Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Single-Copy Gene Locus Chromatine Zuivering in Saccharomyces cerevisiae

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65460

⸱

17 november 2023

 , 
1Institute of Epigenetics and Stem Cells, Helmholtz Zentrum München

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een locus-specifieke chromatine-isolatiemethode op basis van plaatsspecifieke recombinatie om een single-copy genlocus van belang in zijn natuurlijke chromatinecontext te zuiveren van ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae.

Samenvatting

De basisorganisatorische eenheid van eukaryotisch chromatine is het nucleosoomkerndeeltje (NCP), dat bestaat uit DNA dat ~1,7 keer rond een histon-octameer is gewikkeld. Chromatine wordt gedefinieerd als de entiteit van NCP's en tal van andere eiwitcomplexen, waaronder transcriptiefactoren, chromatine-remodellering en modificerende enzymen. Het is nog onduidelijk hoe deze eiwit-DNA-interacties worden georkestreerd op het niveau van specifieke genomische loci tijdens verschillende stadia van de celcyclus. Dit is voornamelijk te wijten aan de huidige technische beperkingen, die het moeilijk maken om nauwkeurige metingen van dergelijke dynamische interacties te verkrijgen. Hier beschrijven we een verbeterde methode die plaatsspecifieke recombinatie combineert met een efficiënt single-step affiniteitszuiveringsprotocol om een single-copy genlocus van belang te isoleren in zijn oorspronkelijke chromatinetoestand. De methode maakt de robuuste verrijking van de doellocus ten opzichte van genoomchromatine mogelijk, waardoor deze techniek een effectieve strategie is voor het identificeren en kwantificeren van eiwitinteracties op een onbevooroordeelde en systematische manier, bijvoorbeeld door massaspectrometrie. Afgezien van dergelijke samenstellingsanalyses weerspiegelt het met deze methode gezuiverde natieve chromatine waarschijnlijk de in vivo situatie met betrekking tot nucleosoompositionering en histonmodificaties en is het daarom vatbaar voor verdere structurele en biochemische analyses van chromatine dat is afgeleid van vrijwel elke genomische locus in gist.

Inleiding

De dynamische organisatie van eukaryote genomen in chromatine comprimeert het DNA om binnen de grenzen van de kern te passen, terwijl het zorgt voor voldoende dynamiek voor genexpressie en toegankelijkheid voor regulerende factoren. Voor een deel wordt deze veelzijdigheid gemedieerd door het nucleosoom, de basiseenheid van chromatine, die bestaat uit een kerndeeltje met 147 bp DNA dat ~1,7 keer rond het histonoctameer1 is gewikkeld. Het nucleosoom is een zeer dynamische structuur met betrekking tot zijn samenstelling, met talrijke histonvarianten en posttranslationele modificaties (PTM's) op de N- en C-terminale histonstaarten. Bovendien interageert eukaryotisch chromatine met een groot aantal andere essentiële componenten, zoals transcriptiefactoren, DNA- en RNA-verwerkingsmachines, architecturale eiwitten, enzymen die betrokken zijn bij de remodellering en modificatie van chromatine, en RNA-moleculen die verband houden met chromatine. Deze cruciale machines die betrokken zijn bij transcriptie, replicatie en reparatie vereisen allemaal toegang tot chromatine, dat dient als het natuurlijke substraat voor deze processen. Bijgevolg vereist het begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze DNA-transacties een nauwkeurige definitie van de collectieve veranderingen in de chromatinestructuur in de specifieke genomische regio's waar deze machines samenkomen en biologische reacties vergemakkelijken.

Ondanks de identificatie van talrijke chromatinefactoren door middel van genetica en eiwit-eiwitinteractiestudies, is het uitvoeren van directe, onbevooroordeelde en uitgebreide analyses van chromatine-interacties op bepaalde genomische locaties een belangrijk obstakel gebleven 2,3. Aanvankelijk konden alleen zeer overvloedige regio's van het genoom (d.w.z. repetitieve loci) of plasmiden met meerdere kopieën in voldoende hoeveelheden en zuiverheid worden geïsoleerd voor massaspectrometrische identificatie van de geassocieerde eiwitten 4,5,6,7. Een reeks nieuwe benaderingen op basis van de directe hybridisatie van capture-sondes tot gechromatineerd DNA, nabijheidsbiotinylering met behulp van het CRISPR-dCas9-systeem of de binding van sequentiespecifieke adaptereiwitten aan de locus van belang zijn begonnen met het ontrafelen van het proteoom van single-copy loci uit het genoom van gist en zoogdieren 8,9,10. Al deze methoden vereisen echter formaldehyde-verknoping om de eiwit-DNA-interacties te stabiliseren en sonicatie om het chromatine op te lossen voor latere zuivering. Samen sluiten beide manipulaties de mogelijkheid uit van latere structurele en functionele studies van het gezuiverde chromatine.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we eerder een methodologie bedacht die plaatsspecifieke recombinatie gebruikt om gerichte chromosomale domeinen uit gist11,12 te extraheren. In wezen is het genomische gebied van belang omgeven door herkenningsplaatsen (RS) voor de plaatsspecifieke R-recombinase van Zygosaccharomyces rouxi, terwijl tegelijkertijd een groep van drie DNA-bindingsplaatsen voor het prokaryote transcriptionele repressor-LexA-eiwit (LexA) in dezelfde regio wordt opgenomen. De gistcellen bevatten een expressiecassette voor de gelijktijdige expressie van R-recombinase en een LexA-eiwit dat is gefuseerd met een tandem affiniteitszuivering (TAP)-tag. Na de inductie van R-recombinase snijdt het enzym het beoogde gebied efficiënt uit het chromosoom in de vorm van een cirkelvormig chromatinedomein. Dit domein kan worden gezuiverd via het LexA-TAP-adaptereiwit, dat zich bindt aan de LexA-DNA-bindingsplaatsen, evenals aan een affiniteitsondersteuning. Deze methode is onlangs gebruikt om verschillende chromatinedomeinen te isoleren die geselecteerde replicatie-oorsprong van gistchromosoom III13 bevatten.

Een groot voordeel van deze ex vivo benadering is dat het functionele analyses van het geïsoleerde materiaal mogelijk maakt. Replicatieoorsprongsdomeinen die met deze methode zijn gezuiverd, kunnen bijvoorbeeld worden onderworpen aan in-vitroreplicatietests om de efficiëntie van het afvuren van de oorsprong in een reageerbuis te beoordelen op basis van native in vivo geassembleerde chromatinesjablonen. Uiteindelijk kan de biochemische en functionele karakterisering van het geïsoleerde materiaal de reconstitutie van nucleaire processen mogelijk maken met behulp van gezuiverde eiwitten samen met het native chromatine-sjabloon. Samenvattend opent deze methodologie een opwindende weg in chromatine-onderzoek, omdat het mogelijk zal zijn om de collectieve samenstellings- en structurele chromatineveranderingen van een specifiek genoomgebied dat een bepaalde chromosomale transactie ondergaat, te volgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt. Zie tabel 1 voor een lijst van de gebruikte oplossingen, buffers en media.

1. Recombinante giststamconstructie

  1. Om een recombinatiecompetente giststam te construeren, transformeert u SbfI-verteerd plasmide K238 in een giststam met geïntegreerde LexA-bindingsplaatsen en RS-recombinatieplaatsen op de plaats van belang13,14.
    OPMERKING: Het getransformeerde SbfI-restrictiefragment bevat de vereiste expressiecassette voor constitutieve expressie van het LexA-TAP-fusie-eiwit en R-recombinase samen met homologe sequenties van gistchromosoom I voor genomische integratie van de expressiecassette door homologe recombinatie (Figuur 1).
  2. Om een controlestam te construeren, neemt u een isogene giststam zonder geïntegreerde RS- en LexA-bindingsplaatsen en transformeert u deze met SbfI-verteerd K238-plasmide onder dezelfde omstandigheden als gebruikt voor de recombinatiecompetente stam.
  3. Selecteer de competente gistcellen op basis van de LEU2-selectiemarker op SCD-LEU-agarplaten14.

2. Koppeling van IgG-antilichamen aan epoxy-geactiveerde magnetische kralen

OPMERKING: Koppel IgG-antilichamen aan epoxy-geactiveerde magnetische kralen volgens het volgende gepubliceerde protocol11.

  1. Suspendeer 300 mg epoxy-geactiveerde parels in 10 ml 50% aceton (300 mg komt overeen met ~5,1 ×10 10 korrels) in een conische buis van 50 ml. Schud krachtig op een vortexmixer.
  2. Centrifugeer het buisje met de parels bij 820 × g en 4 °C gedurende 2 min. Verwijder het supernatant.
  3. Was de korrels 3x met 20 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,4). Verwijder het bovendrijvende middel na elke wasstap door centrifugeren zoals beschreven in stap 2.2.
  4. Hang de korrels in 16 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,4) en draai ze voorzichtig 5 minuten in een hybridisatieoven bij kamertemperatuur.
  5. Los de IgG's (100 mg) van het konijn op in 7 ml dH2O (eindconcentratie: 14 mg/ml).
  6. Centrifugeer de IgG-suspensie bij 13.000 × g en 4 °C gedurende 10 minuten om de suspensie te klaren.
  7. Breng 3,5 ml van het supernatans (overeenkomend met 50 mg IgG's van konijnen) over in een nieuwe conische buis van 50 ml.
  8. Verdun de IgG-oplossing met 9,85 ml 0,1 M natriumfosfaatbuffer (pH 7,4), gevolgd door de druppelsgewijze toevoeging van 6,65 ml 3 M ammoniumsulfaat aan 0,1 M natriumfosfaat (pH 7,4) onder voorzichtig mengen.
    OPMERKING: Voeg niet snel ammoniumsulfaat toe aan de oplossing, aangezien een hoge lokale concentratie van het zout de neerslag van de konijnen-IgG's zal veroorzaken.
  9. Centrifugeer de IgG-oplossing bij 820 × g en 4 °C gedurende 3 minuten en voeg het resulterende supernatans toe aan de magnetische parelsuspensie.
  10. Incubeer de buis een nacht of ten minste gedurende 18 uur bij 30 °C met zachte rotatie in een hybridisatieoven.
  11. Verwijder het supernatans zoals beschreven in stap 2.2.
  12. Was de korrels met 20 ml 100 mM glycine-HCl (pH 2,5). Verwijder de oplossing snel zoals beschreven in stap 2.2 om denaturatie van de IgG-polypeptiden te voorkomen.
  13. Was de korrels één keer met 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,8). Zuig het supernatans op zoals beschreven in stap 2.2.
  14. Voeg 20 ml 0,1M triethylamine-oplossing toe gedurende 5-10 minuten onder zachte rotatie om de resterende reactieve epoxygroepen te inactiveren. Verwijder het supernatans zoals beschreven in stap 2.2.
  15. Was de kralen 4x met 20 ml PBS (pH 7,4) gedurende 5 minuten met zachte rotatie. Verwijder het supernatans zoals beschreven in stap 2.2 na elke wasstap.
  16. Was de kralen 2x met 20 ml PBS (pH 7,4) met 0,5% Triton X-100 (w/v) gedurende 5 min en 15 min elk onder zachte rotatie in een hybridisatieoven. Verwijder het supernatans zoals beschreven in stap 2.2.
  17. Suspendeer de korrels in een eindvolume van 16 ml PBS (pH 7,4) met 0,02% natriumazide (w/v). Bewaren als aliquot van 1 ml bij 4 °C tot gebruik.

3. Gistcelkweek en oogst

  1. Inoculeer controle- en recombinatiecompetente giststammen van YPD-platen in 5 ml YPR-medium en incubeer 's nachts bij 30 °C en 200 rpm.
  2. Inoculeer 2 ml van deze cultuur in 100 ml YPR-medium en incubeer een nacht bij 30 °C en 200 rpm.
  3. Doseer voor elke stam 1.800 ml geautoclaveerd YP-medium en 200 ml geautoclaveerde raffinose-oplossing (20% m/v) in elk van de twee erlenmeyers van 5 l (in totaal 4 l kweekmedium voor elke stam, verdeeld over twee kolven).
  4. Inoculeer de groeiende gistcellen bij OD600 0,2 in hun respectieve medium en incubeer zoals beschreven in stap 3.1 gedurende ongeveer 6 uur of totdat de cellen de gewenste OD600 van 1,0 hebben bereikt. Om een normale groei van de cellen te garanderen, vrij van enige verontreiniging, controleert u de OD met tussenpozen van 2 uur.
  5. Voeg 200 ml galactose (20% m/v) toe om plaatsspecifieke recombinatie te induceren.
  6. Voeg 110 μL (50 ng/ml) YMFA toe (tegelijk met de galactose, stap 3.5) om de cellen in de G1-fase te stoppen en gedurende 2 uur te incuberen.
    OPMERKING: De toevoeging van YMFA aan de cellen hangt af van de experimentele omstandigheden en de biologische vraag die moet worden aangepakt. Precies, voor dit experiment worden de cellen gearresteerd in de G1-fase om een homogene celpopulatie te verkrijgen met een gelicentieerde replicatieoorsprong; in dit proces bindt het pre-replicatieve complex zich aan de oorsprong in de G1-fase voorafgaand aan de start van DNA-replicatie in de S-fase.
  7. Breng de celsuspensie over in centrifuge-emmers van 1 liter en centrifugeer bij 6.000 × g en 4 °C gedurende 10 minuten. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de celpellets in een totaal volume van 10-15 ml dH2O.
  8. Sluit een spuit van 25 ml af met een Luer-plug en plaats deze in een conische buis van 50 ml gevuld met water. Breng de celsuspensie over naar de spuit en centrifugeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 2.397 × g . Gooi de supernatant weg.
  9. Verwijder de Luer-plug uit de spuit en extrudeer de cellen tot vloeibare stikstof om de cel "spaghetti" te vormen.
    OPMERKING: Het gebruik van 4 L kweekmedium levert een nat gewicht van de uiteindelijke celpellets op van 7-10 g.
  10. Doe de spaghetti met bevroren cellen in een conische buis van 50 ml en bewaar tot verder gebruik bij -80 °C.

4. Chromatine locus zuivering

OPMERKING: Zie figuur 2 voor een schematisch overzicht van de stappen die betrokken zijn bij dit locusspecifieke chromatinezuiveringsprotocol.

  1. Koel een commerciële koffiemolen af door 30-50 g droogijs te malen door de koffiemolen elke keer 2x gedurende 30 seconden krachtig te schudden. Eenmaal afgekoeld, gooi je het droogijspoeder weg.
  2. Meng 3 g bevroren gistcelspaghetti met ~30-50 g droogijs in de voorgekoelde koffiemolen.
  3. Dicht de verbinding tussen de dop en de molen af met parafilm om het verlies van gistcelpoeder tijdens het malen te voorkomen.
  4. Maal het gistcel-droogijsmengsel 10x gedurende 30 s per keer, met intervallen van 30 s tussen elke ronde (totale tijdsschatting: ~10 min). Om te voorkomen dat het droogijs en celpoeder aan de wanden van de koffiemolen blijven kleven, tikt u tijdens het malen continu op de zijkanten van de koffiemolen.
  5. Breng het resulterende gistcel-droogijspoeder over in een plastic beker met een schone en droge spatel.
  6. Bewaar de bekers op kamertemperatuur om het droogijs te laten verdampen.
  7. Zodra het droogijs is verdampt, voegt u 2,25 ml MB-buffer met 1x protease- en fosfataseremmers (750 μL/g gistcellen) toe aan het gistcelpoeder.
  8. Pipeteer het cel-buffermengsel krachtig om de volledige suspensie van de cellen met de buffer te garanderen en breng het over in een conische buis van 15 ml.
  9. Neem monsters voor DNA- (0,1%) en eiwitanalyse (0,05%) van de resulterende celsuspensie (ruwe celextracten [CCE]). Bewaren bij −20 °C tot verdere verwerking (beschreven in rubriek 7).
  10. Breng de celsuspensie over in reactiebuisjes met een lage binding van 2 ml en centrifugeer bij 21.130 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C om het celafval te scheiden van het ruwe cellysaat.
  11. Bundel de supernatanten van alle buisjes in één conische buis van 15 ml.
  12. Neem monsters van het supernatans (input [IN]) voor DNA- (0,1%) en eiwitanalyse (0,05%). Bewaren bij −20 °C tot verdere verwerking (beschreven in rubriek 7).
  13. Breng 500 μL IgG-gekoppelde magnetische parelslurry (voor elke giststam) in evenwicht door 2x te wassen met 500 μL koude MB-buffer met 1x protease- en fosfataseremmers gedurende 5 minuten elk bij 4 °C bij rotatie bij 20 rpm. Gooi het supernatans na elke wasstap van de kralen weg met behulp van een magnetisch rek.
  14. Incubeer de IgG-gekoppelde magnetische parels in 500 μL koude MB-buffer met 1x protease- en fosfataseremmers gedurende 1 uur bij 4 °C bij rotatie bij 20 rpm. Gooi het supernatans van de kralen met behulp van een magnetisch rek.
  15. Meng de equilibrated magnetische parelslurry met het cellysaat en incubeer met rotatie bij 20 tpm gedurende 2 uur bij 4 °C.
  16. Breng de volledige magnetische bead-cell lysaatsuspensie over naar laagbindende reactiebuizen.
  17. Scheid de magnetische kralen, die nu de chromatineringen van belang dragen, van het cellysaat met behulp van een magnetisch rek.
  18. Breng de resterende doorstroming (FT) van elke buis over naar een verse conische buis van 15 ml en neem monsters voor DNA- (0,1%) en eiwitanalyse (0,05%). Bewaren bij −20 °C tot verdere verwerking (beschreven in rubriek 7).
  19. Hang de magnetische kralen aan elke buis in een koude MB-buffer van 300 μL en bundel de kralen in één reactiebuis. Was 5x gedurende 10 min elk met 750 μL koude MB-buffer met 1x protease- en fosfataseremmers bij 4 °C bij rotatie bij 20 rpm. Voer de laatste wasbeurt uit met 750 μL koude MB-buffer zonder protease- en fosfataseremmers.
  20. Suspendeer de korrels in 40 μL koude MB-buffer zonder protease- en fosfataseremmers.
    OPMERKING: Het uiteindelijke volume van het eluaat kan worden aangepast aan de verwachte stroomafwaartse toepassing. De TEV-elutie werkt meestal efficiënt binnen het bereik van 100-300 μL.

5. TEV-protease-gemedieerde elutie

  1. Om LexA-CBP-chromatineringcomplexen uit de korrels vrij te maken, incubeert u de korrels met 2 μL 6x His-gelabelde recombinante TEV-protease 's nachts bij 4 °C en 450 tpm in een thermomixer.
  2. Scheid de kralen van het uiteindelijke eluaat met behulp van een magnetisch rek. Breng het eluaat, dat gespleten chromatineringen bevat, over in een nieuwe reactiebuis van 1,5 ml.
  3. Bewaar de buisjes weer op een magnetisch rek om eventuele achtergebleven parels van het uiteindelijke eluaat te scheiden.
  4. Resuspendeer de korrels (TB) in 750 μL koude AC-buffer en neem monsters voor DNA- (0,1%) en eiwitanalyse (0,05%). Bewaren bij −20 °C tot verdere verwerking (beschreven in rubriek 7).
  5. Neem vanaf het uiteindelijke eluaat (TE) monsters voor DNA- (0,5%) en eiwitanalyse (0,25%). Bewaren bij −20 °C tot verdere verwerking (beschreven in rubriek 7).
    OPMERKING: Vanwege het lage volume van het uiteindelijke eluaat wordt het percentage van de monsters dat wordt verzameld voor DNA- en eiwitanalyse verhoogd om een betere weergave van hun eiwit- en DNA-gehalte tijdens de analyse te verkrijgen.

6. Denaturatie-elutie

  1. Was de korrels 2x in 750 μL koude AC-buffer gedurende 20 minuten telkens op 4 °C en draai om 20 toeren.
  2. Om de resterende gebonden LexA-chromatinecomplexen te extraheren, voert u denaturatie-elutie uit door 500 μL 0,5M NH4OH aan de korrels toe te voegen en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
  3. Scheid de parels van de suspensie met behulp van een magnetisch rek en breng het eluaat over naar een laagbindende reactiebuis.
  4. Incubeer de kralen opnieuw zoals in stap 6.2 om de maximale chromatineloci in het eluaat te herstellen.
  5. Scheid de kralen van de suspensie met behulp van een magnetisch rek en bundel het resulterende eluaat in dezelfde buis met het eluaat uit stap 6.3.
  6. Resuspendeer de korrels (DB) in 750 μldH2O en neem monsters voor DNA- (0,1%) en eiwitanalyse (0,05%).
  7. Neem vanaf het uiteindelijke eluaat (DE) monsters voor DNA- (0,5%) en eiwitanalyse (0,25%).

7. DNA- en eiwitanalyse

  1. DNA-analyse
    1. Voorbereiding van het monster
      1. Voeg aan de DNA-monsters 100 μL IRN-buffer toe en verhoog het volume met dH2O tot een eindvolume van 200 μL.
      2. Voeg 1 ng K071 spike-in plasmide-DNA toe.
      3. Voeg 1 μL RNAse A (10 mg/ml) toe en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
      4. Voeg 5 μl proteïnase K (10 mg/ml) en 10 μl SDS (20%) toe en incubeer gedurende 1 uur bij 56 °C.
      5. Voeg 200 μL fenol/chloroform/isopropylalcohol (25:24:1) toe en draai elke keer 2x gedurende 10 s grondig voor.
      6. Centrifugeer de monsters bij 21.130 × g gedurende 7 minuten om de organische en waterige fase te scheiden.
      7. Breng het supernatans over in nieuwe buisjes van 1,5 ml met 1,5 μl glycogeen (5 mg/ml) en 2,5x 100% ethanol.
      8. Incubeer de buisjes bij -20 °C gedurende minimaal 2 uur en maximaal een nacht om het DNA neer te slaan.
      9. Centrifugeer bij 21.130 × g, 4 °C gedurende 45 min. Gooi de supernatant weg.
      10. Voeg 150 μl 70% ethanol toe zonder de DNA-pellet te resuspenderen en centrifugeer opnieuw bij 21.130 × g bij 4 °C gedurende 10 min.
      11. Droog de DNA-pellets gedurende 10-15 minuten bij kamertemperatuur en resuspendeer in 40 μL dH2O.
      12. Voer restrictie-enzymvertering uit om het in stap 7.1.1.11 geïsoleerde DNA te lineariseren met HpaI-restrictie-endonuclease. Voor een reactiemengsel van 50 μl incubeer u 40 μl geïsoleerd DNA + 2 μl HpaI-enzym + 5 μl restrictie-enzymbuffer + 3 μldH2O 's nachts bij 37 °C.
    2. qPCR-analyse
      1. Verdun het met restrictie verteerde DNA in een verhouding van 1:5 (10 μl van het door restrictie verteerde DNA verkregen uit stap 7.1.1.12 in 40 μl dH2O).
      2. Gebruik primerparen die zijn ontworpen voor het ARS316-gebied, PDC1 en spike-in plasmide-DNA.
      3. Voer qPCR uit met behulp van het programma in tabel 2.
      4. Analyseer de qPCR-resultaten door relatieve kwantificering met behulp van de ARS316-regio en spike-in plasmide-DNA als doelen en PDC1 (of een ander gen of genomische regio) als referentielocus.
      5. Beoordeel het ARS316-locusherstelpercentage ten opzichte van PDC1 door de relatieve kwantificeringswaarden van de ARS316- en PDC1-primer te normaliseren met het percentage van het fractievolume dat voor elk monster is genomen. Vermenigvuldig bijvoorbeeld 0,1% voor de doorstroming met een factor 1.000 en 0,5% voor de TEV-eliculatie met een factor 200.
      6. Normaliseer de ARS316- en PDC1-herstelpercentages met de relatieve kwantificeringswaarden van het spike-in plasmide-DNA.
      7. Beoordeel de verrijking van de ARS316-locus over het totale chromatine door de verkregen relatieve kwantificeringsdoel-/referentiewaarden te evalueren met behulp van vergelijking (1).
        figure-protocol-1(1)
    3. Analyse van zuidelijke vlekken
      1. Voeg aan 20 μL restrictie-enzymverteerd DNA-monster 5 μL gelladende kleurstof toe.
      2. Laat de monsters ~3 uur in een 1% agarosegel bij 110 V lopen.
      3. Breng de gel over in een bakje en laat het 20 minuten weken in een depurinatieoplossing met zacht schudden.
      4. Spoel de gel af met dH2O en laat hem 15 minuten weken in een denaturatieoplossing door te schudden. Gooi de denaturatieoplossing weg.
      5. Week de gel 15 minuten in een denaturatieoplossing met zacht schudden.
      6. Spoel de gel af met dH2O, en was hem 2x gedurende 15 min telkens met de transferbuffer met zacht schudden.
      7. Vul een bak met 1-1,5 L transferbuffer en plaats deze op een stabiel platform.
      8. Knip een lang stuk Whatman-papier af en plaats het zo op het platform dat de twee uiteinden van het papier in de transferbuffer worden gedrenkt.
      9. Knip een strook positief nylon membraan en vier stroken Whatman-papier gelijk aan de grootte van de gel.
      10. Leg twee stukken Whatman-papier gedrenkt in de transferbuffer op het platform.
      11. Leg de gel met de bedrukte zijde naar beneden op de stukjes Whatman-papier.
      12. Plaats bovenop de gel het positieve nylonmembraan, gevolgd door de resterende twee stukken Whatman-papier gedrenkt in transferbuffer. Zorg ervoor dat je de stapel nat houdt met de transferbuffer.
      13. Verwijder eventuele ingesloten luchtbellen door ze af te rollen met behulp van een glazen staaf.
      14. Leg een stapel keukenpapier op de gemonteerde stapel, gevolgd door een voorwerp van 0,5 kg (bijv. een glazen fles).
      15. Laat het geheel een nacht op kamertemperatuur overbrengen.
      16. Na overdracht wordt het membraan met een totale energie-output van 1.200 J/cm2 met UV-crosslink verknoopt.
      17. Voor de detectie van de ARS316-locus voert u southern blot-hybridisatie uit met behulp van radioactieve sondes die zijn gesynthetiseerd met behulp van het DNA-labelsysteem waarnaar wordt verwezen.
        NOTITIE: Voer alle onderstaande stappen uit op ijs totdat anders vermeld.
      18. Verdun in een laagbindende reactiebuis 25-40 ng PCR-fragment (sonde) in 19 μL dH2O en incubeer gedurende 5 minuten bij 95 °C. Koel onmiddellijk af op ijs.
      19. Voeg 1 μL van 500 μM dCTP, 500 μM dGTP en 500 μM dTTP toe aan de buis.
      20. Voeg 20 μL van de buffer met willekeurige nucleotidehexameren toe die bij de kit is geleverd.
      21. Voeg 5 μL van het radioactief gelabelde nucleotide [α-32P] dATP toe aan de buis. Voer alle stappen uit met radioactief gelabeld materiaal onder een voor radioactiviteit goedgekeurde beschermende omgeving.
      22. Voeg 1 μL Klenow-fragment toe en incubeer bij 37 °C op een thermomixer gedurende 15 minuten voor enkelstrengs DNA-synthese.
      23. Voeg 5 μL stopbuffer toe om de reactie te stoppen.
      24. Centrifugeer een kolom met een maatuitsluiting gedurende 2 minuten bij 1.500 × g om de opslagbuffer te verwijderen. Gooi de doorstroming weg en plaats de kolom in een nieuwe buis.
      25. Haal het sondemengsel door de kolom om niet-opgenomen radioactieve nucleotiden te verwijderen. Centrifugeer gedurende 30 s bij 1.500 × g om de sonde op te vangen.
      26. Voeg 150 μL zalmsperma-DNA (1:100) toe om de niet-specifieke binding van de sonde aan het membraan te blokkeren.
      27. Incubeer het sondemengsel gedurende 5 minuten bij 95 °C om het dubbelstrengs DNA te denatureren.
      28. Vries een paar seconden in op ijs en centrifugeer een paar seconden op 500 × g om de waterdruppels die op het deksel zijn gecondenseerd naar beneden te halen.
      29. Was het zuidelijke blotmembraan kort met de hybridisatiebuffer gedurende 5-10 minuten met rotatie.
      30. Pre-hybridiseer het membraan met de hybridisatiebuffer gedurende 1 uur bij 55 °C met rotatie. Gooi de hybridisatiebuffer weg.
      31. Voeg 15 ml verse hybridisatiebuffer (voorverwarmd op 55 °C) toe aan het membraan samen met de voorbereide sonde. Incubeer het membraan een nacht bij 55 °C met rotatie.
      32. Voer na hybridisatie wasbeurten 2x gedurende 15 minuten uit met 0,3x SSC, 0,1% SDS bij 55 °C met rotatie.
      33. Voer na hybridisatie wasbeurten 2x gedurende 15 minuten uit met 0,1x SSC, 0,1% SDS bij 55 °C met rotatie.
      34. Voer na hybridisatie wasbeurten 2x gedurende 15 minuten uit met 0,1x SSC, 1,5% SDS bij 55 °C met rotatie.
      35. Verwijder het membraan van de hybridisatiebuis en stel het membraan maximaal 3 dagen bloot aan een fosforimagerscherm om de radioactieve afdrukken op de film te verkrijgen.
      36. Verkrijg beelden van de film met behulp van een fosforbeeldvormend laserscansysteem.
  2. Eiwit analyse
    1. Voorbereiding van het monster
      1. Pas alle eiwitmonsters aan hun uiteindelijke volume aan (200 μL, 100 μL, 100 μL, 20 μL en 20 μL voor respectievelijk het ruwe celextract, de invoer, de doorstroom, de korrels en de eluaatmonsters) door 1 μL β-mercaptoethanol, PAGE LDS-monsterbuffer (1x) en dH2O toe te voegen.
      2. Denatureer de monsters bij 95 °C gedurende 5 min.
    2. Analyse van de western blot
      OPMERKING: Voer SDS-PAGE en western blotting uit met behulp van standaardprotocollen15,16.
      1. Plaats 15 μL van elk monster in elk putje van een SDS-PAGE-gel van 1,5 mm.
      2. Voer immunokleuring van de blot uit met behulp van PAP- (1:2.000) en LexA-antilichamen (1:1.000) met nachtelijke incubatie bij 4 °C. Verdunnen in 5% droge melk/PBST-oplossing.
        OPMERKING: Na PAP-analyse kan de vlek worden gestript met behulp van een mild stripprotocol17 voorafgaand aan immunokleuring met het tweede LexA-antilichaam.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De zuivering van het ~1,4 kb ARS316 chromatinedomein werd gemedieerd door het constitutief tot expressie gebrachte LexA-TAP-adaptereiwit. Om als negatieve controle te dienen, voerden we zuiveringen uit met behulp van een isogene stam die LexA-TAP tot expressie brengt, maar geen geïntegreerde RS- en LexA-bindingsplaatsen bevat. Figuur 3 illustreert het resultaat van de DNA-analyse van een standaard zuiveringsexperiment dat is uitgevoerd op zowel de controlegroep als een recombinatiecompetente...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De identificatie van de factoren en het chromatinelandschap van een specifieke genomische doelregio blijft een grote uitdaging vormen in het chromatineonderzoek18. Dit protocol beschrijft een efficiënt systeem om specifiek verschillende chromatinedomeinen uit gistchromosomen te snijden en te zuiveren. Voor zover wij weten, overwinnen de zuiverheid en opbrengst van deze eenstapszuivering veel van de beperkingen van locusspecifieke chromatinezuiveringsmethoden, waardoor een zeer hoge verrijking van ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Het werk in het S.H.-laboratorium werd ondersteund door de DFG via SFB1064 (project-ID 213249687), de European Research Council (ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) en de Helmholtz Gesellschaft.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gistsoorten
Controlestam: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecRSectie 1, zie verwijzingen 13 en 14
Recombinatiestam: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecRSectie 1, zie verwijzing 13 en 14
Plasmid
K238 plasmidSectie 1, zie verwijzing 13
Opslag: Bewaren bij -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNASectie 7.1, zie verwijzing 13
Opslag: Bewaren bij -20 °C
Reagentia
AcetonCarl Roth5025.1Sectie 2
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Ammoniumacetaat (NH4Ac)Sigma AldrichA7262Sectie 6 en 7.1
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Ammoniumoplossing (NH4OH) 25%Merck Millipore533003Sectie 6
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
AmmoniumsulfaatSanta CruzSc-29085Sectie 2
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Bacto agarBD (VWR)90000-760Sectie 3
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Bacto peptonBD (VWR)211820Sectie 3
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
β-MercaptoethanolSigma Aldrich07604Sectie 7.2
Opslag: Bewaren bij 4 °C
Chemiluminescent substraatkitThermoFisher34580Sectie 7.2
Opslag: Bewaren bij 4 °C
DinatriumwaterstoffosfaatdodecahydraatMerck1.06579.1000Sectie 2 en 7.1
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Dithiothreitol (DTT)ThermoFisher15508013Sectie 4
Opslag: Bewaren bij 4 °C
EthanolMerck100983Sectie 7.1
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Sigma AldrichEDSectie 7.1
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Galactose (20% (w/v) stock)Sigma AldrichG0625-1KG  /  5KGSectie 3
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Gel laaddye (6x)BioLabsB7024ASectie 7.1
Opslag: Bewaren bij -20 °C
GlusoseSigma-AldrichG8270Sectie
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
GlycineCarl Roth.0079.4Sectie 2
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Glycogen (5 mg/mL)InvitrogenAM9510Sectie 7.1
Opslag: Bewaren bij -20 °C
Zoutzuur (HCl)PanReac AppliChem182109.1211Sectie 2, 4 en 7.1
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Magnesiumacetaat (MgAc)Bernd Kraft15274.2600/C035Sectie 4
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Magnesiumchloride (MgCl2)Sigma AldrichM8266Sectie 6
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Nu PAGE LDS sample buffer (4x)Invitrogen2399549Sectie 7.2
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Fenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v)Invitrogen15593-031Sectie 7.1
Opslag: Bewaren bij 4 °C
Kaliumchloride (KCl)SigmaP9541Sectie 4
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Radioactief gelabeld α-32P dATP (3.000 Ci/mmol, 10 mCi/mL)Hartmann AnalyticSRP-203Sectie 7.1
Opslag: Bewaren bij 4 °C
RadPrime labeling systeemThermoFisher18428-011Sectie 7.1
Opslag: Bewaren bij -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock)SERVA34140.03Sectie 3
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Natriumchloride (NaCl)MerckK53710504142Sectie 7.1
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Natriumcitraat (Na3C6H5O7)Sigma-Aldrich71402Sectie 7.1
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Natriumhydroxide (NaOH)Sigma AldrichS5881Sectie 7.1
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Natrium n-dodecylsulfaat (SDS) (5% stock (w/v) )Alfa AesarA11183Sectie 7.1
Opslag: Bewaren bij kamertemperatuur
Natriumfosfaat monobasischSigma-Aldrich71496Sectie 2 en 7.1

Referenties

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542(2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674(2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430(2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111(2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2(2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045(2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023).
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Nucleosoomkernpartikelprote ne DNA interactiesaffiniteitszuiveringisolatie met magnetische beadsnatief chromatinehistonmodificatiesDNA replicatie origins
Single-Copy Gene Locus Chromatine Zuivering in Saccharomyces cerevisiae
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.