Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Grootschalige celproductie op basis van GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65469

⸱

7 juli 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, 2Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om de grootschalige productie van aanhangende cellen te bereiken via een volledig gesloten systeem op basis van GMP-kwaliteit oplosbare microdragers. De kweek van menselijke mesenchymale stamcellen, HEK293T cellen en Vero-cellen werd gevalideerd en voldeed aan zowel de kwantiteitseisen als de kwaliteitscriteria voor de cel- en gentherapie-industrie.

Samenvatting

Onderzoekers in de cel- en gentherapie-industrie (CGT) staan al lang voor een formidabele uitdaging bij het efficiënt en op grote schaal uitbreiden van cellen. Om de belangrijkste tekortkomingen van het tweedimensionale (2D) vlakke kweeksysteem aan te pakken, hebben we op innovatieve wijze een geautomatiseerd platform voor gesloten celproductie op industriële schaal (ACISCP) ontwikkeld op basis van een GMP-kwaliteit, oplosbare en poreuze microdrager voor de 3D-kweek van aanhangende cellen, waaronder menselijke mesenchymale stam-/stromale cellen (hMSC's), HEK293T cellen en Vero-cellen. Om grootschalige expansie te bereiken, werd een tweetraps expansie uitgevoerd met 5 L en 15 L geroerde tank bioreactoren om 1,1 x 1010 hMSC's op te leveren met een totale 128-voudige expansie binnen 9 dagen. De cellen werden geoogst door de microdragers volledig op te lossen, geconcentreerd, gewassen en geformuleerd met een celverwerkingssysteem op basis van een continue stroomcentrifuge, en vervolgens gealiquoteerd met een celvulsysteem. Vergeleken met 2D-vlakcultuur zijn er geen significante verschillen in de kwaliteit van hMSC's die uit 3D-cultuur worden geoogst. We hebben deze oplosbare poreuze microdragers ook toegepast op andere populaire celtypen in de CGT-sector; in het bijzonder zijn HEK293T cellen en Vero-cellen gekweekt tot piekceldichtheden van respectievelijk 1,68 x 10 7 cellen/ml en 1,08 x 107 cellen/ml. Deze studie biedt een protocol voor het gebruik van een bioprocestechnologieplatform dat gebruik maakt van de kenmerken van oplosbare microcarriers van GMP-kwaliteit en geavanceerde gesloten apparatuur om de productie van aanhangende cellen op industriële schaal te bereiken.

Inleiding

De CGT-industrie is de afgelopen twee decennia getuige geweest van een exponentiële expansie. Verwacht wordt dat de evolutie van geneesmiddelen van de volgende generatie tal van refractaire ziekten zal behandelen en genezen1. Sinds de eerste goedkeuring door de Food and Drug Administration (FDA) van een CGT-product, Kymriah, in 2017, is CGT-gerelateerd onderzoek en ontwikkeling in de wereld in een snel tempo blijven groeien, waarbij de FDA actieve aanvragen voor nieuwe geneesmiddelen voor CGT zag toenemen tot 500 in 20182. Er was voorspeld dat het aantal goedkeuringen van CGT-producten in de Verenigde Staten tegen 2030 waarschijnlijk 54-74 zal zijn2.

Hoewel de snelle groei in CGT-onderzoek en -innovatie opwindend is, is er nog steeds een grote technologische kloof tussen laboratoriumonderzoek en productie op industriële schaal die deze veelbelovende geneesmiddelen zou kunnen leveren om zoveel patiënten te bereiken als nodig is tegen betaalbare kosten. De huidige processen die voor deze klinische proeven zijn toegepast, zijn vastgesteld in laboratoria voor kleinschalige experimenten, en er zijn aanzienlijke inspanningen nodig om de CGT-productie te verbeteren en te innoveren3. Er zijn veel soorten CGT-producten, de meeste gebaseerd op levende cellen, die allogeen, autoloog, gemanipuleerd of natuurlijk kunnen zijn. Deze levende geneesmiddelen zijn veel complexer dan kleine moleculaire entiteiten of biologische geneesmiddelen, waardoor grootschalige productie een grote uitdaging is 4,5,6. In dit werk demonstreren we een grootschalig celproductieprotocol voor drie ankerplaatsafhankelijke cellen die op grote schaal worden toegepast in CGT's. Deze omvatten menselijke mesenchymale stam-/stromale cellen (hMSC's), die zijn gebruikt voor celgebaseerde therapie, en HEK293T cellen en Vero-cellen, die beide worden gebruikt om virussen te produceren voor de genetische manipulatie van het uiteindelijke therapeutische celproduct. Verankeringsafhankelijke cellen worden gewoonlijk gekweekt op vlakke systemen, die handmatige verwerking vereisen. Handmatige kweekmethoden vereisen echter een aanzienlijke hoeveelheid arbeid en zijn vatbaar voor contaminatie, wat de kwaliteit van het eindproduct in gevaar kan brengen. Bovendien is er geen in-line procescontrole, wat leidt tot aanzienlijke variabiliteit in kwaliteit tussen batches7. Als we stamceltherapie als voorbeeld nemen, met een veelbelovende pijplijn van meer dan 200 kandidaten voor stamceltherapie, wordt geschat dat er 300 biljoen hMSC's per jaar nodig zouden zijn om aan de eisen van klinische toepassingen te voldoen8. Daarom is de grootschalige productie van therapeutische cellen een voorwaarde geworden om deze therapeutische interventies uit te voeren met zo'n hogecelvraag9.

Om de tegenslagen van vlakke systemen te voorkomen, zijn inspanningen geleverd om grootschalige productieprocessen te ontwikkelen in bioreactoren met geroerde tanks met conventionele niet-oplosbare microcarriers10,11,12,13, maar deze hebben te lijden onder ingewikkelde bereidingsprocedures en een lage efficiëntie bij het oogsten vancellen14. Onlangs hebben we een oplosbare microdrager voor stamcelexpansie geïnnoveerd, met als doel de uitdagingen van het oogsten van cellen van conventionele niet-oplosbare commerciële microdragers te omzeilen15. Deze nieuwe, in de handel verkrijgbare 3D-oplosbare poreuze microdrager van GMP-kwaliteit, 3D TableTrix, heeft een groot potentieel getoond voor grootschalige celproductie. Inderdaad, 3D-kweek op basis van deze poreuze microdragers zou mogelijk gunstige biomimetische micro-omgevingen kunnen nabootsen om celadhesie, proliferatie, migratie en activering te bevorderen16. De poreuze structuren en onderling verbonden poriënnetwerken van microdragers kunnen een groter celadhesiegebied creëren en de uitwisseling van zuurstof, voedingsstoffen en metabolieten bevorderen, waardoor een optimaal substraat ontstaat voor in vitro celexpansie17. De hoge porositeit van deze GMP-grade 3D oplosbare poreuze microdragers maakt grootschalige expansie van hMSC's mogelijk, en het vermogen om de cellen volledig op te lossen maakt het mogelijk om deze geëxpandeerde cellen efficiënt te oogsten18. Het is ook een product van GMP-kwaliteit en is geregistreerd als farmaceutische hulpstof bij het Chinese Center for Drug Evaluation (indieningsnummers: F20210000003 en F20200000496)19 en de FDA van de Verenigde Staten (FDA, VS; Drug Master Dossiernummer: 35481)20.

Hier illustreren we een geautomatiseerd gesloten systeem voor celproductie op industriële schaal (ACISCP)18 met behulp van deze dispergeerbare en oplosbare poreuze microdragers voor hMSC-, HEK293T- en Vero-celexpansie. We bereikten een succesvolle tweeledige uitbreiding van hMSC's (128 cumulatieve vouwexpansie in 9 dagen) van een 5 L bioreactor naar een 15 L bioreactor en verkregen uiteindelijk tot 1,1 x 1010 hMSC's uit een enkele batch productie. De cellen werden geoogst door de microdragers volledig op te lossen, geconcentreerd, gewassen en geformuleerd met een celverwerkingssysteem op basis van een continue stroomcentrifuge, en vervolgens gealiquoteerd met een celvulsysteem. Verder hebben we de kwaliteit van hMSC-producten beoordeeld om de naleving te bevestigen. We demonstreerden ook de toepassing van deze oplosbare microcarriers voor de opgeschaalde productie van twee andere typen ankercellen, HEK293T cellen en Vero-cellen, die op grote schaal worden toegepast in de CGT-industrie. De piekceldichtheid van HEK293T cellen bereikte 1,68 x 10 7 cellen/ml, terwijl de piekdichtheid van Vero-cellen 1,08 x 107 cellen/ml bereikte. Het ACISCP-systeem zou kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan aanhangende cellen te kweken, en het zou mogelijk een krachtig platform kunnen worden dat bijdraagt aan het versnellen van de industrialisatie van CGT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De menselijke navelstreng werd verkregen uit het Beijing Tsinghua Changgeng Hospital. Alle procedures en protocollen met betrekking tot het verwerven, isoleren en kweken van mesenchymale stamcellen uit de navelstreng (UCMSC's) werden uitgevoerd met geïnformeerde toestemming en met goedkeuring van de ethische commissie van het Beijing Tsinghua Changgeng Hospital (dossiernummer 22035-4-02), en de procedures en protocollen voldeden aan de Verklaring van Helsinki van 1964 en de latere wijzigingen ervan of vergelijkbare ethische normen.

1. Monolaagcultuur van hMSC's, HEK293T-cellen en Vero-cellen

  1. Isoleer primaire menselijke UCMSC's uit Wharton's jelly volgens de gerapporteerde methode21. Gebruik serumvrij (SF) hMSC-kweekmedium voor de isolatie en uitgroei van primaire UCMSC's, oogst de cellen bij passage 2 en cryopreserve als een hoofdcelbank (MCB).
  2. Inoculeer 6 x 10 5 menselijke UCMSC's (bij voorkeur passage 2 ofpassage 3 cellen) in één T75-kolf (d.w.z. de zaaidichtheid op 2D-vlakke vaten is 8.000 cellen/cm2) voor monolaagkweek met 15 ml compleet SF hMSC-kweekmedium. Zorg voor een gelijkmatige zaaiing door middel van een achtvormige beweging van de kolf. Kweek bij 37 °C in een incubator voor 5% CO2 -celculturen tot 80%-90% confluentie.
  3. Om te oogsten, decanteert u het celkweekmedium en spoelt u de cellen twee keer met 3-5 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg vervolgens 2 ml 0,25% trypsine-EDTA toe en incubeer bij 37 °C gedurende 1-2 minuten totdat de meeste cellen rond zijn geworden en zijn losgekomen van de kolf, zoals waargenomen onder een omgekeerde helderveldmicroscoop met een 4x objectief. Voeg 3 ml SF hMSC-kweekmedium toe om de spijsvertering te beëindigen.
  4. Breng de celsuspensie over in een conische centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten op 179 x g . Decanteer de supernatant, spoel de celpellet twee keer met PBS en resuspendeer in ongeveer 3-5 ml SF hMSC-kweekmedium voor zaaien tot microcarriers in bioreactoren.
    OPMERKING: Controleer de levensvatbaarheid van de cel en zorg ervoor dat de cellen >90% levensvatbaar zijn. Bereid de cellen pas voor nadat al het voorbereidende werk voor de bioreactoren is voltooid (stappen 2.1-3.6).
  5. Voor de monolaagkweek van HEK293T cellen en Vero-cellen, inoculeer met 2 x 10 6-3 x 106 cellen in elke T75-kolf en kweek met DMEM dat respectievelijk 10% foetaal runderserum (FBS) en 10% serum van pasgeboren kalveren (NBS) bevat.
  6. Volg stap 1.3-1.4 voor het oogsten van de cellen. Resuspendeer in 3-5 ml DMEM met 10% FBS.

2. Voorbereiding van de bioreactor met geroerde tank vóór het zaaien van cellen

  1. Spoel op dag −1 het glazen vat eenmaal grondig af met stromend gedeïoniseerd (DI) water.
  2. Demonteer alle roestvrijstalen buizen en waaiers van de kopplaat, dompel ze onder in DI-water en sonificeer gedurende 1 uur met een ultrasone reiniger op 40 kHz en 60 °C om grondig schoon te maken.
    OPMERKING: De voorbereidingen en procedures zullen hetzelfde zijn voor eerstelijnsexpansie in de 5 L-bioreactor en de tweedelijnsexpansie in de 15 L-bioreactor. De parameters voor de 15 L bioreactor staan overal tussen haakjes. Als er geen parameters tussen haakjes worden vermeld, zijn deze parameters dezelfde voor de bioreactoren van 5 L en 15 L.
  3. Controleer zorgvuldig of alle O-ringen intact en op hun plaats zitten en monteer vervolgens de gedemonteerde onderdelen terug op de kopplaat volgens de instructies van de fabrikant.
    NOTITIE: Vervang indien nodig versleten of gescheurde O-ringen voor montage. Versleten O-ringen brengen de luchtdichtheid en daarmee de steriliteit van het vat in gevaar.
  4. Voeg 7 L (18 L voor de 15 L bioreactor) 0,5 M NaOH-oplossing toe aan het vat van 5 L en plaats de kopplaat met de buizen gemonteerd op de rand van het vat om de buizen onder te dompelen in de NaOH-oplossing. Laat het 12 uur of een nacht staan om endotoxinen uit de buizen en het glazen vat te verwijderen.
    NOTITIE: Overschrijd niet meer dan 7 L (18 L), aangezien dit het maximale volume is van het glazen vat van 5 L (15 L). Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen bij het hanteren van de NaOH-oplossing, aangezien deze corrosief is.
  5. Verwijder de kopplaat en decanteer de NaOH-oplossing in een goede afvalfles. Gooi weg volgens de veiligheidsvoorschriften van het laboratorium. Spoel het vat, de kopplaat en de onderdelen ervan grondig af met endotoxinevrij DI-water of water voor injectie om alkalisch achtergebleven water te verwijderen.
  6. Voeg 2 L (5 L) PBS toe aan het vat, zet alle onderdelen weer in elkaar en schroef de kopplaat vast aan het metalen frame van het vat volgens de instructies van de fabrikant.
  7. Monteer een verbruiksartikel voor gesloten systemen op de juiste roestvrijstalen (SS) onderdelen/buizen/poorten op de kopplaat volgens de instructies van de fabrikant. Klem alle Robert klemmen op de buizen, en versterking door klemmen met hemostaten wordt aanbevolen. Laat een van de buizen, met aan het uiteinde een ontluchtingsfilter van 0,22 μm dat op de condensor is aangesloten, los.
    NOTITIE: Schuif de siliconenslangen op de uiteinden op de hemostaten om te voorkomen dat u de siliconenslangen doorboort. Klem alleen op de siliconen slangen en vermijd het vastklemmen van de C-flex buizen die in deze set zitten. Door één buis op de condensor niet vast te klemmen, kan de druk tijdens het autoclaveren worden ontlast.
  8. Bereid 250 ml 0,1 M NaOH-oplossing in een autoclaveerbare GL 45 glazen fles van 500 ml en monteer deze met een GL 45 Multiport Connector schroefdop met twee poorten. Sluit een 180 mm lange, 0.13 inch x 0.25 inch (binnendiameter x buitendiameter) siliconenslang aan op een van de poorten aan de onderkant van de dop; De lengte moet lang genoeg zijn om net de bodem van de fles te raken.
  9. Sluit een ander stuk siliconenslang, met een lengte van 500 mm langer dan de vorige, aan op dezelfde poort aan de bovenkant van de dop en sluit het andere uiteinde aan op een druppeltoevoerpoort op de kopplaat van het vat van 5 liter. Sluit een ontluchtingsfilter van 0.22 μm aan op de andere poort op de schroefdop.
  10. Voer een tweepuntskalibratie uit op de pH-sonde volgens de instructies van de fabrikant. Steek vervolgens de pH-sondes, de opgeloste zuurstof (DO) en de sondes voor het aantal levende cellen in het vat in de daarvoor bestemde PG13,5-poorten en schroef ze stevig op de kopplaat.
  11. Voer een luchtdichtheidscontrole uit van het volledig gemonteerde vat volgens de instructies van de fabrikant. Houd een druk van 0.4 bar ± 0.01 bar aan gedurende ten minste 30 min. Laat de druk langzaam ontsnappen nadat het systeem de test heeft doorstaan. Als de luchtdichtheidstest mislukt, zoek dan zorgvuldig naar lekpunten en versterk de vatconstructie.
  12. Autoclaaf het volledig geassembleerde vat met de verbruiksset bij 15 psi en 121 °C gedurende 60 minuten. Controleer na het autoclaveren alle ontluchtingsfilters om er zeker van te zijn dat ze intact en droog zijn. Verwijder alle hemostaten.
    NOTITIE: Een natteluchtfilter filtert het gas niet efficiënt en kan de steriliteit van het vat tijdens de celkweek in gevaar brengen. Vervang de ontluchtingsfilters als ze nat zijn en autoclaaf het hele vat opnieuw.
  13. Breng het geautoclaveerde vat over naar een cleanroom en wacht tot het volledig is afgekoeld tot kamertemperatuur. Steek de temperatuursonde in de thermowell-buis en sluit de kabels voor de motor, pH-sonde en DO-sonde van de controller aan op de respectievelijke onderdelen op het vat. Wikkel de warmtemat strak om het vat.
  14. Maak de Robert-klemmen los op de flexibele buizen op de uitlaatgascondensor, ringsparger, druppeltoevoerpoort voor NaOH en luchtoverlaypoort. Schakel de controller in, log in en voer de parameters in tabel 1 in het systeem in volgens de instructies van de fabrikant. Deze buisjes mogen op geen enkel moment tijdens het kweekproces worden vastgeklemd.
  15. Klik op Start en geef het experiment een naam om de bioreactor te starten. Laat de bioreactor ten minste 12 uur of een nacht op deze instellingen draaien om de PBS met zuurstof te verzadigen om later een eenpuntskalibratie voor de DO-sonde uit te voeren.
  16. Kalibreer de vloeistofbehandelingsvolumesnelheid van pomp 1 en pomp 2 op de bioreactorcontroller. Installeer een siliconenslang van 0.13 inch x 0.25 op elke pomp afzonderlijk, waarbij het ene uiteinde in een fles water wordt gedompeld en het andere uiteinde van de buis in een maatcilinder wordt gestoken.
  17. Stel de rotatiesnelheid van de pomp in op 300 tpm en de tijd gedurende 1 minuut. Let op de hoeveelheid water die in de maatcilinder van beide pompen wordt afgegeven. Deze nummers zijn nodig voor de volgende stappen.
  18. Bereid 500 ml SF hMSC-kweekmedium volgens de instructies van de fabrikant en vervang de dop van de fles celkweekmedium door een wegwerpsluiting van de C-Flex EZ Top-container en een compatibele dop. Voer de vervanging van de dop uit in een bioveiligheidskast (BSC).
  19. Las de uitlaatbuis op de fles medium aan de inlaatbuis C-flex op de fles van 10 g voorgesteriliseerde W01-microdragers voor MSC. Installeer een deel van de buis op pomp 1 van de bioreactorcontroller, stel de pomprotatie in op 300 tpm en pomp al het kweekmedium uit de fles in de fles met microdragers. Bewaar deze microdragers bij 4 °C tot gebruik op dag 0.
    OPMERKING: De microdragers moeten op dag −1 worden voorbereid. Bereid voor een bioreactorcultuur van 15 liter in totaal vier flessen (d.w.z. 40 g, met 4 x 500 ml SF-medium).

3. Celzaaien, kweken en oogsten in een bioreactor met geroerde tank van 5 liter

  1. Voer op dag 0 een eenpuntskalibratie uit, met name 100%, voor de DO-sonde op de bioreactorcontroller volgens de instructies van de fabrikant. De bioreactor met roertank is nu klaar voor celkweek.
  2. Bereid een glazen fles van 2 L (5 L) voor op afvalinzameling, voorzie deze van een GL 45 Multiport Connector Screw Cap met twee poorten, met 30 mm, 0.25 in x 0.44 in C-Flex-buizen aangesloten op beide poorten, en autoclaaf om te steriliseren. Las de C-flex buis van een van de poorten van de afvalfles naar de oogstbuis op de kopplaat van het bioreactorvat met een buislasapparaat.
  3. Stop de temperatuur-, pH- en DO-regeling op de bioreactorcontroller tijdelijk, installeer de siliconenslang die aan de oogstbuis is bevestigd op peristaltische pomp 2 in de juiste vloeistofstroomrichting en doseer alle PBS volledig uit het vat in de afvalfles. Maak de slang los van de pomp en sluit de afvalfles af en koppel deze los.
    NOTITIE: Maak altijd alle Robert-klemmen los op de flexibele buizen die betrokken zijn bij de vloeistofstroom in elke stap. Klem terug nadat de vloeistofoverdracht is voltooid voordat u deze afdicht en loskoppelt. Clamp dichter bij de kant van de kopplaat. Losmaken en vastklemmen moet worden uitgevoerd voor alle volgende stappen, tenzij anders vermeld.
  4. Bereid 7 L (30 L) volledig SF hMSC-medium voor en vervang elke originele dop van de fles door een wegwerp C-Flex EZ Top-containersluiting en compatibele dop. Las een filtratiemodule voor eenmalig gebruik aan een van de poorten op de opbergtas voor eenmalig gebruik van 10 l (50 l). Voer de handeling uit van het vervangen van de doppen in een BSC.
  5. Filter en breng het kweekmedium over in de opbergzak, één fles per keer, door de flessen celkweekmedium aan het andere uiteinde van het capsulefilter te lassen en de pomp op de bioreactorcontroller te gebruiken. Aanwijzen als de voerzak.
  6. Las een uitlaatpoort van de toevoerzak naar de C-flex-buis op de toevoerbuis van de kopplaat en installeer de buis op pomp 1 op de bioreactorcontroller. Las de andere uitlaatpoort van de toevoerzak naar de ontluchtingsbuis en installeer de buis om pomp 2 op de bioreactorcontroller in de juiste richting van de vloeistofstroom te installeren.
    NOTITIE: Installeer het gedeelte op de vloeistofstroomleiding, die is gemaakt van siliconenslangen, op de pomp voor een betere weerstand tegen slijtage in vergelijking met C-Flex-buizen. Zorg ervoor dat de buizen in de juiste richting worden geïnstalleerd.
  7. Stel de snelheid van pomp 1 in op 300 tpm en stop de pomp nadat u 1 L (5 L) medium uit de voerzak in het vat hebt gedoseerd, op basis van de volumeafgiftesnelheid vermeld in stap 2.17. Start de temperatuur-, pH- en DO-regeling opnieuw, met dezelfde instellingen als beschreven in stap 2.14.
  8. Sluit de slang die de voerzak verbindt met de vulopening op de kopplaat af en koppel deze los. Las de C-Flex-buis van de fles van de in stap 2.18 voorbereide gedispergeerde microcarriers op de vulopening en pomp alle inhoud uit de fles in het vat. Sluit de lege fles met microcarrier-suspensie af en koppel deze los. Desinfecteer het gehele oppervlak van de fles met 75% ethanol en plaats deze in een BSC om te gebruiken als transferfles voor celsuspensie.
    NOTITIE: Laat een langer stuk C-Flex-buis aan de kant van de kopplaat liggen bij het afdichten en loskoppelen van de wegwerpaccessoires, aangezien in de volgende stappen meerdere las- en loskoppelstappen op dezelfde buis zullen worden uitgevoerd.
  9. Zorg ervoor dat de temperatuur op de regelaar een constante temperatuur van 37 °C bereikt, wat gewoonlijk ongeveer 30 minuten duurt, voordat u verder gaat met het voorbereiden van de zaadcellen zoals in de stappen 1.3-1.4. Resuspendeer 2,5 x 108 hMSC's in 500 ml SF-medium en breng over naar de lege fles die eerder de microcarrier-suspensie bevatte.
    OPMERKING: De zaadcellen voor de uitbreiding van de bioreactor van 15 liter moeten worden voorbereid volgens stap 3.21, met als doel 1,0 x 109 cellen in 500 ml te inoculeren.
  10. Las de C-Flex-buis van de fles die nu de celsuspensie bevat naar de voedingspoort op de kopplaat en pomp alle inhoud van de fles in het vat om de celinoculatie naar de microdragers te starten. Sluit de lege fles af en koppel deze los. Las de toevoerpoort van de voerzak opnieuw aan de vulopening op de kopplaat.
  11. Pas de roerinstellingen op de controller aan om intermitterende agitatie mogelijk te maken voor verbeterde inoculatie-efficiëntie van hMSC's door de volgende parameters in te stellen: V1 = 35 (30) tpm/5 min; V2 = 0 omw/m 25 min; aantal cycli = 12 (24); eindroersnelheid = 35 (30) tpm.
    OPMERKING: De roersnelheid kan worden aangepast tot 40 (35) tpm of 45 (40) tpm als tijdens het kweekproces een niet-uniforme verdeling of sedimentatie van de microdragers wordt waargenomen.
  12. Stel een geautomatiseerd mediumsupplement en -uitwisselingsregime in op de bioreactorcontroller in de Medium Exchange-interface. Stel de parameters voor de hMSC-teelt in zoals vermeld in tabel 2.
    NOTITIE: Maak in dit stadium alle Robert-klemmen los op de flexibele buizen die betrokken zijn bij de vloeistofstroom, vooral voor de toevoer- en ontluchtingsbuis. Houd deze gedurende het hele kweekproces ongeklemd.
  13. Neem de monsters door de bemonsteringsbuis door de wegwerpbemonsteringszakken via Luer-connectoren op de gewenste tijdstippen aan te sluiten, meestal eenmaal per dag, en elke keer 10 ml in de bemonsteringszak te doen. Aliquot 2-3 ml monster in de eerste monsterzak, gooi weg en aliquot vervolgens de werkelijke 10 ml monster elke keer in een nieuwe monsterzak.
    NOTITIE: Het eerste monster van 2-3 ml kan vloeistof zijn die in de buis is achtergebleven vanaf het vorige bemonsteringstijdstip en geeft mogelijk niet nauwkeurig de toestand in het vat weer. Voer deze stappen altijd uit met extra aseptische maatregelen door de Luer-connectoren te ontsmetten voor en na het maken of verbreken van verbindingen met 75% ethanol.
  14. Breng de genomen monsters over in een conische centrifugebuis van 15 ml. Voer de volgende tests uit op de monsters.
    1. Neem 200 μL van de met cellen beladen microcarrier-suspensie en beits deze met Calcein-AM/PI Cell Double Staining volgens de instructies van de fabrikant. Observeer onder een fluorescentiemicroscoop.
    2. Sedimenteer de microdragers door zwaartekracht, wat meestal 5-10 minuten duurt. Zuig het supernatant op en test de glucoseconcentratie met een glucosemeter volgens de instructies van de fabrikant. Teken een grafiek van het glucosegehalte.
    3. Incubeer de bezinkselde met cellen beladen microdragers met een vers bereide 3-5 ml 1 mg/ml digestieoplossing bij 37 °C gedurende 20-30 minuten om de microdragers volledig op te lossen. Tel de cellen na kleuring met AO/PI met een geautomatiseerde fluorescentiecelanalysator. Teken een celgroeicurve. Correleer met de real-time live celgroeicurve die op de controller wordt gegenereerd.
  15. Bereid op dag 4 of dag 5 van de kweek 50 ml (200 ml) digestieoplossing van 30 mg/ml. De verhouding tussen de digestieoplossing en de oplosbare microdragers varieert van 3:20 tot 5:20. Steriel filter met een capsulefilter van 0,22 μm en verder verdunnen in 500 ml (2 L) van Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met calcium en magnesium. Breng over naar een wegwerpopbergzak van 3 liter.
    OPMERKING: Bereid de digestieoplossing pas vlak voor het oogsten van cellen. Probeer te streven naar ten minste 1,0 x 10 9-1,2 x 109 cellen voor de uitbreiding van het eerste niveau en 1,0 x 1010 cellen voor de uitbreiding van het tweede niveau. Als de cellen sneller groeien, oogst dan op dag 4; Zo niet, oogst dan op dag 5. Het wordt afgeraden om verder te gaan dan dag 5.
  16. Stel de roersnelheid op 0 in op de controller om de microcarriers te laten bezinken, wat meestal binnen 20 minuten gebeurt. Schakel het geautomatiseerde mediumuitwisselingsprotocol uit en stop de temperatuur-, pH- en DO-regeling op de bioreactorcontroller. Start pomp 2 handmatig bij 300 tpm op de regelaar en doseer supernatans in het toevoerregime om ongeveer 1 L (2 L) kweeksuspensie in het vat achter te laten (met behulp van de volumedoseersnelheid die is vermeld in stap 2.17 of te meten aan de hand van de schaalverdelingsmarkeringen op het lichaam van het vat). Sluit de voerzak af en koppel deze volledig los.
  17. Las de zak met vers bereide digestieoplossing van stap 3.15 in de vulopening en pomp alle inhoud in het vat. Start het roertoerental bij 45 (40) tpm. Zorg ervoor dat de temperatuurregelaar de temperatuur nog steeds op 37 °C houdt. Microcarriers lossen binnen 40-60 minuten op. Neem 1 ml van het monster met een steriele Luerlock-spuit na 30 minuten en vervolgens elke 5-10 minuten om te observeren onder een helderveldmicroscoop om de oplossing van de microdragers te controleren.
  18. Nadat de microcarriers zijn opgelost, last u een opbergzak van 3 liter (twee opbergzakken van 3 liter voor de bioreactor van 15 liter) aan de oogstbuis en pompt u de celsuspensie volledig leeg met pomp 2 bij 300 tpm. Bereid 1 L (3,5 L) zoutoplossing met 1% humaan serumalbumine (HSA) als wasbuffer en 500 ml volledig SF-medium (500 ml cryopreservatiebuffer voor cellen, een formulering van 10% dimethylsulfaat (DMSO) en 90% SF-medium als voorbeeld) in aparte wegwerpopbergzakken met behulp van de methoden en accessoires die in de vorige stappen zijn genoemd voor andere vloeistofoverdrachten.
  19. Schakel het celverwerkingssysteem in, installeer een Disposable Cell Processing Kit op het instrument volgens de instructies van de fabrikant, las de zakken met celsuspensie, wasbuffer en SF-medium (cryopreservatiebuffer) aan de Disposable Cell Processing Kit en volg zorgvuldig alle instructies die op de gebruikersinterface worden weergegeven om de integriteit en juiste installatie van de kit te initialiseren en te controleren.
  20. Zodra de installatie is voltooid, voert u de parameters in tabel 3 in voor het wassen van cellen met wasbuffer en resuspensie in SF-medium (cryopreservatiebuffer) in de software om het was- en resuspensieproces te starten. De hele procedure wordt automatisch uitgevoerd met verschillende handmatige controlepunten.
  21. Neem een monster van de cellen uit de centrifugekamer, zoals aangegeven door het celverwerkingssysteem, en bereken de celdichtheid met een geautomatiseerde celanalysator volgens de instructies van de fabrikant. Pas het resuspensievolume aan voor een dichtheid van 2 x 106 cellen/ml of een maximaal totaal volume van 250 ml.
  22. Sluit de celtransferzak af en koppel deze los van de Disposable Cell Processing Kit nadat het systeem de cellen uit de kamer heeft opgezogen. Pas de celdichtheid indien nodig opnieuw aan tot 2 x 106 cellen/ml met volledig SF-medium in een grotere celtransferzak/medium-opbergzak. Dit zullen de zaadcellen zijn voor de tweedelijnsexpansie in de 15 L bioreactor.

4. Celformulering, vulling en afwerking

  1. Begin 1 dag voor de celoogst van de 5 L-bioreactor met het voorbereiden van de 15 L-bioreactor. Volg de stappen in protocolsectie 2 en 3 volledig, behalve met de parameters voor 15 L die tussen haakjes zijn aangegeven.
  2. Resuspendeer de cellen in 250 ml cryopreservatiebuffer en sluit en koppel de celtransferzak los van de Disposable Cell Processing Kit nadat het systeem de cellen uit de kamer heeft opgezogen.
  3. Breng 2.000 ml cryopreservatiebuffer samen met de 250 ml geresuspendeerde cellen over van stap 4.2 naar een transferzak met 3 L-cellen. Las deze transferzak aan een Disposable Fill & Finish Consumable Kit.
    OPMERKING: Het extra volume cryopreservatiebuffer dat hier wordt gebruikt, moet worden bepaald door de specificatie van de formulering en de berekening van het totale aantal cellen volgens de telresultaten die zijn verkregen in stap 3.21
  4. Monteer de Disposable Fill &Finish Consumable Kit op het celvulsysteem en schakel het voorkoelsysteem in volgens de instructies van de fabrikant. Volg de instructies op het systeem en stel in om 20 ml/zak te vullen met in totaal 20 zakken per batch. Sluit deze zakken af en koppel ze los van de kit en volg de standaard cryopreservatieprocedures. Gebruik cryo-opslagzakken.
  5. Las een nieuwe set van 20 cryopreservatiezakken aan de Disposable Fill & Finish Consumable Kit en herhaal de vul- en afwerkingsprocedure totdat alle cellen zijn gealiquoteerd. Volg de standaardprocedures om deze cellen te cryopreservatie.

5. Karakterisering van de celkwaliteit

  1. Bemonstering van de geoogste hMSC's van de oplosbare microdragers en gebruik een celverwerkingssysteem voor karakterisering door middel van flowcytometrie voor de bepaling van de celidentiteit volgens de methoden beschreven in literatuur18.
  2. Ontdooi de gecryopreserveerde cellen en plaats ze opnieuw op conventionele 2D-kolven of microplaten voor verdere karakterisering van de celkenmerken, inclusief de celmorfologie en het differentiatievermogen van de tri-lineage, volgens methoden beschreven in literatuur18.

6. HEK293T expansie op G02-microcarriers in de bioreactor met geroerde tank

  1. Bereid een bioreactor van 5 liter voor zoals vermeld in stap 2. Kweek voor HEK293T cellen de cellen met steriele G02-microdragers in plaats van W01. Het kweekproces is vergelijkbaar met in protocolsectie 3, hoewel sommige parameters anders zijn, zoals in de volgende stappen zal worden beschreven. Installeer een speciale perfusiebuis in de bioreactor ter vervanging van de ontluchtingsbuis, aangezien perfusie nodig is voor de kweek van HEK293T cellen.
  2. In afwijking van het protocol dat wordt beschreven in protocolsectie 3, bereidt u 20 g G02-microdragers (d.w.z. twee flessen) in DMEM met 10% FBS voor de bioreactor van 5 L, waarbij het kweekvolume van dag 0 is vastgesteld op 3,5 L (d.w.z. een eindconcentratie van ongeveer 5,71 g/l). Doseer 2 L medium in het vat vóór de twee flessen G02-microdragers en inoculeer 500 ml 1,75 x 109 HEK293T cellen (d.w.z. bij een einddichtheid van 5 x 105 cellen/ml).
  3. Voer een agitatieregime en een mediumuitwisselingsregime uit (gebaseerd op de hoeveelheid medium die per dag moet worden uitgewisseld, uitgedrukt als kweekvolume per dag, CVD), die verschilt van protocolsectie 3 en wordt beschreven in tabel 4.
    NOTITIE: Activeer pomp 1 en pomp 2 handmatig, zodat beide continu kunnen pompen om perfusie tot stand te brengen. Pas de pompsnelheid elke dag aan om te voldoen aan de perfusiesnelheid op basis van de kalibratie van de volumeafgiftesnelheid van de pompen. Meestal zal dit in het bereik van één cijfer liggen. Gebruik voor HEK293T cellen vers medium als voer en gooi verbruikt medium volledig weg in een afvalfles, in tegenstelling tot hMSC's, waarvoor het medium wordt gecirculeerd.
  4. Gebruik voor de uitbreiding van de tweede laag naar de 15 L-bioreactor de HEK293T cellen van kraal tot kraal in plaats van volledige oplossing van de microdragers zoals bij hMSC's. Stop in het bijzonder het roeren om de microcarriers te bezinken nadat de gewenste celdichtheid is bereikt, en zuig vervolgens zoveel mogelijk supernatant uit de perfusiebuis, voed PBS met 3 keer het volume resterende suspensie om de microcarriers te wassen en herhaal drie keer. Zuig zoveel mogelijk PBS op en gooi het weg in de laatste wasbeurt.
  5. Voer 3,5 L 1x recombinant trypsine toe om de cellen los te maken van de microdragers terwijl de G02-microdragers intact blijven. Stel de temperatuur in op 37 °C en het roertoerental op 60 omw/min. Beëindig de onthechting binnen 45 minuten, wanneer meer dan 80% van de cellen is losgekomen, met een gelijke hoeveelheid volledig medium.
  6. Rechtstreeks overbrengen van de oogsthaven naar een voorbereid schip van 15 liter voor uitbreiding op het tweede niveau.

7. Expansie van Vero-cellen op V01-microdragers in de bioreactor met geroerde tank

  1. Bereid V01-microcarriers voor door de gevriesdroogde microcarriers samen met PBS in het bioreactorvat over te brengen tot een concentratie van 20 mg/ml. Monteer en steriliseer het vat zoals vermeld in protocolsectie 2, maar autoclaaf in plaats daarvan gedurende 30 minuten.
  2. Na sterilisatie komen V01-microdragers op natuurlijke wijze tot rust. Vervang het supernatans twee keer door basis-DMEM met behulp van de ontluchtings- en voedingssondes, en voeg de volledige DMEM met 10% NBS toe aan 50%-75% van het volume van het vat voordat u doorgaat met protocolsectie 3 voor celinoculatie en -kweek.
  3. Anders dan het protocol dat wordt beschreven in protocolsectie 3, gebruikt u 24 g V01-microdragers voor een 4 L-kweek van Vero-cellen (d.w.z. een eindconcentratie van 6 g/L) en inoculeert u 500 ml 4 x 109 Vero-cellen (d.w.z. met een einddichtheid van 1 x 106 cellen/ml).
  4. Volg de stappen 6.3-6.6 voor de parameters van het kweekproces en de overgang naar tweedelijns expansie in de 15 L geroerde tank bioreactor.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het ACISCP-platform is een volledig gesloten systeem dat gebruik maakt van een reeks bioreactoren met geroerde tanks voor opschalingsuitbreiding, een celverwerkingssysteem voor geautomatiseerde celoogst en -formulering, en een celvulsysteem (Figuur 1). Hechtende cellen hechten zich aan de poreuze microdragers, die in de bioreactor kunnen worden gedispergeerd, waardoor de hangende kweek van aanhangende cellen wordt bereikt.

Volgens het beschreven protocol werden ee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Zowel immunotherapie als stamceltherapie maken gebruik van levende cellen als medicijnen; Hun eindproducten mogen echter niet op dezelfde manier worden gezuiverd of gesteriliseerd als kleine moleculen of virussen. Daarom moet het principe van Quality by Design (QbD) altijd in gedachten worden gehouden en praktisch worden toegepast op het Chemical Manufacturing and Control (CMC)-proces tijdens de celproductie23. Een volledig gesloten celkweeksysteem, evenals een verwerkingssysteem en een vulsysteem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Y.D. is een wetenschappelijk adviseur en H.X., Y.Z., L.G., M.L., Y.Y., W.L. en X.Y. zijn werknemers van Beijing CytoNiche Biotechnology Co. Ltd. De andere auteurs hebben geen commercieel, eigendomsrechtelijk of financieel belang in de producten of bedrijven die in dit artikel worden beschreven. Alle andere auteurs verklaren dat zij geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd financieel ondersteund door de National Science Foundation for Distinguished Young Scholars (82125018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% trypsin EDTABasalMediaS310JVWordt gebruikt voor 2D celoogst.
3D FloTrix DigestCytoNiche BiotechR001-500Dit is een reagens dat specifiek 3D TableTrix microcarriers oplost.
3D FloTrix MSC Serum Free MediumCytoNiche BiotechRMZ112Dit is een serum-vrij, dierproefvrij medium voor mesenchymale stamcelexpansie en -onderhoud in 2D vlakke cultuur en ook 3D-cultuur op 3D TableTrix microcarriers.
3D FloTrix Single-Use Filtration ModuleCytoNiche BiotechR020-00-10Deze module bevat 0,22 μm capsulefilters die worden gebruikt voor het filteren van kweekmedium en verteringsoplossing.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (10 L)CytoNiche BiotechR020-00-03Wordt gebruikt als voedingszak voor 5 L bioreactor.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (3 L)CytoNiche BiotechR020-00-01Wordt gebruikt als celzaaien of overdrachtszakken.
3D FloTrix Single-Use Storage Bag (50 L)CytoNiche BiotechR020-00-04Wordt gebruikt als voedingszak voor 15 L bioreactor.
3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable KitCytoNiche BiotechPACK-01-01Dit is een standaardkit die is aangepast aan 3D vivaPACK-vul- en afwerkingssysteem.
3D FloTrix vivaPACK fill and finish system for cellsCytoNiche BiotechvivaPACKDit systeem is een gesloten vloeistofverwerkingsapparaat, met geautomatiseerde meng- en gasafvoerfuncties. Cellen die opgeschorst zijn in cryobewaringsbuffer kunnen snel en gelijkmatig in 20 zakken per batch worden verdeeld.
3D FloTrix vivaPREP PLUS cell processing systemCytoNiche BiotechvivaPREP PLUSDit systeem is een continu stroom centrifuge-gebaseerd apparaat. Cellen kunnen worden geconcentreerd, gewassen en opgeschorst onder volledig gesloten procedures.
3D FloTrix vivaPREP PLUS Disposable Cell Processing KitCytoNiche BiotechPREP-PLUS-00Dit is een standaardkit die is aangepast aan 3D vivaPREP PLUS celverwerking.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 15 LCytoNiche BiotechFTVS15Dit bioreactorproduct gebruikt een controller, een 15 L glazen geroerde tank en accessoires. Er is een speciale perfusieslang beschikbaar.
3D FloTrix vivaSPIN  bioreactor 5 LCytoNiche BiotechFTVS05Dit bioreactorproduct gebruikt een controller, een 5 L glazen geroerde tank en accessoires. Er is een speciale perfusieslang beschikbaar.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (10/15 L)CytoNiche BiotechR020-10-10Dit is een standaard slangenset die is aangepast aan 3D vivaSPIN bioreactor 15 L, met bemonsteringszakken.
3D FloTrix vivaSPIN Closed System Consumable Pack (2/5 L)CytoNiche BiotechR020-05-10Dit is een standaard slangenset die is aangepast aan 3D vivaSPIN bioreactor 5 L, met bemonsteringszakken.
3D TableTrix microcarriers G02CytoNiche BiotechG02-10-10gDeze poreuze en afbreekbare microcarriers zijn geschikt voor HEK293T-celcultuur. Ze worden voorgesteriliseerde in 10 g/fles geleverd met C-Flex slangen voor lassen op buizen op bioreactors.
3D TableTrix microcarriers V01CytoNiche BiotechV01-100-10gDeze poreuze en afbreekbare microcarriers zijn geschikt voor hechtende celcultuur, ze worden geleverd als niet-gesteriliseerde microcarriers die voor gebruik in PBS moeten worden geautoclaveerd. Ze zijn vooral geschikt voor vaccinproductie.
3D TableTrix microcarriers W01CytoNiche BiotechW01-10-10g (single-use verpakking);
W01-200 (tabletten)		Deze poreuze en afbreekbare microcarriers zijn geschikt voor hechtende celcultuur, vooral voor cellen die als eindproduct moeten worden geoogst. Ze worden voorgesteriliseerde in 10 g/fles geleverd met C-Flex slangen voor lassen op buizen op bioreactors. Het product heeft 2 kwalificaties voor farmaceutische hulpstoffen verkregen van CDE, met de registratienummers [F20200000496; F20210000003]. Het heeft ook DMF-kwalificatie voor farmaceutische hulpstoffen van FDA ontvangen, met het registratienummer [DMF:35481]
APC anti-human CD45 AntibodyBioLegend368512Wordt gebruikt in flow cytometry voor MSC-identiteitsbeoordeling
Calcein-AM/PI Double Staining KitDojindoC542Calcein-AM/PI Double Staining Kit wordt gebruikt voor gelijktijdige fluorescentiekleuring van levende en dode cellen. Deze kit bevat Calcein-AM en Propidiumjodide (PI) oplossingen, die respectievelijk levende en dode cellen kleuren.
Cap for EZ Top Container Closures for NALGENE-containers (500mL)Saint-GobainCAP-38Merknamen en catalogusnummers zijn alleen ter illustratie, vergelijkbare producten zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers en zolang ze dezelfde functionaliteit hebben, kunnen items worden vervangen door andere merken.
C-Flex Tubing, Formulation 374 (0.25 in x 0.44 in)Saint-Gobain374-250-3Wordt gebruikt voor het lassen en loskoppelen van buizen.
CryoMACS Freezing Bag 50Miltenyi Biotec 200-074-400Wordt gebruikt voor het uitbreiden van de 3D FloTrix vivaPACK Disposable Fill&Finish Consumable Kit.
Dimethyl Sulfate (DMSO) SigmaD2650-100mLWordt gebruikt voor de bereiding van cryobewaringsoplossing.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)BasalMediaL120KJWordt gebruikt voor de cultivatie van HEK293T- en Vero-cellen.
DURAN Original GL 45 Laboratory bottle (2 L

Referenties

  1. Golchin, A., Farahany, T. Z. Biological products: Cellular therapy and FDA approved products. Stem Cell Reviews and Reports. 15 (2), 166-175 (2019).
  2. Young, C. M., Quinn, C., Trusheim, M. R. Durable cell and gene therapy potential patient and financial impact: US projections of product approvals, patients treated, and product revenues. Drug Discovery Today. 27 (1), 17-30 (2022).
  3. Elverum, K., Whitman, M. Delivering cellular and gene therapies to patients: solutions for realizing the potential of the next generation of medicine. Gene Therapy. 27 (12), 537-544 (2020).
  4. Blache, U., Popp, G., Dünkel, A., Koehl, U., Fricke, S. Potential solutions for manufacture of CAR T cells in cancer immunotherapy. Nature Communications. 13 (1), 5225(2022).
  5. Lee, B., et al. Cell culture process scale-up challenges for commercial-scale manufacturing of allogeneic pluripotent stem cell products. Bioengineering. 9 (3), 92(2022).
  6. Emerson, J., Glassey, J. Bioprocess monitoring and control: Challenges in cell and gene therapy. Current Opinion in Chemical Engineering. 34, 100722(2021).
  7. Robb, K. P., Fitzgerald, J. C., Barry, F., Viswanathan, S. Mesenchymal stromal cell therapy: progress in manufacturing and assessments of potency. Cytotherapy. 21 (3), 289-306 (2019).
  8. Olsen, T. R., Ng, K. S., Lock, L. T., Ahsan, T., Rowley, J. A. Peak MSC-Are we there yet. Frontiers in Medicine. 5, 178(2018).
  9. Roots Analysis. Stem Cell Therapy Contract Manufacturing (CMO) Market, 2019 - 2030. , Available from: https://www.rootsanalysis.com/reports/view_document/stem-cell-therapy-contract-manufacturing-market-2019-2030/271.html (2019).
  10. Elseberg, C. L., et al. Microcarrier-based expansion process for hMSCs with high vitality and undifferentiated characteristics. The International Journal of Artificial Organs. 35 (2), 93-107 (2012).
  11. de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., Silva, da, L, C., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. Journal of Biotechnology. 236, 88-109 (2016).
  12. Rafiq, Q. A., Coopman, K., Nienow, A. W., Hewitt, C. J. Systematic microcarrier screening and agitated culture conditions improves human mesenchymal stem cell yield in bioreactors. Biotechnology Journal. 11 (4), 473-486 (2016).
  13. Tavassoli, H., et al. Large-scale production of stem cells utilizing microcarriers: A biomaterials engineering perspective from academic research to commercialized products. Biomaterials. 181, 333-346 (2018).
  14. Mizukami, A., et al. Technologies for large-scale umbilical cord-derived MSC expansion: Experimental performance and cost of goods analysis. Biochemical Engineering Journal. 135, 36-48 (2018).
  15. Yan, X., et al. Dispersible and dissolvable porous microcarrier tablets enable efficient large-scale human mesenchymal stem cell expansion. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (5), 263-275 (2020).
  16. Carletti, E., Motta, A., Migliaresi, C. Scaffolds for tissue engineering and 3D cell culture. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Haycock, J. W. , Humana Press. Totowa, NJ. 17-39 (2011).
  17. Loh, Q. L., Choong, C. Three-dimensional scaffolds for tissue engineering applications: Role of porosity and pore size. Tissue Engineering. Part B Reviews. 19 (6), 485-502 (2013).
  18. Zhang, Y., et al. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 16 (10), 934-944 (2022).
  19. NMPA. Pharmaceutical Excipient Registration Database: Microcarrier tablets for cells. Center for Drug Evaluation. , Available from: https://www.cde.org.cn/main/xxgk/listpage/ba7aed094c29ae314670a3563a716e (2023).
  20. List of Drug Master Files (DMFs). US Food and Drug Administration. , Available from: https://www.fda.gov/drug-mater-files-dmfs/list-drug-master-files-dmfs (2023).
  21. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224(2017).
  22. Xie, Y., et al. The quality evaluation system establishment of mesenchymal stromal cells for cell-based therapy products. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 176(2020).
  23. Maillot, C., Sion, C., De Isla, N., Toye, D., Olmos, E. Quality by design to define critical process parameters for mesenchymal stem cell expansion. Biotechnology Advances. 50, 107765(2021).
  24. Silva Couto, P., et al. Expansion of human mesenchymal stem/stromal cells (hMSCs) in bioreactors using microcarriers: Lessons learnt and what the future holds. Biotechnology Advances. 45, 107636(2020).
  25. Chen, S., et al. Facile bead-to-bead cell-transfer method for serial subculture and large-scale expansion of human mesenchymal stem cells in bioreactors. Stem Cells Translational Medicine. 10 (9), 1329-1342 (2021).
  26. Tsai, A. C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96(2021).
  27. Hewitt, C. J., et al. Expansion of human mesenchymal stem cells on microcarriers. Biotechnology Letters. 33 (11), 2325-2335 (2011).
  28. Mawji, I., Roberts, E. L., Dang, T., Abraham, B., Kallos, M. S. Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors. Biotechnology and Bioengineering. 119 (11), 3062-3078 (2022).
  29. Schirmaier, C., et al. Scale-up of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell production in stirred single-use bioreactors under low-serum conditions. Engineering in Life Sciences. 14 (3), 292-303 (2014).
  30. Lawson, T., et al. Process development for expansion of human mesenchymal stromal cells in a 50L single-use stirred tank bioreactor. Biochemical Engineering Journal. 120, 49-62 (2017).
  31. Yang, J., et al. Large-scale microcarrier culture of HEK293T cells and Vero cells in single-use bioreactors. AMB Express. 9 (1), 70(2019).
  32. Fang, Z., et al. Development of scalable vaccinia virus-based vector production process using dissolvable porous microcarriers. 25th Annual Meeting of the American Society of Gene & Cell Therapy. Molecular Therapy. 30, 195-196 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Microcarriers van GMP kwaliteit3D celkweekgeroerde tankbioreactorhumane mesenchymale stamcellengeautomatiseerd gesloten systeemcelopheffingcelverwerkingssysteemcellexpansieproductie van adherente cellen
Grootschalige celproductie op basis van GMP-kwaliteit oplosbare poreuze microdragers
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.