Methoden voor elektroporatie en transformatie bevestiging in Limosilactobacillus reuteri DSM20016

Summary

Hier presenteren we protocollen voor het werken met Limosilactobacillus reuteri DSM20016, met details over groei, plasmidetransformatie, kolonie-PCR, fluorescerende reporter-eiwitmeting en beperkte plasmide mini-prep, evenals veelvoorkomende problemen en probleemoplossing. Deze protocollen maken het mogelijk om reportereiwitten in DSM20016 te meten, of bevestiging via kolonie-PCR als er geen reporter bij betrokken is.

Abstract

Lactobacillus was een ongelooflijk groot, divers geslacht van bacteriën bestaande uit 261 soorten, waarvan er verschillende commensale stammen waren met het potentieel voor gebruik als een chassis voor synthetische biologische inspanningen in het maagdarmkanaal. De grote fenotypische en genotypische variatie die binnen het geslacht werd waargenomen, leidde tot een recente herclassificatie en de introductie van 23 nieuwe geslachten.

Vanwege de breedte van de variaties binnen de oude geslachten, werken protocollen die in één lid worden gedemonstreerd mogelijk niet zoals geadverteerd met andere leden. Een gebrek aan gecentraliseerde informatie over hoe specifieke stammen precies moeten worden gemanipuleerd, heeft geleid tot een reeks ad-hocbenaderingen , vaak aangepast van andere bacteriële families. Dit kan de zaken bemoeilijken voor onderzoekers die in het veld beginnen, die misschien niet weten welke informatie wel of niet van toepassing is op de door hen gekozen soort.

In dit artikel willen we een reeks protocollen centraliseren met aantoonbaar succes, met name in de Limosilactobacillus reuteri-stamaanduiding F275 (andere verzamelnummers: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), samen met advies voor probleemoplossing en veelvoorkomende problemen die men kan tegenkomen. Deze protocollen moeten een onderzoeker met weinig tot geen ervaring met het werken met L. reuteri DSM20016 in staat stellen om een plasmide te transformeren, transformatie te bevestigen en systeemfeedback in een plaatlezer te meten via een reporter-eiwit.

Introduction

Het geslacht Lactobacillus werd historisch geclassificeerd als gram-positieve, staafvormige, niet-sporenvormende, ofwel facultatieve anaëroben of microaerofielen die suikers afbreken om voornamelijk melkzuur^{te produceren 1}. Deze losse criteria leidden ertoe dat Lactobacillus , fenotypisch en genotypisch, een zeer divers geslacht was. Deze brede indeling resulteerde in een herindeling van het geslacht, waarbij in 2020 23 nieuwe geslachten werden geïntroduceerd².

Het oude, bredere geslacht omvatte belangrijke commensale en probiotische soorten die over het algemeen als veilig worden beschouwd (GRAS) voor consumptie³. De Lactobacillaceae-familie handhaaft een publieke perceptie van 'goede bacteriën' vanwege de vele gerapporteerde gezondheidsvoordelen die worden toegekend via de consumptie van verschillende stammen 4,5,6,7. Het gemak waarmee ze door het maagdarmkanaal^{kunnen navigeren 8} en hun publieke acceptatie combineren om Lactobacillaceae-stammen te positioneren als sterke kandidaten als chassisorganismen voor inneembare medicinale, therapeutische of diagnostische toepassingen.

Het brede scala aan kenmerken binnen de Lactobacillaceae-familie heeft geleid tot een situatie waarin er geen de facto modelorganismestam is; Onderzoeksgroepen hebben de neiging om soorten te selecteren met de eigenschappen die het meest relevant zijn voor hun specifieke doelen. (Zuivelfermentatielaboratoria kunnen bijvoorbeeld L. lactis kiezen; studies van plantaardige fermentatie kunnen L. plantarum selecteren; onderzoek naar probiotica kan zich richten op L. acidophilus; enzovoort.)

Ditzelfde brede scala aan kenmerken tussen soorten heeft geleid tot een opeenstapeling van protocollen en procedures die goed kunnen werken voor één subset van de Lactobacillaceae-familie , maar optimalisatie vereisen om efficiënt te werken (of misschien überhaupt te functioneren) in andere⁹. Deze behoefte aan optimalisatie tussen familieleden en zelfs binnen leden van dezelfde soort kan de inspanningen van onbekende onderzoekers frustreren. Protocollen die in de methodensecties van papers worden gepubliceerd, kunnen ook hun eigen wijzigingen¹⁰ bevatten, wat leidt tot gefragmenteerde, gedecentraliseerde protocolverzamelingen.

L. reuteri wordt beschouwd als een op grote schaal gewervelde commensaal, consequent gevonden in zoogdieren, aviaire¹¹ en vis¹² gastro-intestinale (GI) kanalen. L. reuteri-substammen zijn vaak genetisch gespecialiseerd, via aanpassing van slijmadhesie-eiwitten, om specifieke inheemse gastheren permanenter te koloniseren 8,11,13. GI tract Limosilactobacillus soorten kunnen worden geïsoleerd in gastheren buiten hun inheemse gastheer, maar neigen meer naar een voorbijgaande aard⁸.

Vanwege de specialisatie tussen mens en gastheer positioneert L. reuteri zich DSM20016 zeer goed als een chassis voor diagnostische of therapeutische toepassingen op elk punt in het menselijke maagdarmkanaal, en de stam DSM20016 zou een langduriger effectvenster voor interventies kunnen bieden in vergelijking met meer voorbijgaande stammen.

In dit artikel schetsen we een reeks protocollen met aangetoonde effectiviteit in Limosilactobacillus reuteri (stamaanduiding: F275; andere verzamelnummers: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), samen met gecentraliseerde informatie over de stam uit andere bronnen om te helpen bij moleculaire en systeembiologische toepassingen. De hierin beschreven procedures moeten een onderzoeker zonder eerdere ervaring in staat stellen om L. reuteri te kweken, elektrocompetente voorraden te creëren, getransformeerde kolonies te selecteren, transformatie via koloniepolymerasekettingreactie (PCR) te bevestigen en ontworpen systeemrespons te meten via fluorescerende reportereiwitten.

We merken op dat gerelateerde protocollen betrekking hebben op CRISPR-Cas9 geassisteerde ssDNA-genoomrecombineering in L. reuteri (stam: ATCC-PTA-6475)14, en CRSIPR-Cas9 nickase-geassisteerde genoombewerking in meerdere niet-L. reuteri, Lactobacillaceae familie vlekken^15,16; deze gaan echter niet in op de L. reuteri DSM20016 stam die hier onze focus is.

Protocol

1. Prepareren van L. reuteri DSM20016 elektrocompetente cellen

OPMERKING: Dit is gebaseerd op een protocol van Berthier et ^al.17, met centrifugatiesnelheden geïnformeerd door Rattanachaikunsopon et al.¹⁸.

1. In een centrifugebuis van 50 ml ent u L. reuteri uit glycerolbouillon tot 6 ml deMan Rogosa Sharpe (MRS) bouillon. Incubeer aeroob gedurende een nacht bij 37 °C in een statische incubator.
2. De volgende ochtend ent u 4 ml van de nachtcultuur in 200 ml MRS-bouillon (1:50 verdunning).
3. Laat aeroob groeien in een statische incubator van 37 °C totdat de optische dichtheidswaarde van 600 nm (OD600) 0,5-0,85 bereikt; Dit duurt ongeveer 2-3 uur.
4. Zodra een adequate OD600-waarde is bereikt, decanteert u de media in centrifugebuizen van 50 ml en plaatst u deze op ijs terwijl u de buizen balanceert.
5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 5.000 x g in een voorgekoelde centrifuge van 4 °C.
6. Gooi het supernatant weg, resuspensie van elke pellet in 50 ml voorgekoeld (0 °C tot 4 °C) ddH₂O en centrifugeer opnieuw met dezelfde instellingen als de vorige stap. Houd de cellen zoveel mogelijk op ijs.
7. Herhaal stap 1.6.
8. Resuspendie van elke pellet in 25 ml ddH₂O: 0,5 M sucrose, 10% glycerol. Centrifugeer bij 5.000 x g bij 4 °C gedurende 10 min. Gooi het supernatant weg en leg de cellen terug op ijs.
9. Resuspensie van alle pellets in dezelfde 2 ml ddH₂O: 0,5 M sucrose, 10% glycerol.
10. Aliquot in porties van 50 μl tot 100 μl in voorgekoelde microcentrifugebuizen; bewaren bij -80 °C voor later gebruik.

2. Elektroporatie van L. reuteri

OPMERKING: Vermijd pipetteren zoveel mogelijk in de volgende stappen. Opname van een controle-elektroporatie, zonder toevoeging van plasmide, wordt geadviseerd om ervoor te zorgen dat de antibioticaselectie voldoende is.

1. Neem een hele elektrocompetente L. reuteri aliquot en ontdooi deze op ijs.
2. Meng voorzichtig 5 μL tot 10 μL plasmide (uiteindelijke plasmideconcentratie >6 nM) in het ontdooide aliquot, waarbij pipetteren zoveel mogelijk wordt vermeden.
3. Breng over in een ijsgekoelde, 1 mm gap elektroporatiecuvette.
4. Elektroporaat bij 1,25 kV, 400 Ω en 25 μF.
5. Voeg 1 ml MRS-bouillon op kamertemperatuur (RT) toe en meng door de cuvette een of twee keer om te keren.
6. Plaats de cuvetten gedurende 2,5-3 uur in een statische incubator bij 37 °C om herstel mogelijk te maken.
7. Plak de volledige hoeveelheid op meerdere MRS-agarplaten met de juiste selectie.
8. Plaats de platen in een volledig luchtdichte container met een kleine brandende kaars ("theelicht") en een anaeroob atmosfeergenererend sachet.
9. Groei bij 37 °C gedurende 2-3 dagen of totdat zichtbare kolonies aanwezig zijn.

3. Meting van het zuurbestendige fluorescerende reportereiwit mCherry2

1. Kies alle kolonies die nodig zijn voor meting en ent in een 96-well opslagmicroplaat met 1,5 ml filter gesteriliseerde (niet-geautoclaveerde) MRS-bouillon per put en een geschikt selectieantibioticum.
2. Incubeer aeroob gedurende 24 uur 's nachts bij 37 °C zonder te schudden.
   OPMERKING: Deze opslagmicroplaat moet worden bewaard voor gebruik in sectie 4 (kolonie-PCR).
3. L. reuteri zal in de stationaire fase uit de media neerslaan; resuspensie van de nachtcultuur via pipetteren.
4. Breng 200 μL over in een vlakke plaat met 96 putten met een vlakke bodem, breng de plaat over naar een plaatlezer en meet de OD en fluorescentie van mCherry2 (excitatie [Ex]: 589 nm; emissie [Em]: 610 nm) of andere relevante verslaggevers.

4. Bevestiging van plasmideopname via kolonie-PCR

1. Breng van de 96-well opslagmicroplaat uit sectie 3 5 μL over naar een PCR-buis.
   OPMERKING: Als >5 minuten zijn verstreken, kan het nodig zijn om de L. reuteri een tweede keer te resuspenseren.
2. In een draagbare tafelmicrocentrifuge, draai naar beneden totdat de pellet zichtbaar is (ongeveer 2 min bij 2.000 x g), gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 20 μL van 20 mM NaOH.
3. Kook bij 95 °C gedurende 5 min, vortex, en herhaal de kook een tweede keer.
4. Koel de monsters onmiddellijk af; probeer de monsters zoveel mogelijk op ijs te houden in de volgende stappen om de kans op sjabloondegradatie en PCR-remming te verkleinen.
5. Draai in een draagbare tafelmicrocentrifuge op 2.000 x g gedurende 2 minuten totdat het celafval is gepelletiseerd, neem dan 1 μL van het supernatant en verdun tot 99 μL ijskoude DNase- en RNase-vrije ddH₂O (100x verdunning).
6. Gebruik de 100x-verdunning als sjabloon-DNA in een standaard PCR-reactie met plasmide-specifieke primers. Neem een positieve controle op met een plasmide afgeleid van de E. coli mini-prep.
7. Breng de monsters terug op ijs en voeg een geschikte ladingkleurstof toe in een concentratie van 1x.
8. Voer 1% agarosegel in TAE-buffer (tris-acetaat-ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA]) in bij 110 V gedurende 30 minuten. Afbeelding indien nodig.

5. Mini-prep protocol voor L. reuteri , gevolgd door PCR om de aanwezigheid van plasmide te bevestigen

OPMERKING: Protocol bedoeld voor gebruik met de minivoorbereidingskit die wordt vermeld in de materiaaltabel.

1. Ent L. reuteri in 10 ml MRS-bouillon met een geschikt antibioticum en incubeer 's nachts aeroob bij 37 °C in een statische incubator.
2. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 5.000 x g in een voorgekoelde centrifuge van 4 °C.
3. Was de pellet in 2 ml standaard P1-buffer (meegeleverd met de kit) om de zuurgraad te verminderen die latere stappen kan verstoren, centrifugeer met dezelfde instelling als eerder beschreven en gooi het supernatant weg.
4. Resuspendeer de pellet in 250 μL gemodificeerde P1-buffer met 10 mg/ml lysozym en 100 E/ml mutanolysine om bacteriële cellen te lyseren. Incubeer gedurende 1-2 uur bij 37 °C.
5. Voeg 250 μL buffer P2 toe, meng door vier tot zes keer om te keren en incubeer bij RT gedurende niet langer dan 5 minuten.
6. Voeg 350 μL buffer N3 toe (meegeleverd met de kit) en keer onmiddellijk vier tot zes keer voorzichtig om om te mengen.
7. Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 10 min.
8. Breng zoveel mogelijk supernatant over in een spinkolom en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 60 s. Gooi de stroom door.
9. Was de centrifugeerkolom met 500 μL buffer PB (meegeleverd met de kit) en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 60 s. Gooi de stroom door.
10. Was de centrifugeerkolom met 750 μL buffer PE (meegeleverd met de kit) en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 60 s. Gooi de stroom door en centrifugeer gedurende 60 s om eventuele resterende buffer te verwijderen.
11. Plaats de spinkolom in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Breng 20-30 μL DNAse- en RNAse-vrije ddH 2 O aan op het filter van de spinkolom en laat_1-2minuten staan, voordat u gedurende 60 s centrifugeert bij 10.000 x g .
12. Voer een standaard PCR-reactie uit met behulp van plasmide-specifieke primers (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA), waarbij eluaat het sjabloon-DNA levert. Neem een positieve controle op met een plasmide afgeleid van de E. coli mini-prep.
    OPMERKING: De PCR-instellingen die in dit onderzoek worden gebruikt, zijn: 98 °C gedurende 5 min, (98 °C gedurende 30 s, 55 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 45 s) 30 cycli, 72 °C gedurende 2 minuten, 4 °C vasthouden. De parameters zijn sterk afhankelijk van het gebruikte polymerase, de fragmentlengte en de exacte primers die worden gebruikt door elke persoon die dit protocol gebruikt.

Results

Efficiëntie van transformatie
L. reuteri vereist geen dcm-/moeder- ^{niet-gemethyleerd} plasmide, zoals waargenomen voor andere Lactobacillaceae^19,20 (zie figuur 1). Elektroporatie van L. reuteri DSM20016 met 10 μL van de 8,5 kb plasmide pTRKH3_mCherry2 (pAMβ1 theta oorsprong van replicatie) zou transformatie-efficiënties moeten geven van ongeveer 80 kolonievormende ee...

Discussion

De meest kritieke stap voor de transformatie van L. reuteri DSM20016 is het genereren van anaërobe groeiomstandigheden nadat transformaties zijn verguld; kolonies die in aerobe omstandigheden zijn opgedaan, zijn slechts zeer incidenteel en groeien over het algemeen niet wanneer ze worden ingeënt in MRS-bouillon. Het beplaten van het volledige herstelvolume moet ook worden geoefend om de kans op koloniegroei te maximaliseren. Zelfs met deze twee kritieke stappen is transformatie-efficiëntie nog steeds een beperki...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	NEB	N3200L
1mL Spectrophotometer cuvettes	Thomas Scientific	1145J12
Agarose	BioShop	AGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)	Beckman Allegra	N/A	Niet langer in productie
AnaeroGen 2.5 L Sachet	Thermo Scientific	OXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation system	VWR	58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)	FroggaBio	TB50-500
DNA gel x6 loading dye	NEB	B7024S
Electroporation cuvette	Fisherbrand	FB101
Erythromycin	Millipore Sigma	E5389-5G
Gel electroporation bath/dock	VWR	76314-748
Glycerol	BioShop	GLY001
Limosilactobacillus reuteri	Leibniz Institute DSMZ	DSM20016	Strain aanduiding F275
Lysozyme	BioShop	LYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)	FroggaBio	LMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)	Qiagen	27106	slpGFP vervangen door constitutief, codon geoptimaliseerd, mCherry2 reportereiwit
MRS Broth (Dehydrated)	Thermo Scientific	CM0359B
Mutanolysin	Millipore Sigma	M9901-5KU
NaOH	Millipore Sigma	1064691000
P100 Pipette	Eppendorf	3123000047
P1000 Pipette	Eppendorf	3123000063
P2.5 Pipette	Eppendorf	3123000012
P20 Pipette	Eppendorf	3123000039
P200 Pipette	Eppendorf	3123000055
PCR tubes	FroggaBio	STF-A120S
Personal benchtop microcentrifuge	Genlantis	E200100
Petri dishes	VWR	25384-088
PTC-150 Thermal Cycler	MJ Research	N/A	Niet langer in productie
pTRKH3_slpGFP (modified)	Addgene	27168
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-281700
Storage microplate	Fisher Scientific	14-222-225
Sucrose	BioShop	SUC507
TAE Buffer 50x	Thermo Scientific	B49
Vortex	VWR	58816-121	Niet langer in productie
VWR 1500E incubator	VWR	N/A	Niet langer in productie