Uitlijning van gesynchroniseerde tijdreeksgegevens met behulp van het karakteriserende Loss of Cell Cycle Synchrony Model voor vergelijkingen tussen experimenten

Summary

Een uitdaging bij het analyseren van gesynchroniseerde tijdreeksexperimenten is dat de experimenten vaak verschillen in de duur van het herstel van synchronie en de celcyclusperiode. De metingen van verschillende experimenten kunnen dus niet in geaggregeerde vorm worden geanalyseerd of gemakkelijk worden vergeleken. Hier beschrijven we een methode voor het afstemmen van experimenten om fasespecifieke vergelijkingen mogelijk te maken.

Abstract

Het onderzoeken van de celcyclus hangt vaak af van het synchroniseren van celpopulaties om verschillende parameters in een tijdreeks te meten terwijl de cellen de celcyclus doorkruisen. Zelfs onder vergelijkbare omstandigheden vertonen replicatie-experimenten echter verschillen in de tijd die nodig is om te herstellen van synchronisatie en om de celcyclus te doorlopen, waardoor directe vergelijkingen op elk tijdstip worden voorkomen. Het probleem van het vergelijken van dynamische metingen tussen experimenten wordt verergerd in mutante populaties of in alternatieve groeiomstandigheden die de synchrone hersteltijd en / of de celcyclusperiode beïnvloeden.

We hebben eerder een parametrisch wiskundig model gepubliceerd met de naam Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) dat monitort hoe synchrone populaties van cellen vrijkomen uit synchronisatie en door de celcyclus gaan. De geleerde parameters uit het model kunnen vervolgens worden gebruikt om experimentele tijdpunten van gesynchroniseerde tijdreeksexperimenten om te zetten in een genormaliseerde tijdschaal (levenslijnpunten). In plaats van de verstreken tijd in minuten vanaf het begin van het experiment weer te geven, vertegenwoordigt de levenslijnschaal de progressie van synchronie naar celcyclusinvoer en vervolgens door de fasen van de celcyclus. Omdat levenslijnpunten overeenkomen met de fase van de gemiddelde cel binnen de gesynchroniseerde populatie, maakt deze genormaliseerde tijdschaal directe vergelijkingen tussen experimenten mogelijk, inclusief die met verschillende perioden en hersteltijden. Bovendien is het model gebruikt om celcyclusexperimenten tussen verschillende soorten (bijv. Saccharomyces cerevisiae en Schizosaccharomyces pombe) op elkaar af te stemmen, waardoor directe vergelijking van celcyclusmetingen mogelijk is, die evolutionaire overeenkomsten en verschillen kunnen onthullen.

Introduction

Tijdreeksmetingen op gesynchroniseerde populaties van cellen terwijl ze door de celcyclus gaan, is een standaardmethode voor het onderzoeken van de mechanismen die de progressie van de celcyclus regelen 1,2,3,4,5,6,7,8 . De mogelijkheid om vergelijkingen te maken tussen synchrone /release tijdreeksexperimenten is van vitaal belang voor ons begrip van deze dynamische processen. Het gebruik van replicatie-....

Protocol

1. Verzamelen van celcyclusfase en experimentele gegevens

1. Synchroniseer de cellen met betrekking tot de celcyclus met behulp van de gewenste synchronisatiemethode (bijv. centrifugale elutriatie zoals beschreven in Leman et al.18 of paringsferomoonstilstand zoals beschreven in Rosebrock 19; zowel Leman et ^al.18 als Rosebrock¹⁹ bevatten ook methoden voor het vrijkomen van synchronie). Begin met het bemonsteren van de hele tijdreeks, zorg ervoor dat de tijdreeks ten minste twee volledige celcyclusperioden lang is en verzamel optimaal ten minste 10 mo....

Results

De stappen beschreven in het bovenstaande protocol en in de workflow in figuur 1 werden toegepast op vijf celcyclus gesynchroniseerde tijdreeksexperimenten om twee representatieve vergelijkingen aan te tonen: tussen replicaties met verschillende synchronisatiemethoden (paringsferomoon en centrifugale elutriatie¹⁸) en sequencingplatforms (RNA-sequencing [RNA-seq] en microarray), evenals tussen experimentele omstandigheden. Meerdere experimenten werden uitgevoerd met

Discussion

Dit artikel presenteert een methode voor het nauwkeuriger en kwantitatief beoordelen van gegevens uit tijdreeksexperimenten op gesynchroniseerde populaties van cellen. De methode maakt gebruik van geleerde parameters van CLOCCS, een Bayesiaans inferentiemodel dat gebruik maakt van input cel-cyclus fasegegevens, zoals ontluikende gegevens en flow-cytometrische DNA-inhoudsgegevens, om elk experiment te parametriseren^14,15. CLOCCS gebruikt de invoercelcyclusfasegege.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x PBS			Voor fixeeroplossing. Beschreven in Leman 2014.
4% formaldehyde			Voor fixeeroplossing.
100% Ethanol			Voor flow cytometry fixatie. Beschreven in Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer			Voor flow cytometry protocol.
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope			Voor het tellen van cellen en knoppen.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Protease oplossing			Voor flow cytometry protocol. Beschreven in Haase 2002.
RNAse A oplossing			Voor flow cytometry protocol. Beschreven in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	Voor flow cytometry kleuring. Beschreven in Haase 2002.
Tris			pH 7.5