Methodenartikel

Uitlijning van gesynchroniseerde tijdreeksgegevens met behulp van het karakteriserende Loss of Cell Cycle Synchrony Model voor vergelijkingen tussen experimenten

DOI:

10.3791/65466

⸱

9 juni 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Duke University, 2Department of Biology, University of Massachusetts, 3Orlando Data Science LLC, 4Department of Computer Science, Duke University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een uitdaging bij het analyseren van gesynchroniseerde tijdreeksexperimenten is dat de experimenten vaak verschillen in de duur van het herstel van synchronie en de celcyclusperiode. De metingen van verschillende experimenten kunnen dus niet in geaggregeerde vorm worden geanalyseerd of gemakkelijk worden vergeleken. Hier beschrijven we een methode voor het afstemmen van experimenten om fasespecifieke vergelijkingen mogelijk te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeken van de celcyclus hangt vaak af van het synchroniseren van celpopulaties om verschillende parameters in een tijdreeks te meten terwijl de cellen de celcyclus doorkruisen. Zelfs onder vergelijkbare omstandigheden vertonen replicatie-experimenten echter verschillen in de tijd die nodig is om te herstellen van synchronisatie en om de celcyclus te doorlopen, waardoor directe vergelijkingen op elk tijdstip worden voorkomen. Het probleem van het vergelijken van dynamische metingen tussen experimenten wordt verergerd in mutante populaties of in alternatieve groeiomstandigheden die de synchrone hersteltijd en / of de celcyclusperiode beïnvloeden.

We hebben eerder een parametrisch wiskundig model gepubliceerd met de naam Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) dat monitort hoe synchrone populaties van cellen vrijkomen uit synchronisatie en door de celcyclus gaan. De geleerde parameters uit het model kunnen vervolgens worden gebruikt om experimentele tijdpunten van gesynchroniseerde tijdreeksexperimenten om te zetten in een genormaliseerde tijdschaal (levenslijnpunten). In plaats van de verstreken tijd in minuten vanaf het begin van het experiment weer te geven, vertegenwoordigt de levenslijnschaal de progressie van synchronie naar celcyclusinvoer en vervolgens door de fasen van de celcyclus. Omdat levenslijnpunten overeenkomen met de fase van de gemiddelde cel binnen de gesynchroniseerde populatie, maakt deze genormaliseerde tijdschaal directe vergelijkingen tussen experimenten mogelijk, inclusief die met verschillende perioden en hersteltijden. Bovendien is het model gebruikt om celcyclusexperimenten tussen verschillende soorten (bijv. Saccharomyces cerevisiae en Schizosaccharomyces pombe) op elkaar af te stemmen, waardoor directe vergelijking van celcyclusmetingen mogelijk is, die evolutionaire overeenkomsten en verschillen kunnen onthullen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tijdreeksmetingen op gesynchroniseerde populaties van cellen terwijl ze door de celcyclus gaan, is een standaardmethode voor het onderzoeken van de mechanismen die de progressie van de celcyclus regelen 1,2,3,4,5,6,7,8 . De mogelijkheid om vergelijkingen te maken tussen synchrone /release tijdreeksexperimenten is van vitaal belang voor ons begrip van deze dynamische processen. Het gebruik van replicatie-experimenten om bevindingen te bevestigen kan het vertrouwen in de reproduceerbaarheid van de conclusies vergroten. Bovendien kunnen vergelijkingen tussen omgevingsomstandigheden, tussen mutanten en zelfs tussen soorten veel nieuwe inzichten in celcyclusregulatie opleveren. Interexperimentele variabiliteit in het herstel van synchronisatie en in de snelheid van celcyclusprogressie schaadt echter het vermogen om tijd-punt-tot-tijd-puntvergelijkingen te maken tussen replicaten of tussen experimenten met veranderde celcyclustiming. Vanwege deze uitdagingen worden replicaties vaak niet opgenomen voor de volledige tijdreeks (bijv. Spellman et al.4). Wanneer replicaties voor de hele tijdreeks worden verzameld, kunnen de gegevens niet in geaggregeerde vorm worden geanalyseerd, maar wordt een enkele replicatie gebruikt voor analyse en andere replicaties worden vaak gedegradeerd tot aanvullende cijfers (bijv. Orlando et al.8). Bovendien zijn vergelijkingen tussen experimenten met verschillende herstel- of celcyclusprogressiekenmerken moeilijk. De metingen van kleinere intervallen tussen een gebeurtenis van belang en een oriëntatiepunt in de celcyclus (bijvoorbeeld knopopkomst, S-fase-invoer of begin van de anafase) kunnen helpen fouten te verminderen als deze oriëntatiepuntgebeurtenissen 1,2,3,9,10,11,12 worden bijgehouden. Subtiele maar belangrijke verschillen kunnen echter onopgemerkt blijven of worden verdoezeld met behulp van deze ad-hocmethoden. Ten slotte maken eencellige analyses het mogelijk om de progressie van de celcyclus te analyseren zonder te vertrouwen op synchronisatie of uitlijning13, hoewel grootschalige metingen in eencellige studies een uitdaging en duur kunnen zijn.

Om deze moeilijkheden te overwinnen, hebben we het Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) -model ontwikkeld om de analyse van tijdreeksmetingen op gesynchroniseerde populaties14,15 te ondersteunen. CLOCCS is een flexibel wiskundig model dat de verdeling van gesynchroniseerde cellen over celcyclusfasen beschrijft terwijl ze worden vrijgegeven van synchronisatie en door de celcyclus gaan. Het vertakkingsprocesraamwerk stelt het model in staat om rekening te houden met de asymmetrische eigenschappen van moeder- en dochtercellen na deling, zoals waargenomen in S. cerevisiae, terwijl het nog steeds nuttig is voor organismen die delen door splijting, zoals S. pombe. Het model kan input nemen van een diverse reeks meettypen om de celcyclusfase te specificeren. Het kan ontluikende celcyclusfasegegevens opnemen, waaronder metingen van het percentage gebudded cellen in de loop van de tijd, waardoor het aantal cellen buiten de ongebudde G1-fase14,15 kan worden geschat. Het model kan ook flowcytometrische gegevens opnemen die het DNA-gehalte meten, waardoor de beoordeling van historische overgangen van G1 naar S, S naar G2 en M naar G115 mogelijk is. Fluorescerende morfologische markers kunnen ook worden gebruikt om de celcyclusfase te identificeren. De fluorescerende etikettering van myosineringen, kernen en spindelpoollichamen (SPB's) kan worden gebruikt om de celcyclusfase te bepalen, en deze werden opgenomen in het CLOCCS-model11; Deze metingen worden echter niet beschreven in dit Protocol. Daarnaast werd de septatie-index gebruikt als input voor het modelleren van gegevens van S. pombe14. Zo kan het model worden gebruikt voor celcyclusanalyses in verschillende organismen en kan het verder worden uitgebreid.

CLOCCS is een parametrisch model dat de volledige Bayesiaanse gevolgtrekking van meerdere parameters uit de invoergegevens mogelijk maakt (bijv. Ontluikingspercentage, DNA-gehalte). Deze parameters omvatten de hersteltijd van synchronisatie, de lengte van de celcyclusperiode (afzonderlijk geschat voor moeder- en dochtercellen) en de gemiddelde celcycluspositie van de cellen op elk tijdstip. Deze parameters vertegenwoordigen het gedrag van de gemiddelde cel in de populatie, waardoor de onderzoeker elk tijdpunt in kaart kan brengen naar een celcycluspositie uitgedrukt als een levenslijnpunt. De omzetting naar levenslijnpunten is afhankelijk van de CLOCCS-parameters lambda (λ) en mu0 (μ0)14,15. De parameter λ komt overeen met de gemiddelde celcyclusperiode van de moedercellen. Vanwege de moeder-dochtervertraging14,15 is dit echter niet de gemiddelde celcyclusperiode van de volledige populatie die zowel de moeder- als de dochtercellen omvat. CLOCCS leidt bovendien de parameterdelta (δ) af, die overeenkomt met de moeder-dochtervertraging en dus de berekening van de gemiddelde celcyclusperiode van de volledige populatie mogelijk maakt. Ten slotte, omdat elk experiment begint na het vrijgeven van celcyclussynchronisatie, wordt de tijd die nodig is om te herstellen van de synchronisatiemethode weergegeven door de CLOCCS-parameter μ0. CLOCCS past een model aan op de invoercelcyclusfasegegevens en leidt deze parameters vervolgens af met behulp van een willekeurige wandeling Markov-keten Monte Carlo-algoritme14,15. Door meerdere experimenten in kaart te brengen op een gemeenschappelijke celcycluslevenslijntijdschaal, kunnen directe fasespecifieke vergelijkingen worden gemaakt tussen replicaties of experimenten waarbij de hersteltijd of celcyclusperioden niet identiek zijn 8,14,15.

Aangezien gesynchroniseerde populaties in de loop van de tijdreeks14,15,16,17 synchronie verliezen, kan variabiliteit in de snelheid van synchroniteitsverlies ook kwantitatieve vergelijkingen tussen experimenten belemmeren. Door de locatie van populaties en de variantie in hun verdelingen te identificeren, verklaart CLOCCS verschillen in percentages van synchroniteitsverlies. Deze krachtige tool maakt specifieke en gedetailleerde vergelijkingen tussen experimenten mogelijk, waardoor het mogelijk is om direct relevante vergelijkingen te maken, niet alleen tussen replicaties, maar ook tussen omgevingsomstandigheden, mutanten en zelfs soorten met een dramatisch verschillende celcyclustiming14,15.

Dit artikel beschrijft een methode die CLOCCS gebruikt om parameters te schatten door gegevens uit synchrone/releasetijdreeksexperimenten aan te passen, de gegevens toe te wijzen aan een gemeenschappelijke levenslijnschaal en vervolgens relevante vergelijkingen te maken tussen replicaties of experimenten. Lifeline-uitlijning maakt directe fasespecifieke vergelijkingen tussen deze experimenten mogelijk, wat de aggregatie en vergelijking van replicaties mogelijk maakt en relevantere vergelijkingen maakt tussen experimenten met verschillende hersteltijden en celcyclusperioden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Verzamelen van celcyclusfase en experimentele gegevens

  1. Synchroniseer de cellen met betrekking tot de celcyclus met behulp van de gewenste synchronisatiemethode (bijv. centrifugale elutriatie zoals beschreven in Leman et al.18 of paringsferomoonstilstand zoals beschreven in Rosebrock 19; zowel Leman et al.18 als Rosebrock19 bevatten ook methoden voor het vrijkomen van synchronie). Begin met het bemonsteren van de hele tijdreeks, zorg ervoor dat de tijdreeks ten minste twee volledige celcyclusperioden lang is en verzamel optimaal ten minste 10 monsters per celcyclus. Verzamel op elk tijdstip een monster voor gegevens over de celcyclusfase (ontluiking of flowcytometrie) en een monster voor experimentele gegevens, zoals hieronder beschreven.
  2. Als u ontluikende gegevens gebruikt als de celcyclusfasegegevens, verzamel dan gegevens over ontluiking voor de CLOCCS-uitlijning.
    1. Monster door de tijdreeks. Verzamel voor elk tijdstip cellen en fixeer ze door 200 μL gesonificeerde celcultuur te mengen met 200 μL fixatieve oplossing, zoals beschreven in Leman et al.18.
    2. Tel voor standaard ontluiking ten minste 200 cellen per tijdspunt met behulp van een doorgelaten lichtmicroscoop met een 40x-objectief en een hemocytometer. Voeg het celmonster van stap 1.2.1 toe aan de hemocytometer en verdun als de dichtheid het tellen verhindert. Noteer het aantal gebudded en unbudded cellen op elk tijdstip. Bereken het percentage budded cellen en plot voor elk tijdspunt in een ontluikende curve.
      OPMERKING: Er zijn andere methoden beschikbaar voor het specificeren van de informatie over de celcyclusfase, maar deze worden niet beschreven in dit protocol. De andere methoden worden beschreven in de CLOCCS readme en in een eerder werk11.
  3. Als u flowcytometrische DNA-inhoudsgegevens gebruikt als de celcyclusfasegegevens, verzamelt u flowcytometrie-DNA-kleuringsgegevens voor de flow-cytometrische CLOCCS-uitlijning.
    1. Monster door de tijdreeks. Verzamel voor elk tijdstip cellen en repareer ze zoals beschreven in Haase en Reed20.
    2. Kleuring het DNA en analyseer met behulp van standaard flowcytometrische analyse. Een aanbevolen kleuringsprotocol voor S. cerevisiae wordt beschreven in Haase en Reed20.
  4. Verzamel geassocieerde omics of gerelateerde experimentele gegevens. Voor standaard transcriptomische gegevens, verzamel zoals beschreven in Leman et al.18 en Kelliher et al.21,22. Zorg ervoor dat de gegevens zijn gekoppeld aan tijdpunten die celcyclusfasegegevens bevatten om stroomafwaartse uitlijning mogelijk te maken. Voor een optimale uitlijning moet u ervoor zorgen dat aan elk tijdstip met experimentele gegevens ook fasegegevens zijn gekoppeld.
    OPMERKING: De experimentele gegevens kunnen vele vormen aannemen. Traditioneel gebruiken we de uitgelijnde methode die wordt beschreven voor het uitlijnen van transcriptomische experimenten met tijdreeksen. Elk type gegevens dat is gekoppeld aan tijdpunten kan echter worden uitgelijnd (d.w.z. proteomics22).

2. De vereiste software installeren

OPMERKING: In dit gedeelte wordt ervan uitgegaan dat Conda, Java 19 en Git al zijn geïnstalleerd (Materiaalopgave).

  1. Download de CLOCCS_alignment repo door de volgende opdracht in de terminal in te voeren:
    git kloon git kloon https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
  2. Maak een Conda-omgeving met het bestand conda_req.yml door de volgende opdracht in te voeren in de terminal in de map waarin de CLOCCS_alignment repo is gekloond:
    conda env create -f conda_req.yml

3. CLOCCS gebruiken om de experimenten te parametriseren

  1. Dubbelklik op het cloccs_v2023.jar bestand in de map CLOCCS in de CLOCCS_alignment repo en wacht tot een grafische gebruikersinterface wordt geopend. Dit scherm maakt het mogelijk om opties in te voeren voor de CLOCCS-run en geeft de resultaten weer zodra deze zijn uitgevoerd.
  2. Voer de algemene instellingen in.
    1. Stel Sim Anneal, Burn In en Iteraties in door de bijbehorende tekstinvoervakken in te typen. Sim Anneal (gesimuleerd gloeien) identificeert goede startparameterwaarden, Burn In zoekt naar posterieure modi en de laatste fase maakt het mogelijk om alle posterieure gevolgtrekkingen te trekken. Hogere waarden verhogen de looptijd, maar verhogen ook de nauwkeurigheid.
    2. Voer de experimentele omstandigheden in door de temperatuur in Celsius en de synchronisatiemethode op te geven met behulp van het tekstvak Temperatuur en het vervolgkeuzemenu Synchro. Methode, respectievelijk.
    3. Configureer desgewenst de geavanceerde instellingen in het menu Geavanceerde instellingen. Met de geavanceerde instellingen kunnen priors worden ingesteld voor elk van de parameters ("mu0", "sigma0", "sigmav", "lambda", "bud.start", "bud.end").
      OPMERKING: Meer informatie over de geavanceerde instellingen is te vinden in het leesmij.txt in de map CLOCCS van de CLOCCS_alignment repo.
  3. Voer de instellingen in voor gebruik met de ontluikende gegevens.
    1. Kies de juiste selectie in het vervolgkeuzemenu Modeltype . De standaardoptie Bud is voor standaard ontluikende informatie voor ontluikende gist.
      OPMERKING: Andere meer geavanceerde opties bestaan ook in het vervolgkeuzemenu: Mutant voor ontluikende informatie voor mutanten die meerdere ontluikende cycli zonder deling ondergaan, BudSSLSMR voor ontluikende informatie en aanvullende spindelpoollichaam- en myosineringinformatie, en BudNucDivNeck voor ontluikende informatie en aanvullende informatie over delende en knophalskernen. Deze geavanceerde opties worden beschreven in het CLOCCS readme en in eerder werk11,14,15.
    2. Importeer de gegevens met behulp van het deelvenster Gegevensimport door in de tekstinvoervakken te typen of door een bestand te uploaden door op de knop Bestand selecteren te klikken. In de eerste kolom worden de tijdstippen aangegeven. De overige twee kolommen geven de ontluikende gegevens op en kunnen een van de volgende opties gebruiken: het aantal niet-toegewezen cellen (Geen knop), het aantal gekoppelde cellen (Bud) of het totale aantal cellen (Totaal).
  4. Voer de instellingen in voor gebruik met de flowcytometrische gegevens. Voer voor elk experiment stap 3.3 of stap 3.4 uit.
    OPMERKING: Flowcytometrische gegevens en ontluikende gegevens kunnen samen worden gebruikt. Hoewel we eerder beschreven dat we ze samen15 uitvoeren, moeten ze voor deze tool onafhankelijk worden uitgevoerd en vervolgens worden vergeleken.
    1. Converteer de .fcs-bestanden naar het juiste CLOCCS-invoerformaat voor flowcytometrie door de instructies in Supplemental File 1 te volgen (ook te vinden in de CLOCCS_alignment repo als CLOCCS/flow_cytometry_conversion_instructions.txt).
    2. Selecteer de stroomselectie in het vervolgkeuzemenu Modeltype .
    3. Importeer de gegevens via het deelvenster Gegevens importeren. Klik op Bestand selecteren en selecteer het bestand dat is gegenereerd in stap 3.4.1.
    4. Selecteer de tijdpunten waarvoor een flowcytometrische CLOCCS-fit moet worden uitgezet door de tijdpunten te selecteren in het vak Tijden voor passen .
  5. Zodra alle ingangen zijn geselecteerd voor ontluikings- of flowcytometrie, klikt u op de knop Toepassen en klikt u vervolgens op de knop Voorbeeld boven aan het scherm.
  6. Bekijk de ontluikende curve of flowcytometrieplots met de voorspelde pasvormen door het tabblad Voorspelde pasvormen te selecteren. Dit tabblad wordt standaard direct na de vorige stap geopend.
  7. Bekijk de parameterhistogrammen voor elke parameter door het tabblad Parameter Histogrammen te selecteren en vervolgens het subtabblad te selecteren dat overeenkomt met de parameter van belang uit de volgende opties: mu0, delta, sigma0, sigmav, lambda, bud.start, bud.end, enz.
  8. Bekijk de achterste scoregrafiek door het tabblad Posterieure score te selecteren.
  9. Bekijk de instellingen en wijzig ze verder door het tabblad Instellingen te selecteren; bekijk het logboek van de vorige uitvoeringen door het tabblad Logboek te selecteren.
  10. Haal de CLOCCS-parameters op uit de pasvorm door het tabblad Posterieure parameters te selecteren. De resulterende tabel heeft de volgende vorm: elke rij bestaat uit een parameter, waarbij de laatste rij de achterste is. De kolommen bestaan uit de voorspelde parameter voor het gemiddelde, het 2,5% lagere betrouwbaarheidsinterval, het 97,5% bovenste betrouwbaarheidsinterval en de acceptatiegraad.
    1. Noteer de parameters die voor de uitlijning voor elk experiment worden gebruikt: de hersteltijd van synchronisatie (μ0) en de gemiddelde celcyclusperiode van de moedercellen (λ).
    2. Bereken de celcyclusperiode door het gemiddelde van de moedercelperiode (λ) en de dochtercelperiode (λ + δ) te berekenen, waarbij δ de dochterspecifieke vertraging is.
      OPMERKING: Herhaal sectie 3 met alle experimenten die in de vergelijkingen moeten worden opgenomen.

4. Conversie van tijdpunten naar levenslijnpunten met behulp van de Python-conversiefuncties en de CLOCCS-parameters

OPMERKING: Voor conversie tussen tijdpunten en levenslijnpunten zijn twee conversieformulesvereist 21. Een Python-implementatie voor conversie en gegevensvisualisatie is beschikbaar in de CLOCCS_alignment repo en wordt hieronder beschreven.

  1. Activeer de Conda-omgeving door het volgende commando in de terminal in te voeren: conda activate CLOCCS_alignment
  2. Open een interactief Python-notitieblok door de volgende opdracht in de terminal te typen: jupyter-notitieblok
  3. Maak een nieuw Python-notitieblok in de gewenste map.
    OPMERKING: Er is een voorbeeld van een notitieblok opgenomen om het standaardgebruik te demonstreren en is te vinden in Alignment/JOVE_example.ipynb in de CLOCCS_ alignment repo.
  4. Importeer het Python-bestand met de uitlijningsfuncties door de volgende opdracht in de eerste cel uit te voeren:
    %voeren path_to_repo/cloccs_alignment/Uitlijning/hulpprogramma's uit.py
    1. Vervang het pad naar de CLOCCS_alignment repo door path_to_repo.
  5. Als u ontluikende gegevens gebruikt als de celcyclusfasegegevens, importeert u een gegevensframe met het percentage dat op elk tijdstip is toegewezen door de volgende opdracht in een nieuwe cel uit te voeren:
    budding_df = pd.read_csv("path_to_folder/budding_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Vervang het juiste bestandspad en de juiste bestandsnaam. Als het bestand een .csv bestand is, verwijdert u sep ="\t"
  6. Als u ontluikende gegevens gebruikt als de celcyclusfasegegevens, lijnt u de ontluikende gegevens uit op een tijdschaal van een levenslijnpunt door de volgende functie in een nieuwe cel in te voeren:
    aligned_budding_df = df_conversion_from_parameters(budding_df, tijdpunten, param_mu0, param_lambda)
    1. Voor tijdspunten vervangt u een lijst met de tijdpunten door de index van het budding_df gegevensframe.
    2. Vervang voor param_mu0 en param_lambda de geleerde parameters van de ontluikende CLOCCS-run in sectie 3 voor het experiment.
  7. Als u flowcytometriegegevens gebruikt, importeert u de flowcytometriegegevens door de volgende opdracht in een nieuwe cel uit te voeren:
    flow_samples = flow_cytometry_import(flow_input_folder)
    1. Vervang voor flow_input_folder het juiste pad naar de map met de fcs-bestanden met flowcytometrie.
  8. Als u flowcytometriegegevens gebruikt, genereert u een conversietabel tussen de tijdpunten en levenslijnpunten voor elk experiment door de volgende opdracht in een nieuwe cel te typen:
    flow_converter = convert_tp_to_ll(tijdspunten, param_mu0, param_lambda)
    1. Vervang voor tijdspunten een lijst met de tijdpunten uit de flowcytometriegegevens.
    2. Vervang voor param_mu0 en param_lambda de geleerde parameters uit de flowcytometrie die CLOCCS in sectie 3 uitvoert voor het experiment.
  9. Importeer het gegevensframe met de experimentele gegevens in het notitieblok door de volgende opdracht in een nieuwe cel uit te voeren:
    data_df = pd.read_csv("path_to_folder/exp_data_filename.tsv", sep ="\t", index_col=0)
    1. Vervang het juiste bestandspad en de juiste bestandsnaam. Als het bestand een .csv bestand is, verwijdert u sep ="\t".
      OPMERKING: Dit kan worden gedaan voor alle tabelgegevens. De experimentele gegevens moeten alleen de tijdpunten hebben als de kolommen of de index van het gegevensframe. Voorbeeldgegevens zijn te vinden in de CLOCCS_alignment repo.
  10. Lijn de experimentele gegevens uit op een tijdschaal van een levenslijnpunt door de volgende functie in een nieuwe cel in te voeren:
    lifeline_aligned_df = df_conversion_from_parameters(data_df, timepoints, param_mu0, param_lambda, interpoleren, lowerll, upperll)
    1. Voor tijdspunten vervangt u een lijst met de tijdpunten als de index of de kolommen van de experimentele data_df uit de vorige stap.
    2. Vervang voor param_mu0 en param_lambda de waarden die in rubriek 3 van CLOCCS zijn verkregen.
      OPMERKING: De parameters kunnen afkomstig zijn van elke CLOCCS-uitvoering die wordt uitgevoerd op een van de geaccepteerde gegevenstypen voor de celcyclusfase.
    3. U kunt desgewenst interpoleren door Waar of Onwaar of leeg laten (de standaardwaarde is Onwaar).
      OPMERKING: Wanneer dit is ingesteld op Onwaar, worden de gegevens niet geïnterpoleerd. Wanneer dit is ingesteld op Waar, worden de levenslijnpunten afgerond en geïnterpoleerd om de waarden tussen de levenslijnpunten in te vullen, zodat er een punt per geheel getal is in het bereik van de levenslijnpunten. Dit maakt een betere vergelijking tussen datasets mogelijk.
    4. U kunt desgewenst lowerll en upperll vervangen door Geen of gehele getallen.
      OPMERKING: Wanneer ingesteld op Geen, worden alle levenslijnpunten na interpolatie bewaard. Wanneer gehele getallen worden opgegeven, worden de gegevens afgekapt, zodat de levenslijnpunten variëren van de lowerll tot de upperll. Dit maakt vergelijking mogelijk tussen datasets met een andere lowerll of upperll.
  11. Download de op de levenslijn uitgelijnde gegevensset door de volgende opdracht in een nieuwe cel in te voeren: lifeline_aligned_df.to_csv("path_to_desired_location/name_of_file.tsv", sep = "\t")
  12. Herhaal stap 4.5-4.11 met alle experimenten die in de vergelijkingen moeten worden opgenomen.

5. Ontluikende curven en flowcytometriegegevens vergelijken

  1. Plot de ontluikende curven voorafgaand aan de uitlijning met behulp van de python-hulpprogramma'sfunctie door de volgende opdracht in een nieuwe cel in te voeren:
    plot_budding_curves(list_of_budding_curves, list_for_legend = leg_list, point_type = str_type, titel = str_title)
    1. Vervang een lijst met de gegevensframes van alle gewenste ontluikende curven voor het plotten voor list_of_budding_curves-[bud_df1, bud_df2, bud_df3].
    2. Vervang indien gewenst een lijst met de labels voor de legenda - [Experiment 1, Experiment 2, Mutant] voor leg_list. Zo niet, sluit dan Geen uit of vervang er geen.
    3. Vervang tijd voor str_type.
    4. Vervang desgewenst een tekenreekstitel Vergelijking Budding Curves voor str_title. Zo niet, vervang dan Geen, of sluit uit.
  2. Plot de ontluikende curven na uitlijning met behulp van de python-hulpprogramma'sfunctie door de instructies in stap 5.1 te volgen, maar met een lijst met uitgelijnde ontluikende curven vervangen door list_of_budding_curves en met levenslijn voor point_type in plaats van tijd.
  3. Om de flowcytometriegegevens te plotten, plot u de bijbehorende gegevens uit de FCS-bestanden op de overeenkomstige levenslijnpunten met behulp van de converter die in stap 4.8 is gegenereerd.
  4. Converteer de levenslijnpunten naar de celcyclusfase met behulp van de convertertabel (tabel 1).
    OPMERKING: Dit kan ook worden uitgezet door de instructies in stap 5.1 te volgen, maar met fase voor point_type in plaats van tijd.

6. Vergelijking van de experimentele gegevens

  1. Bepaal de genenlijst die in de lijngrafieken moet worden uitgezet op basis van literatuurinformatie of de genen die van belang zijn voor het onderzoek.
  2. Gebruik de meegeleverde plot_linegraph_comparison in het bestand met Python-hulpprogramma's om lijngrafiekvergelijkingen uit te voeren op het oorspronkelijke, uitgelijnde of uitgelijnde en geïnterpoleerde gegevensframe door de volgende opdracht in een nieuwe cel te typen:
    plot_linegraph_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, point_type = str_type, titel = str_title)
    1. Vervang een lijst met de gegevensframes van de experimenten die moeten worden vergeleken voor list_of_dfs.
      OPMERKING: De gegevensframes kunnen niet worden uitgelijnd of uitgelijnd. De overeenkomstige point_type moet echter worden ingevoerd in stap 6.2.4.
    2. Vervang een lijst met de titels voor elk gegevensframe in dezelfde volgorde als de lijst met gegevensframes voor list_for_legend.
    3. Vervang een lijst met de gennamen (die moeten worden opgenomen in de index van de gegevensframes) die moeten worden uitgezet voor genelist.
    4. Vervang het punttype door str_type. Gebruik levenslijn (de standaardwaarde is levenslijnpuntschaal) of fase (de levenslijnschaal van de celcyclusfase) voor de uitgelijnde gegevensframes in stap 6.2.1 of tijd voor de niet-uitgelijnde gegevensframes in stap 6.2.1.
    5. Vervang een optionele tekenreekstitel door str_title.
  3. Bepaal de genenlijst die moet worden opgenomen in de heatmap met behulp van de literatuur of algoritmen om de belangrijkste periodieke genen te bepalen.
    OPMERKING: Voor een goede heatmapvergelijking moeten de gegevens worden uitgelijnd, geïnterpoleerd en aangepast in stap 6.2; Het moet voor elk experiment dezelfde begin- en eindwaarde voor de levenslijn hebben.
    1. Voer periodiciteitsalgoritmen uit om de hoogste periodieke genen23,24 te bepalen, of gebruik de gewenste alternatieve methoden om de genenlijst te bepalen (d.w.z. literatuurresultaten).
    2. Importeer een .csv- of .tsv-genenlijstbestand in het notitieblok met de volgende opdracht in een nieuwe cel:
      sort_df = pd.read_csv("path_to_folder/sorting_filename.tsv", sep="\t", index_col=0)
    3. Vervang het juiste bestandspad en de juiste bestandsnaam. Als het bestand een .csv bestand is, verwijdert u sep="\t".
  4. Gebruik de meegeleverde functie plot_heatmap_comparison in het bestand Python-hulpprogramma's om een heatmapvergelijking uit te voeren op het uitgelijnde, geïnterpoleerde en fase-uitgelijnde gegevensframe door de volgende opdracht in een nieuwe cel te typen:
    plot_heatmap_comparison(list_of_dfs, list_for_legend, genelist, titel = str_title)
    1. Vervang een lijst met de uitgelijnde gegevensframes van de experimenten die moeten worden vergeleken voor list_of_dfs.
    2. Vervang een lijst met de titels voor elk gegevensframe in dezelfde volgorde als de lijst met gegevensframes voor list_for_legend.
    3. Vervang een lijst met de gennamen (die moeten worden opgenomen in de index van de gegevensframes) die moeten worden uitgezet voor genelist.
    4. Vervang een optionele tekenreekstitel door str_title.
      OPMERKING: Het eerste gegevensframe in de lijst is het frame dat zal worden gebruikt voor het ordenen van de genen in de heatmap. De genen worden geordend met het maximum in de eerste periode voor dat gegevensframe en dezelfde volgorde wordt gebruikt voor de volgende gegevensframes in de lijst.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De stappen beschreven in het bovenstaande protocol en in de workflow in figuur 1 werden toegepast op vijf celcyclus gesynchroniseerde tijdreeksexperimenten om twee representatieve vergelijkingen aan te tonen: tussen replicaties met verschillende synchronisatiemethoden (paringsferomoon en centrifugale elutriatie18) en sequencingplatforms (RNA-sequencing [RNA-seq] en microarray), evenals tussen experimentele omstandigheden. Meerdere experimenten werden uitgevoerd met

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel presenteert een methode voor het nauwkeuriger en kwantitatief beoordelen van gegevens uit tijdreeksexperimenten op gesynchroniseerde populaties van cellen. De methode maakt gebruik van geleerde parameters van CLOCCS, een Bayesiaans inferentiemodel dat gebruik maakt van input cel-cyclus fasegegevens, zoals ontluikende gegevens en flow-cytometrische DNA-inhoudsgegevens, om elk experiment te parametriseren14,15. CLOCCS gebruikt de invoercelcyclusfasegege...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. Campione en S. Haase werden ondersteund door financiering van de National Science Foundation (DMS-1839288) en de National Institutes of Health (5R01GM126555). Daarnaast willen de auteurs Huarui Zhou (Duke University) bedanken voor het commentaar op het manuscript en voor het bètatesten van het protocol. We bedanken ook Francis Motta (Florida Atlantic University) en Joshua Robinson voor hun hulp met de Java-code.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2x PBSVoor fixeeroplossing. Beschreven in Leman 2014.
4% formaldehydeVoor fixeeroplossing.
100% EthanolVoor flow cytometry fixatie. Beschreven in Haase 2002.
CLOCCShttps://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow CytometerVoor flow cytometry protocol.
Githttps://git-scm.com/
Java 19https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
MicroscopeVoor het tellen van cellen en knoppen.
Minicondahttps://docs.conda.io/en/latest/
Protease oplossingVoor flow cytometry protocol. Beschreven in Haase 2002.
RNAse A oplossingVoor flow cytometry protocol. Beschreven in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid StainInvitrogenS7020Voor flow cytometry kleuring. Beschreven in Haase 2002.
TrispH 7.5

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
  2. Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
  3. Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
  4. Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
  5. Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
  6. Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
  7. Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
  8. Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
  9. Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
  10. Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
  11. Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
  12. Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
  13. Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
  14. Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
  15. Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
  16. Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
  17. Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
  18. Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
  19. Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
  20. Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
  21. Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453(2016).
  22. Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
  23. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  24. Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
  25. Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tijdserie uitlijningLifeline normalisatieVergelijking tussen experimentenGesynchroniseerde celpopulatiesCelcyclusfaseFlowcytometrieBuddinggistTranscriptomische gegevensProteomische gegevens

Gerelateerde artikelen