Dit protocol omvat het transfecteren van cAMP-sensoren en bPAC-nLuc, een optogenetisch eiwit, om nauwkeurig de cellulaire verdeling en respons op lichtstimulatie te volgen. De innovatieve aanpak van het creëren van een cAMP-responskaart met behulp van een puntscansysteem biedt het potentieel om onderzoek met optogenetische eiwitten op verschillende gebieden te bevorderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
De cellulaire distributie van een optogenetisch eiwit in kaart brengen met behulp van een lichtstimulatieraster
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ons doel was om de cellulaire verdeling van een optogenetisch eiwit nauwkeurig te volgen en de functionaliteit ervan binnen een specifieke cytoplasmatische locatie te evalueren. Om dit te bereiken, co-transfecteerden we cellen met nucleus-gerichte cAMP-sensoren en ons laboratoriumontwikkelde optogenetische eiwit, bacteriële fotoactiveerbare adenylylcyclase-nanoluciferase (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc genereert, wanneer gestimuleerd met 445 nm licht of luciferase-substraten, adenosine 3',5'-cyclisch monofosfaat (cAMP). We gebruikten een solid-state laserverlichter verbonden met een puntscansysteem dat ons in staat stelde een raster-/matrixpatroon van kleine verlichte vlekken (~1 µm2) door het cytoplasma van HC-1 cellen te creëren. Door dit te doen, konden we effectief de verdeling van nucleus-gerichte bPAC-nLuc volgen en een uitgebreide cAMP-responskaart genereren. Deze kaart vertegenwoordigde nauwkeurig de cellulaire verdeling van bPAC-nLuc, en de respons op lichtstimulatie varieerde afhankelijk van de hoeveelheid eiwit in de verlichte vlek. Deze innovatieve aanpak draagt bij aan de groeiende toolkit van technieken die beschikbaar zijn voor het onderzoeken van cellulaire optogenetische eiwitten. De mogelijkheid om zijn verdeling en respons met hoge precisie in kaart te brengen heeft verstrekkende potentieel en zou verschillende onderzoeksgebieden kunnen bevorderen.
Inleiding
Optogenetics, ontstaan als een hulpmiddel dat de neurowetenschappen revolutioneerde, is nu een groeiend onderzoeksgebied en een toenemende technologie die routinematig wordt gebruikt door veel laboratoria wereldwijd en in verschillende onderzoeksgebieden in de biologie. We ontwikkelden bPAC-nLuc, een veelzijdig optogenetisch eiwit, door een lichtgevoelige adenylyl cyclase (AC) van Beggiatoa sp. (bacteriële fotoactiveerbare adenylyl cyclase; bPAC) te fuseren met nanoluciferase (nLuc)1,2,3. Wanneer gestimuleerd met blauw licht, produceert bPAC de tweede boodschapper 3',5'-cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP). nLuc is een recent ontwikkelde kleine luciferase die, in aanwezigheid van een van zijn substraten, bioluminescentie kan genereren en cAMP-productie kan activeren4. Dus, dit optogenetisch eiwit kan tijdelijk worden geactiveerd door gebruik van korte lichtpulsen of constant met Furimazine of andere luciferase-substraten, waardoor we verschillende cAMP-signaalpatronen kunnen nabootsen en cellulaire reacties kunnen beoordelen (activering van transcriptiefactoren, genexpressie, celproliferatie, migratie, etc.). Recente vorderingen in 2nd boodschapper-signalering hebben de betekenis van gebeurtenissen benadrukt die plaatsvinden in zeer beperkte cytoplasmatische gebieden (bijv. endosomale cAMP-productie voor cAMP-responselementbindend eiwit (CREB) fosforylering of Ca2+ microdomeinen voor kernfactor van geactiveerde T-cellen (NFAT) translocatie naar de kern)5,6. Daarom is het belangrijk om consistente en systematische strategieën te ontwikkelen om signaaloverdracht van deze compartimenten in levende cellen te evalueren, na te bootsen en te blokkeren. Om de mogelijkheid van bPAC-nLuc te laten zien om specifiek geactiveerd te worden in verschillende celcompartimenten, co-transfecteerden we een hepatoma-afgeleide cellijn (HC-1) met de nucleair-gerichte bPAC-nLuc en H208, een Förster resonantie-energietransfer (FRET) cAMP-sensor (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). HC-1-cellen die van de HTC-lijn afkomstig zijn, zijn verstoken van meetbare AC-activiteit, wat resulteert in zeer lage basale cAMP-niveaus, waardoor het ideaal is om veronderstelde cAMP-productie te meten terwijl gebruik wordt gemaakt van het volledige dynamische bereik van FRET-sensoren7,8. Met behulp van een solid-state laser (445 nm, LDI-7, 89 North) verbonden met een punt-scansysteem (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), beschrijven we een protocol om systematisch zeer kleine cirkelvormige gebieden of vlekken (~1 µm2) binnen individuele cellen te stimuleren. Het punt-scansysteem was verbonden met een van de achterpoorten van een microscoop met twee dekken, wat ons in staat stelde cellen te stimuleren en FRET-metingen tegelijkertijd uit te voeren via een onafhankelijke lichtbaan. We presenteren een methode in dit protocol waarbij de SysCon Geo software, geleverd met het stimulatiesysteem door Rapp OptoElectronic, wordt gebruikt om een uitgebreide scan van het cytoplasma van cellen uit te voeren. De benadering omvat het genereren van een cAMP-responskaart door een reeks verlichtingen op te zetten die cellen in een rasterpatroon stimuleren (Figuur 1).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. HC-1 celcultuur en voorbereiding voor beeldvorming
- Bewaar HC-1 cellen in DMEM aangevuld met 10% foetaal bovien serum (FBS), penicilline (100 IE/L), streptomycine (100 mg/L) en L-glutamine in 10 cm schalen en incubeer bij 37 °C, 5% CO2, in 95% bevochtigde lucht.
- Verdun de cellen elke 2-4 dagen, zodra de cellen ~90% confluent zijn, met 1:5 of 1:10 verdunning.
- Zaai cellen voor transfectie op glazen dekvlakken 2 dagen voor het experiment.
- Werk onder steriele omstandigheden in een weefselkweekafzuiging met voorverwarmd medium en PBS, aspireer het medium van een bijna confluente schaal cellen en was voorzichtig met 5 mL PBS.
- Aspireer het PBS en voeg 1 mL trypsine toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 3-5 min totdat de cellen loslaten.
- Resuspendeer de cellen in 4 mL medium en breng de celsuspensie over naar een 15 mL conische buis.
- Gebruik een hemocytometer om het aantal cellen te tellen en bereken de celdichtheid.
- Verdun de cellen tot een dichtheid van 1,5 x 104 cellen/mL.
- Pipet 2 mL van de celsuspensie op 25 mm glazen dekvlakken met poly-D-lysine coating in een 6-wells plaat.
- Incubeer de cellen ongeveer 24 uur in een incubator tot 70% confluentie.
- Transfecteer de cellen met behulp van een transfectiekit volgens de instructies van de fabrikant met een verhouding van 0,25 µg NLS-bPAC-nLuc DNA/0,75 µg NLS-H208 DNA per 3 µL transfectiereagens en 2 µL P3000 reagens verdund in Opti-MEM medium zonder fenol rood.
- Plaats de cellen in de incubator gedurende ~48 uur om voldoende bPAC-nLuc expressie mogelijk te maken, essentieel voor het produceren van detecteerbare niveaus van cAMP.
OPMERKING: Het minimaal vereiste niveau van bPAC-nLuc expressie zal variëren afhankelijk van de potentie van het stimulatiesysteem en de parameters van de stimulatie. - Bereid cellen op dekvlakken voor voor beeldvorming.
- Aspireer het medium van een well en was twee keer met 2 mL PBS.
- Til voorzichtig het dekglas op met een tang en plaats het in de beeldvormingskamer.
- Voeg 1 mL Opti-MEM zonder fenol rood toe aan de beeldvormingskamer. Cellen kunnen ook worden afgebeeld in HBSS of een andere fysiologische, fluorescentie-compatibele oplossing.
2. Lichtsimulatie en levende celbeeldvorming
- Voer celkweek en manipulatie van cellen die NLS-bPAC-nLuc tot expressie brengen in een donkere omgeving uit. Om blootstelling aan golflengten <500 nm te voorkomen, gebruik een rode veilige lamp (Tabel met materialen) met een 13 W amber compacte fluorescentielamp (Tabel met materialen).
- Voer experimenten uit in een gemotoriseerde tweekoppige microscoop (Tabel met materialen) uitgerust met een 6-lijnen multi-LED lichtmotor (Tabel met materialen), een emissiefilterwiel (Tabel met materialen), XY-trap (Tabel met materialen), een ORCA-Fusion Digital CMOS camera (Tabel met materialen) en een 100x/1.4 NA olie-objectief (∞/0.17/FN26.5). Maak beelden met behulp van digitale microscopie software (Tabel met materialen). Deze opstelling is in staat om cellen te stimuleren en FRET-metingen tegelijkertijd uit te voeren door gebruik te maken van een onafhankelijke lichtbaan voorzien van een ZT458rdc dichroische filter (Tabel met materialen).
OPMERKING: Elke acquisitie opstelling kan worden gebruikt als deze gelijktijdige optogenetische stimulatie en FRET/intensiometrische beeldvorming mogelijk maakt met een compatibele sensor. - Schakel de UGA - 42 Geosystem in. Schakel de microscoop in en stel deze in met de juiste parameters om te verwerven met de H208 FRET-sensor. De acquisitieconfiguratie hangt af van de expressieniveaus van de FRET-sensor. De typische parameters zijn 40 ms simulatietijd voor YFP/mScarletI, 15% LED-vermogen en 0,5 Hz.
- Open de SysCon software en de beeldvormingssoftware die de microscoop bestuurt.
- Selecteer in het Camera venster het Calibratie Tabblad en kies de lasergolflengte die compatibel is met het optogenetische eiwit. Om bPAC-nLuc te stimuleren, gebruik een golflengte van 445 nm.
- Kalibreer het systeem voor elke gebruik. Dit is belangrijk omdat kleine variaties in de opstelling, of zelfs veranderingen in de kamertemperatuur (RT), de precisie van de stimulatie kunnen beïnvloeden.
- Selecteer in het cameravenster het Camera tab en klik om de acquisitie vanuit de beeldvormingssoftware te starten.
- Bekijk in het Image Viewer venster een live of eerdere acquisitie van de fluorescentie van de cellen genomen uit de beeldvormingssoftware, wat de positionering van de stimulatieobjecten zal leiden.
- Gebruik de Klik en Vuur modus om snel de reactiviteit van een individuele cel te evalueren voordat het experiment begint.
- Selecteer met behulp van het Sequence-Manager venster om een nieuwe sequentie te creëren.
OPMERKING: Om de juiste kalibratie van het systeem te verifiëren, tekent u verschillende vormen en groottes in het Image Viewer venster. Deze moeten precies overeenkomen met de stimulatiepatronen geprojecteerd op de cellen, wat zorgt voor
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De resultaten gepresenteerd in Figuur 1 tonen aan dat alleen stimulaties gericht op de celkern in staat waren om meetbare cAMP-stijgingen op te wekken. Dit bevestigt dat NLS-bPAC-nLuc uitsluitend tot expressie komt in het nucleaire compartiment van HC-1-cellen. Met dit raster- of matrixpatroon is het mogelijk om een optogenetisch eiwit nauwkeurig te stimuleren om de intracellulaire distributie ervan in kaart te brengen. Bovendien weerspiegelen de hogere cAMP-...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het doel van dit onderzoek was om de intracellulaire verdeling van een optogenetisch eiwit precies te monitoren en zijn prestaties binnen een specifiek cytoplasmatisch compartiment te beoordelen. We toonden ook de nauwkeurige stimulatiemogelijkheden van een puntscansysteem op cellen die een optogenetisch eiwit tot expressie brengen. Om dit te bereiken, gebruikten we een kern-gerichte bPAC-nLuc met hoge expressieniveaus maar een zeer beperkte verdeling beperkt tot de kern. De resultaten toonden aan dat stimulatieplekken g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerend belang.
Dankbetuigingen
De financiering werd verzorgd door de National Institutes of Health (NIH) grants R01 GM099775 en GM130612 aan D.L.A.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 13 W Amber compact fluorescence bulb - Low Blue Lights | Photonic Developments | ||
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | |
| 6-line multi-LED Lumencor Spectra X | Lumencor | 6-line multi-LED light engine | |
| Corning - DMEM | Thermo Fischer | MT10013CMEA | |
| Corning - Regular fetal bovine serum | Thermo Fischer | MT35011CV | |
| Cover glasses: circles | Thermo Fischer | 12545102P | |
| GBX-2 dark red safelight filter 5.5" | Kodak | 1416827 | Red safelight lamp |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) 10x | Thermo Fischer | 14185052 | Diluted to 1x, adjusted pH |
| LDI-7 | 89 North | ||
| L-Glutamine | Thermo Fischer | BW17605E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fischer | L3000001 | Transfection kit |
| Olympus IX83 motorized two-deck microscope | Olympus | Motorized two-deck microscope | |
| Opti-MEM, no phenol red | Thermo Fischer | 11058021 | |
| ORCA-fusion digital CMOS camera | Hamamatsu | C14440-20UP | |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Phosphate buffered solution (1x) | Lonza | 17516F | |
| Prior emission filter wheel and filter sets | Prior Scientific, Inc. | Emission filter wheel | |
| Prior Proscan XY stage | Prior Scientific, Inc. | XY stage | |
| Slidebook 6 | Intelligent Imaging Innovations | Digital microscopy software | |
| SysCon software | SysCon Software | Software provided by the stimulation system | |
| UGA-42 Geo | Rapp OptoElectronic | ||
| UPlanSApo 100x | Olympus | 100x/1.4 NA oil objective (∞/0.17/FN26.5) | |
| ZT458rdc dichroic | Chroma Technology Corp | BS, Wavelength (CWL): 498 nm |
Referenties
- Naim, N., et al. Luminescence-activated nucleotide cyclase regulates spatial and temporal cAMP synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (4), 1095-1103 (2019).
- Naim, N., Reece, J. M., Zhang, X., Altschuler, D. L. Dual activation of cAMP production through photostimulation or chemical stimulation. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2173, 201-216 (2020).
- Stierl, M., et al. Light modulation of cellular cAMP by a small bacterial photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, of the soil bacterium Beggiatoa. The Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1181-1188 (2011).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Liccardo, F., Luini, A., Di Martino, R. Endomembrane-based signaling by GPCRs and G-proteins. Cells. 11 (3), 528(2022).
- Groschner, K., Graier, W. F., Romanin, C. Store-operated ca(2)+ entry (SOCE) pathways. , Springer, Vienna. (2017).
- Ross, E. M., Howlett, A. C., Ferguson, K. M., Gilman, A. G. Reconstitution of hormone-sensitive adenylate cyclase activity with resolved components of the enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 253 (18), 6401-6412 (1978).
- Insel, P. A., Maguire, M. E., Gilman, A. G., Bourne, H. R., Coffino, P., Melmon, K. L. Beta adrenergic receptors and adenylate cyclase: products of separate genes. Molecular Pharmacology. 12, 1062-1069 (1976).
- Pizzoni, A., Zhang, X., Naim, N., Altschuler, D. L. Soluble cyclase-mediated nuclear cAMP synthesis is sufficient for cell proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 120 (4), e2208749120(2023).
- Keravis, T., Lugnier, C. Cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE) isozymes as targets of the intracellular signalling network: benefits of PDE inhibitors in various diseases and perspectives for future therapeutic developments. British Journal of Pharmacology. 165 (5), 1288-1305 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
