedurende een beperkte tijd worden verwacht na blootstelling aan het rabiësvirus of vaccinatie. Het testen van zowel serum als hersenvocht (CSF) kan aangeven of de blootstelling plaatsvond door vaccinatie, waarbij antilichamen alleen in sera zouden worden gezien, of door een virale infectie, die mogelijk antilichamen in CSF1 zou vertonen.
Er is vastgesteld dat rabiësantilichamen enkele jaren aanhouden na pre-expositieprofylaxe (PrEP)4. De IFA-test kan een handig hulpmiddel zijn om dit op verschillende tijdstippen na vaccinatie of blootstelling aan te tonen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het volgende protocol is goedgekeurd voor het ethische gebruik van menselijke monsters door het Wadsworth Center van het New York State Department of Health voor de ontwikkeling van tests, protocolgoedkeuringsnummer #03-019.
1. Veiligheid
- Trek persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) aan, minimaal oogbescherming (bril of gelaatsscherm), een chirurgisch masker en latexvrije handschoenen.
- Zorg ervoor dat het personeel is ingeënt tegen hondsdolheid en dat in de afgelopen 6 maanden een titer van ≥0,5 IE/ml is aangetoond.
2. Voorbereiding van antigeenglaasjes
NOTITIE: Voer alle virus-, CSF- en serummanipulaties uit in een bioveiligheidskast (BSC) met behulp van universele voorzorgsmaatregelen.
- Bereid 20 ml muizenneuroblastoom of BHK-21-cellen in een concentratie van 3,0 x 105 cellen/ml in Eagle's minimale essentiële media aangevuld met 10% foetaal runderserum (EGM) en bewaar koud tot gebruik.
- Bereid het CVS-11-virus voor door het te verdunnen in EGM tot een werkverdunning van 1,0 x 106,5 50% infectieuze weefselkweekdosis (TCID50) per milliliter en bewaar koud tot het klaar is voor gebruik.
OPMERKING: TCID50 wordt bepaald door de eerder gepubliceerde riet- en münchmethode5. - Reinig een kamer met vochtigheidsglaasjes en met polytetrafluorethyleen (PTFE) gecoate putmicroscoopglaasjes met 70% ethanol en laat ze aan de lucht drogen in de BSC.
- Voeg gedestilleerd water (dH2O) toe aan stroken absorberend papier in de objectglaasjeskamer om ervoor te zorgen dat de luchtvochtigheid gedurende de hele procedure constant blijft.
- Label met een potlood elk te gebruiken glaasje met het lotnummer, de datum, het celtype en alle andere identificerende informatie die nodig is voor opslag, en plaats het in de objectglaasjeskamer.
OPMERKING: De meeste markers, pennen of etiketten zijn niet bestand tegen de toekomstige acetonfixatiestap (stap 2.9). - Breng 50 μL virusverdunning aan op elk putje op de microscoopglaasjes met een repeterende pipet. Breng vervolgens 50 μL celverdunning aan op elk putje en zorg ervoor dat de pipetpunt niet wordt besmet met het virus dat zich al op het putje bevindt.
- Sluit de vochtigheidsschuifkamer en plaats deze in de vochtige incubator bij 34-36 °C. Beoordeel de celinfectiviteit na 24 uur.
OPMERKING: Voer stap 2.8-2.12 uit op slechts één objectglaasje. - Verwijder het glaasje uit de vochtigheidskamer en zuig het supernatant voorzichtig op. Was het glaasje gedurende 2 minuten in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gevulde Coplin-pot en laat het glaasje vervolgens aan de lucht drogen.
- Plaats het glaasje in de Coplin-pot en fixeer het glaasje minimaal 1 uur in koude aceton in een vriezer van -20 °C die is goedgekeurd voor brandbare materialen. Voer alle acetongiet- en luchtdroogprocedures uit in een zuurkast.
- Laat de aceton uitdampen en schuif om te drogen. Breng rabiës direct fluorescerend antilichaam (DFA) conjugaat bereid volgens de instructies van de fabrikant aan op de putjes van het objectglaasje en incubeer gedurende 30 minuten in een vochtige incubator van 34-36 °C.
- Was het glaasje in Coplin-potten PBS twee keer gedurende 2 minuten. Laat de glijbaan aan de lucht drogen.
- Monteer een dekglaasje met 0,05 M Tris, 0,15 M NaCl (pH 9,0) en 20% glycerol-mountant en lees het objectglaasje af met een fluorescentiemicroscoop met een vergroting van 200x om de besmettelijkheid te beoordelen. Als de cellen niet voor ongeveer 50% geïnfecteerd zijn, herhaal dan stap 2.7-2.12 de volgende dag totdat de gewenste besmettelijkheid is bereikt.
OPMERKING: De celinfectiviteit wordt geschat op basis van een visuele beoordeling van de verhouding tussen negatieve cellen en rabiës-positieve cellen op de objectglaasje. Negatieve cellen lijken rood van kleur, terwijl positieve cellen groene fluorescerende kleuring vertonen. - Verwijder de resterende objectglaasjes uit de incubator en de vochtigheidskamer. Zuig het supernatans voorzichtig op uit elk putje en plaats de objectglaasjes vervolgens gedurende 1-2 minuten in een Coplin-pot(ten) met PBS. Laat de dia's ongeveer 30 minuten aan de lucht drogen. Bewaar de glaasjes bij -80 °C tot gebruik.
3. Voorbereiding van het monster
- Bereid verdunningen van het serum of het CSF-monster van de patiënt voor om te testen. Bereid het nodige conjugaat voor een goede werkconcentratie verdund in PBS met 0,05% Evans-blauw.
NOTITIE: Bewaar het conjugaat in het donker om de fluorofoorintegriteit te behouden voordat u het aanbrengt
4. IFA-procedure
- Verwijder het benodigde aantal voorbereide antigeenglaasjes dat nodig is voor elke test en laat de objectglaasjes ontdooien en volledig drogen.
- Plaats de glaasjes in een Coplin-pot(ten) en fixeer de glaasjes gedurende 2 uur tot een nacht in koude aceton in een vriezer van -20 °C die is goedgekeurd voor brandbare materialen. Verwijder de glaasjes van de aceton en laat ze aan de lucht drogen.
- Plaats de objectglaasjes in een vochtigheidskamer in de BSC met dH2O-gedrenkte absorberende strips om de luchtvochtigheid op peil te houden. Breng 50 μL van elke monsterverdunning, controlemonster of PBS aan op het vooraf bepaalde putje.
OPMERKING: Elk glaasje moet een geschikt aantal patiëntmonsterputjes, positieve controle, negatieve controle en PBS-celcontroleputje bevatten. - Plaats de gesloten vochtigheidsschuifkamer in een vochtige incubator van 37 °C, 5% CO2 . Incubeer de objectglaasjes gedurende 30 minuten, verwijder vervolgens de vochtigheidsschuifkamer uit de incubator en plaats deze in een BSC.
- Gebruik een afzuigtip om het supernatans voorzichtig uit elk putje op te zuigen, waarbij u ervoor zorgt dat de monolaag van de cel niet wordt verstoord. Gebruik een steriele druppelpipet om één druppel PBS op elk putje aan te brengen.
- Herhaal de zorgvuldige aspiratie, plaats vervolgens elk glaasje in een met PBS gevulde Copilin-pot en was twee keer gedurende in totaal 15 minuten.
- Plaats de objectglaasjes terug in de doos van de vochtigheidskamer en breng 50 μL van het juiste anti-menselijke antilichaamconjugaat aan op elk putje. Herhaal stap 4.4 tot en met 4.6.
- Laat de objectglaasjes aan de lucht drogen, monteer een dekglaasje met montagemedia en lees de glaasjes af onder een fluorescerende microscoop.
5. Analyse van objectglaasjes
- Sorteermonsters op basis van het kleuringspatroon en de fluorescentie-intensiteit in vergelijking met positieve controlemonsters met bevestigde hoge antirabiësantilichaamtiter.
- Beoordeel de monsters op een schaal van negatief, 1+, 2+, 3+ en 4+, met een negatief resultaat dat geen fluorescerende kleuring laat zien en 4+ dat staat voor een heldergroene appelkleurige fluorescentie met een kleuringspatroon dat lijkt op positieve controlemonsters1.
OPMERKING: De groene appelkleur is alleen van toepassing op FITC-gelabelde antilichamen; De kleur varieert afhankelijk van de selectie van fluoroforen. - Wijs de monsters een eindpuntwaarde toe die wordt weergegeven door de verdunningsfactor waarbij het monster een 1-2+ graad vertoont. Test de monsters bij een hogere verdunningsfactor als het eindpunt niet wordt bereikt in de eerste test.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Alle serummonsters werden verzameld bij de patiënten op ongeveer hetzelfde tijdsbestek na PrEP. De monsters werden getest van vijf verschillende patiënten op de volgende tijdstippen: 2 weken na de laatste inenting tegen hondsdolheid, 6 maanden na de rabiësvaccinserie en 18 maanden na de rabiësvaccinserie. Elk serummonster werd in serie verdund en beoordeeld op zowel IgM- als IgG-aanwezigheid, zoals beschreven in protocolstappen 5.2 en 5.3. De toegekende antilichaamwaarde vertegenwoordigt de verdunningsfactor waarbij het ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De IFA-test maakt gebruik van een antigeen-antilichaamcomplex, waardoor een etiketteringsplaats rabiës-specifieke antilichamen kan visualiseren. Neuroblastoom- of BHK-cellen worden gezaaid op multi-well PTFE-gecoate microscoopglaasjes en geïnoculeerd met rabiësviruslaboratoriumstam CVS-11. Zodra de monolaag samenvloeit en de cellen de gewenste besmettelijkheid van ongeveer 50% bereiken, worden de objectglaasjes bewaard tot ze klaar zijn voor gebruik6.
Patiëntenserum of ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We zijn het Wadsworth Center van het New York State Department of Health dankbaar voor het ondersteunen van dit project.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well PTFE coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500, 6500, RU5100, or RU5500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
Referenties
- Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , Geneva. 232-245 (2018).
- Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516(2021).
- Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
- Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
- Fooks, A. R., Jackson, A. C. Rabies: scientific basis of the disease and its management. , Academic Press. (2020).
- Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
- Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
- Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
- Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595(2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
