De cellulaire distributie van een optogenetisch eiwit in kaart brengen met behulp van een lichtstimulatieraster

Summary

Dit protocol omvat het transfecteren van cAMP-sensoren en bPAC-nLuc, een optogenetisch eiwit, om nauwkeurig de cellulaire verdeling en respons op lichtstimulatie te volgen. De innovatieve aanpak van het creëren van een cAMP-responskaart met behulp van een puntscansysteem biedt het potentieel om onderzoek met optogenetische eiwitten op verschillende gebieden te bevorderen.

Abstract

Ons doel was om de cellulaire verdeling van een optogenetisch eiwit nauwkeurig te volgen en de functionaliteit ervan binnen een specifieke cytoplasmatische locatie te evalueren. Om dit te bereiken, co-transfecteerden we cellen met nucleus-gerichte cAMP-sensoren en ons laboratoriumontwikkelde optogenetische eiwit, bacteriële fotoactiveerbare adenylylcyclase-nanoluciferase (bPAC-nLuc). bPAC-nLuc genereert, wanneer gestimuleerd met 445 nm licht of luciferase-substraten, adenosine 3',5'-cyclisch monofosfaat (cAMP). We gebruikten een solid-state laserverlichter verbonden met een puntscansysteem dat ons in staat stelde een raster-/matrixpatroon van kleine verlichte vlekken (~1 µm²) door het cytoplasma van HC-1 cellen te creëren. Door dit te doen, konden we effectief de verdeling van nucleus-gerichte bPAC-nLuc volgen en een uitgebreide cAMP-responskaart genereren. Deze kaart vertegenwoordigde nauwkeurig de cellulaire verdeling van bPAC-nLuc, en de respons op lichtstimulatie varieerde afhankelijk van de hoeveelheid eiwit in de verlichte vlek. Deze innovatieve aanpak draagt bij aan de groeiende toolkit van technieken die beschikbaar zijn voor het onderzoeken van cellulaire optogenetische eiwitten. De mogelijkheid om zijn verdeling en respons met hoge precisie in kaart te brengen heeft verstrekkende potentieel en zou verschillende onderzoeksgebieden kunnen bevorderen.

Introduction

Optogenetics, ontstaan als een hulpmiddel dat de neurowetenschappen revolutioneerde, is nu een groeiend onderzoeksgebied en een toenemende technologie die routinematig wordt gebruikt door veel laboratoria wereldwijd en in verschillende onderzoeksgebieden in de biologie. We ontwikkelden bPAC-nLuc, een veelzijdig optogenetisch eiwit, door een lichtgevoelige adenylyl cyclase (AC) van Beggiatoa sp. (bacteriële fotoactiveerbare adenylyl cyclase; bPAC) te fuseren met nanoluciferase (nLuc)^1,2,3. Wanneer gestimuleerd met blauw licht, produceert bPAC de tweede boodschapper 3',5'-cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP). nLuc is een recent ontwikkelde kleine luciferase die, in aanwezigheid van een van zijn substraten, bioluminescentie kan genereren en cAMP-productie kan activeren⁴. Dus, dit optogenetisch eiwit kan tijdelijk worden geactiveerd door gebruik van korte lichtpulsen of constant met Furimazine of andere luciferase-substraten, waardoor we verschillende cAMP-signaalpatronen kunnen nabootsen en cellulaire reacties kunnen beoordelen (activering van transcriptiefactoren, genexpressie, celproliferatie, migratie, etc.). Recente vorderingen in 2^nd boodschapper-signalering hebben de betekenis van gebeurtenissen benadrukt die plaatsvinden in zeer beperkte cytoplasmatische gebieden (bijv. endosomale cAMP-productie voor cAMP-responselementbindend eiwit (CREB) fosforylering of Ca²⁺ microdomeinen voor kernfactor van geactiveerde T-cellen (NFAT) translocatie naar de kern)^5,6. Daarom is het belangrijk om consistente en systematische strategieën te ontwikkelen om signaaloverdracht van deze compartimenten in levende cellen te evalueren, na te bootsen en te blokkeren. Om de mogelijkheid van bPAC-nLuc te laten zien om specifiek geactiveerd te worden in verschillende celcompartimenten, co-transfecteerden we een hepatoma-afgeleide cellijn (HC-1) met de nucleair-gerichte bPAC-nLuc en H208, een Förster resonantie-energietransfer (FRET) cAMP-sensor (NLS-bPAC-nLuc; NLS-H208). HC-1-cellen die van de HTC-lijn afkomstig zijn, zijn verstoken van meetbare AC-activiteit, wat resulteert in zeer lage basale cAMP-niveaus, waardoor het ideaal is om veronderstelde cAMP-productie te meten terwijl gebruik wordt gemaakt van het volledige dynamische bereik van FRET-sensoren^7,8. Met behulp van een solid-state laser (445 nm, LDI-7, 89 North) verbonden met een punt-scansysteem (UGA-42 Geo, Rapp OptoElectronic), beschrijven we een protocol om systematisch zeer kleine cirkelvormige gebieden of vlekken (~1 µm²) binnen individuele cellen te stimuleren. Het punt-scansysteem was verbonden met een van de achterpoorten van een microscoop met twee dekken, wat ons in staat stelde cellen te stimuleren en FRET-metingen tegelijkertijd uit te voeren via een onafhankelijke lichtbaan. We presenteren een methode in dit protocol waarbij de SysCon Geo software, geleverd met het stimulatiesysteem door Rapp OptoElectronic, wordt gebruikt om een uitgebreide scan van het cytoplasma van cellen uit te voeren. De benadering omvat het genereren van een cAMP-responskaart door een reeks verlichtingen op te zetten die cellen in een rasterpatroon stimuleren (Figuur 1).

Protocol

1. HC-1 celcultuur en voorbereiding voor beeldvorming

1. Bewaar HC-1 cellen in DMEM aangevuld met 10% foetaal bovien serum (FBS), penicilline (100 IE/L), streptomycine (100 mg/L) en L-glutamine in 10 cm schalen en incubeer bij 37 °C, 5% CO₂, in 95% bevochtigde lucht.
2. Verdun de cellen elke 2-4 dagen, zodra de cellen ~90% confluent zijn, met 1:5 of 1:10 verdunning.
3. Zaai cellen voor transfectie op glazen dekvlakken 2 dagen voor het experiment.
   1. Werk onder steriele omstandigheden in een weefselkweekafzuiging met voorverwarmd medium en PBS, aspireer het medium van een bijna confluente schaal cellen en was voorzichtig met 5 mL PBS.
   2. Aspireer het PBS en voeg 1 mL trypsine toe. Incubeer bij 37 °C gedurende 3-5 min totdat de cellen loslaten.
   3. Resuspendeer de cellen in 4 mL medium en breng de celsuspensie over naar een 15 mL conische buis.
   4. Gebruik een hemocytometer om het aantal cellen te tellen en bereken de celdichtheid.
   5. Verdun de cellen tot een dichtheid van 1,5 x 10⁴ cellen/mL.
   6. Pipet 2 mL van de celsuspensie op 25 mm glazen dekvlakken met poly-D-lysine coating in een 6-wells plaat.
   7. Incubeer de cellen ongeveer 24 uur in een incubator tot 70% confluentie.
4. Transfecteer de cellen met behulp van een transfectiekit volgens de instructies van de fabrikant met een verhouding van 0,25 µg NLS-bPAC-nLuc DNA/0,75 µg NLS-H208 DNA per 3 µL transfectiereagens en 2 µL P3000 reagens verdund in Opti-MEM medium zonder fenol rood.
5. Plaats de cellen in de incubator gedurende ~48 uur om voldoende bPAC-nLuc expressie mogelijk te maken, essentieel voor het produceren van detecteerbare niveaus van cAMP.
   OPMERKING: Het minimaal vereiste niveau van bPAC-nLuc expressie zal variëren afhankelijk van de potentie van het stimulatiesysteem en de parameters van de stimulatie.
6. Bereid cellen op dekvlakken voor voor beeldvorming.
   1. Aspireer het medium van een well en was twee keer met 2 mL PBS.
   2. Til voorzichtig het dekglas op met een tang en plaats het in de beeldvormingskamer.
   3. Voeg 1 mL Opti-MEM zonder fenol rood toe aan de beeldvormingskamer. Cellen kunnen ook worden afgebeeld in HBSS of een andere fysiologische, fluorescentie-compatibele oplossing.

2. Lichtsimulatie en levende celbeeldvorming

1. Voer celkweek en manipulatie van cellen die NLS-bPAC-nLuc tot expressie brengen in een donkere omgeving uit. Om blootstelling aan golflengten <500 nm te voorkomen, gebruik een rode veilige lamp (Tabel met materialen) met een 13 W amber compacte fluorescentielamp (Tabel met materialen).
2. Voer experimenten uit in een gemotoriseerde tweekoppige microscoop (Tabel met materialen) uitgerust met een 6-lijnen multi-LED lichtmotor (Tabel met materialen), een emissiefilterwiel (Tabel met materialen), XY-trap (Tabel met materialen), een ORCA-Fusion Digital CMOS camera (Tabel met materialen) en een 100x/1.4 NA olie-objectief (∞/0.17/FN26.5). Maak beelden met behulp van digitale microscopie software (Tabel met materialen). Deze opstelling is in staat om cellen te stimuleren en FRET-metingen tegelijkertijd uit te voeren door gebruik te maken van een onafhankelijke lichtbaan voorzien van een ZT458rdc dichroische filter (Tabel met materialen).
   OPMERKING: Elke acquisitie opstelling kan worden gebruikt als deze gelijktijdige optogenetische stimulatie en FRET/intensiometrische beeldvorming mogelijk maakt met een compatibele sensor.
3. Schakel de UGA - 42 Geosystem in. Schakel de microscoop in en stel deze in met de juiste parameters om te verwerven met de H208 FRET-sensor. De acquisitieconfiguratie hangt af van de expressieniveaus van de FRET-sensor. De typische parameters zijn 40 ms simulatietijd voor YFP/mScarletI, 15% LED-vermogen en 0,5 Hz.
4. Open de SysCon software en de beeldvormingssoftware die de microscoop bestuurt.
5. Selecteer in het Camera venster het Calibratie Tabblad en kies de lasergolflengte die compatibel is met het optogenetische eiwit. Om bPAC-nLuc te stimuleren, gebruik een golflengte van 445 nm.
6. Kalibreer het systeem voor elke gebruik. Dit is belangrijk omdat kleine variaties in de opstelling, of zelfs veranderingen in de kamertemperatuur (RT), de precisie van de stimulatie kunnen beïnvloeden.
7. Selecteer in het cameravenster het Camera tab en klik om de acquisitie vanuit de beeldvormingssoftware te starten.
8. Bekijk in het Image Viewer venster een live of eerdere acquisitie van de fluorescentie van de cellen genomen uit de beeldvormingssoftware, wat de positionering van de stimulatieobjecten zal leiden.
9. Gebruik de Klik en Vuur modus om snel de reactiviteit van een individuele cel te evalueren voordat het experiment begint.
10. Selecteer met behulp van het Sequence-Manager venster om een nieuwe sequentie te creëren.
    OPMERKING: Om de juiste kalibratie van het systeem te verifiëren, tekent u verschillende vormen en groottes in het Image Viewer venster. Deze moeten precies overeenkomen met de stimulatiepatronen geprojecteerd op de cellen, wat zorgt voor

Results

De resultaten gepresenteerd in Figuur 1 tonen aan dat alleen stimulaties gericht op de celkern meetbare cAMP-verhoging konden genereren. Dit bevestigt dat NLS-bPAC-nLuc uitsluitend in het nucleaire compartiment van HC-1 cellen wordt uitgedrukt. Het is mogelijk om met precisie een optogenetisch eiwit te stimuleren met behulp van dit raster/matrixpatroon om de intracellulaire verdeling ervan in kaart te brengen. Bovendien weerspiegelen de hogere cAMP-verhoging naar het nucleaire centrum de hogere massa van bPAC-nLuc gesimuleerd door centrale plekken vergeleken met degenen die aan de nucleaire rand geplaatst zijn (Figuur 1).

Figuur 1: Het rasterstimulatieprotocol en de cAMP responskaart. Sequentiële blauwe lichtstimulatie (445 nm; 30 s interval tussen pulsen; pulstrein: 50 ms, 500 ms totale duur, 10 Hz, 7% laservermogen) op HC-1 cellen getransfecteerd met NLS-H208 (cAMP sensor) en NLS-bPAC-nLuc. Het linker paneel toont de gele fluorescente eiwit (YFP) fluorescentie van de H208, die werd gesuperponeerd met de daadwerkelijke lichtpulsen vastgelegd door de sCMOS camera weergegeven in een enkele afbeelding. Sporen aan de rechterkant tonen voorbijgaande cAMP-verhogingen veroorzaakt door NLS-bPAC-nLuc stimulatie op elke stimulatieplek. De achtergrondgecorrigeerde NLS-H208 fluorescentie werd gemeten met behulp van een enkele ROI die de hele kern beslaat, en genormaliseerde verhoudingen (R/R0) werden berekend. Reacties in de buitenste gebieden (rijen 1 en 7, kolommen A en G) waren negatief en worden niet getoond. Streep = 3 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het doel van dit onderzoek was om de intracellulaire verdeling van een optogenetisch eiwit precies te monitoren en zijn prestaties binnen een specifiek cytoplasmatisch compartiment te beoordelen. We toonden ook de nauwkeurige stimulatiemogelijkheden van een puntscansysteem op cellen die een optogenetisch eiwit tot expressie brengen. Om dit te bereiken, gebruikten we een kern-gerichte bPAC-nLuc met hoge expressieniveaus maar een zeer beperkte verdeling beperkt tot de kern. De resultaten toonden aan dat stimulatieplekken gescheiden door slechts ~1 µm cAMP-productie kunnen activeren of niet, afhankelijk van de cellulaire verdeling van het optogenetisch eiwit; alleen stimulaties gericht op de kern waren in staat om cAMP-niveaus te verhogen. In dit protocol was het doel niet om gelokaliseerde cAMP-verhogingingen te genereren, maar eerder om te laten zien dat korte lichtstimulatieën nauwkeurig genoeg kunnen zijn om optogenetische eiwitten in zeer beperkte gebieden van de cel te activeren zonder de omringende eiwitten te stimuleren. Deze aanpak vormt echter een noodzakelijke controle voor het onderzoek van andere optogenetische eiwitten met diffuse verdelingen en/of het genereren van gelokaliseerde cAMP-verhogingingen. Dit kan worden bereikt door de expressieniveaus van het optogenetisch eiwit, de intensiteit en frequentie van de stimulatie, enz. te variëren. Om deze gelokaliseerde signalen nauwkeurig te meten, is zorgvuldige overweging van acquisitieparameters en sensorkenmerken cruciaal. Dit omvat het selecteren van geschikte ROI-posities en -groottes, het bepalen van de acquisitiefrequentie en het kiezen van FRET/intensiteitsensoren met optimale affiniteit, intensiteit, dynamisch bereik en dissociatieconstante.

In een onlangs gepubliceerd artikel hebben we een vergelijkbare strategie gebruikt om de verdeling van een kern-gerichte bPAC-nLuc functioneel te demonstreren en de capaciteit van een gemodificeerde fosfodiësterase (PDE; ΔRI-PDE8) om cAMP-verhogingingen in een thyroïd-afgeleide cellijn af te schaffen⁹. In dit artikel voerden we celstimulatie uit langs een rechte lijn in plaats van een raster, en de verlichtingsplekken werden geplaatst ten opzichte van cellulaire herkenningspunten (bijv. kerncentrum, kernrand, enz.) in plaats van in een systematisch patroon. Opmerkelijk is dat zelfs stimulaties gericht op de kernrand onvoldoende waren om een detectabele cAMP-respons te activeren. We redeneerden dat dit waarschijnlijk te wijten was aan het stimuleren van een onvoldoende massa NLS-bPAC-nLuc⁹. Echter, in het huidige protocol, sommige stimulaties gericht op de nabijheid van de kernrand veroorzaakten een detectabele cAMP-verhoging. Dit verschil kan worden toegeschreven aan verschillende factoren, waaronder de expressieniveaus van de bPAC-nLuc, de kenmerken van de stimulatie, de morfologie van de kern, de aanwezigheid van endogene PDE's, buffer-eiwitten, enz.

Terwijl andere gerichte of niet-gerichte optogenetische eiwitten meer diffuse verdelingen kunnen vertonen, ondersteunt deze systematische aanpak het trekken van zinvolle conclusies door zorgvuldig experimenten op te zetten en de gegevens te analyseren. Bovendien maakt deze aanpak het mogelijk om gerichte speciale celstructuren te richten (bijv. lamellipodia, dendrieten, primaire cilia, enz.), waardoor vergelijkingen tussen reacties in de distale en proximale gebieden van deze structuren en/of het cellichaam mogelijk worden.

Deze strategie kan ook worden gebruikt om de activering van downstream-elementen in de cAMP-route te beoordelen, zoals Proteïne Kinase A (PKA) of het uitwisselings-eiwit dat direct wordt geactiveerd door cAMP (EPAC1). Bovendien, aangezien bPAC-nLuc niet wordt beïnvloed door dezelfde modulatoren als endogene AC's, die kunnen worden beïnvloed door lokale interacties met eiwitten of andere factoren, kan worden aangenomen dat het consistent dezelfde hoeveelheid cAMP genereert gezien hetzelfde expressieniveau. Door de vermindering van cAMP-verhogingingen of de afname van cAMP-niveaus na een tijdelijke stijging te onderzoeken, stelt deze aanpak de evaluatie van cAMP-degradatie, diffusie of de functionaliteit en verdeling van endogene of getransfecteerde PDE's mogelijk. Deze strategie blijkt bijzonder nuttig voor het beoordelen van het gedrag van elk optogenetisch eiwit op verschillende cellocaties, waardoor de vooringenomenheid van het willekeurig plaatsen van stimulatieplekken in het cytoplasma wordt vermeden.

Het is belangrijk om in overweging te nemen dat de grootte van de stimulatieplek en zijn energie uiteindelijk afhankelijk zullen zijn van de specifieke kenmerken van het gebruikte setup (lichtbanen, objectieven, scansysteem, enz.). Om nauwkeurige resultaten te garanderen, moet bij het uitvoeren van elk experiment in elk specifiek systeem rekening worden gehouden met de relatieve expressie van het optogenetisch eiwit, de gevoeligheid van de cellen voor de gebruikte golflengte en alle andere parameters. Het is ook essentieel op te merken dat we niet het volledige bereik hebben bestudeerd waarin het systeem kan worden aangedreven bij het implementeren van kleinere stimulatieplekken en/of dichtere rasters (dwz minder beschikbare stimulatieplekken) om systematisch kleinere cellulaire structuren met verhoogde precisie te beoordelen. Bovendien hebben we deze strategie getest met alleen het UGA-42 Geo puntscansysteem. Deze aanpak kan mogelijk zijn met verschillende systemen, op voorwaarde dat ze reproduceerbaar gelijkmatig verdeelde lokale plekken kunnen genereren. Elk systeem moet worden geoptimaliseerd om vergelijkbare resultaten op te leveren.

Ten slotte moet de mogelijke stimulatie van FRET-sensoren door het stimulatiesysteem zorgvuldig worden geëvalueerd. Bijvoorbeeld, cyaan fluoresceine-eiwit (CFP) zal zeker worden gestimuleerd of zelfs gebleekt door de 445 nm laser die in dit protocol wordt gebruikt. Het gebruik van hogere laserpotenties (of hogere transmittance neutrale densiteit (ND) filters) zal de kansen op stimulatie van de fluorescente sensoren verhogen en, valse informatie in het experiment introduceren en/of problemen veroorzaken met de gegevensanalyse. De normale fotoblekening van de FRET/intensiteitssensoren moet ook zorgvuldig worden geëvalueerd. Ten slotte, aangezien bPAC gevoelig kan zijn voor omgevingslicht en cAMP kan genereren, zelfs in donkere omstandigheden (de donkere activiteit van bPAC is gemeten als

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
13 W Amber compact fluorescence bulb - Low Blue Lights	Photonic Developments
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)	Sigma	I7018
6-line multi-LED Lumencor Spectra X	Lumencor		6-line multi-LED light engine
Corning - DMEM	Thermo Fischer	MT10013CMEA
Corning - Regular fetal bovine serum	Thermo Fischer	MT35011CV
Cover glasses: circles	Thermo Fischer	12545102P
GBX-2 dark red safelight filter 5.5"	Kodak	1416827	Red safelight lamp
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 10x	Thermo Fischer	14185052	Diluted to 1x, adjusted pH
LDI-7	89 North
L-Glutamine	Thermo Fischer	BW17605E
Lipofectamine 3000	Thermo Fischer	L3000001	Transfection kit
Olympus IX83 motorized two-deck microscope	Olympus		Motorized two-deck microscope
Opti-MEM, no phenol red	Thermo Fischer	11058021
ORCA-fusion digital CMOS camera	Hamamatsu	C14440-20UP
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fischer	15140122
Phosphate buffered solution (1x)	Lonza	17516F
Prior emission filter wheel and filter sets	Prior Scientific, Inc.		Emission filter wheel
Prior Proscan XY stage	Prior Scientific, Inc.		XY stage
Slidebook 6	Intelligent Imaging Innovations		Digital microscopy software
SysCon software	SysCon Software		Software provided by the stimulation system
UGA-42 Geo	Rapp OptoElectronic
UPlanSApo 100x	Olympus		100x/1.4 NA oil objective (∞/0.17/FN26.5)
ZT458rdc dichroic	Chroma Technology Corp		BS, Wavelength (CWL): 498 nm