Methodenartikel

Dubbele immunofluorescentie van γH2AX en 53BP1 in humane perifere lymfocyten

3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65472

⸱

14 juli 2023

 ,  ,  , 
1Unità di Genetica, Dipartimento di Biologia, University of Pisa, 2Department of Women-Child-Newborn Obstetrics and Gynaecology, Foundation IRCCS Ca' Granda Ospedale Maggiore Policlinico

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een methode om de vorming en reparatie van DNA-dubbelstrengsbreuken te beoordelen door de gelijktijdige detectie van γH2AX- en 53BP1-foci in interfasekernen van met bleomycine behandelde menselijke perifere lymfocyten.

Samenvatting

Dubbele strengsbreuken (DSB's) zijn een van de ernstigste laesies die kunnen optreden in celkernen, en als ze niet worden gerepareerd, kunnen ze leiden tot ernstige resultaten, waaronder kanker. De cel is daarom voorzien van complexe mechanismen om DSB's te repareren, en deze routes omvatten histon H2AX in zijn gefosforyleerde vorm bij Ser-139 (namelijk γH2AX) en p53-bindend eiwit 1 (53BP1). Aangezien beide eiwitten foci kunnen vormen op de plaatsen van DSB's, wordt identificatie van deze markers beschouwd als een geschikte methode om zowel DSB's als hun kinetiek van reparatie te bestuderen. Volgens de moleculaire processen die leiden tot de vorming van γH2AX- en 53BP1-foci, zou het nuttiger kunnen zijn om hun co-lokalisatie in de buurt van de DSB's te onderzoeken om een alternatieve aanpak op te zetten die het mogelijk maakt DSB's te kwantificeren door de gelijktijdige detectie van twee DNA-schademarkers. Dit protocol heeft dus tot doel de genomische schade te beoordelen die in menselijke lymfocyten wordt veroorzaakt door het radiomimetische agens bleomycine door de aanwezigheid van γH2AX en 53BP1-foci in een dubbele immunofluorescentie. Met behulp van deze methodologie hebben we ook de variatie in het aantal γH2AX- en 53BP1-foci in de loop van de tijd afgebakend, als een voorlopige poging om de reparatiekinetiek van door bleomycine geïnduceerde DSB's te bestuderen.

Inleiding

DNA-schade wordt continu geïnduceerd door agentia die endogeen kunnen zijn, zoals ROS gegenereerd door cellulair oxidatief metabolisme, of exogene, zowel chemicaliën als fysisch1. Een van de meest schadelijke laesies spelen dubbelstrengsbreuken (DSB's) een fundamentele rol bij het bijdragen aan genomische instabiliteit, omdat ze chromosoomafwijkingen veroorzaken die op hun beurt het carcinogeneseproces kunnen initiëren. Zo worden cellen voorzien van complexe en efficiënte mechanismen van DSB's die repareren2.

Wanneer een DSB optreedt, activeert de cel de DNA-schaderespons (DDR) waarbij, samen met het MRE11 / RAD50 / NBS1-complex, ATM- of ATR-kinasen worden gerekruteerd om andere eiwitten te activeren die de celcyclus vertragen of stoppen3. Een essentieel doelwit van deze kinasen is histon H2AX, dat wordt gefosforyleerd op Ser-139 binnen enkele megabases van de DSB's (namelijk γH2AX), waardoor de rekrutering van verschillende reparatiefactoren mogelijk is, zoals onder andere BRCA1 en p53-bindend eiwit 1 (53BP1)3. Later wordt één route tussen homologe recombinatie (HR), niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of enkelstrengsgloeiing (SSA) geactiveerd om de DSB's 4,5 te repareren. Daarom is 53BP1 betrokken bij het dicteren van de keuze tussen HR of NHEJ, voornamelijk het bevorderen van de activering van NHEJ in plaats van HR6. Bovendien kunnen zowel de gefosforyleerde vorm van H2AX-histon als 53BP1 foci vormen op de plaatsen van DSB's. Aangezien deze foci blijven bestaan totdat de integriteit van de dubbele streng is hersteld, wordt het beoordelen van het verschijnen/verdwijnen van γH2AX of 53BP1 foci binnen een tijdsinterval beschouwd als een nuttige methode om het optreden en herstel van DSB's in een celsysteemte evalueren 6,7. Volgens de hierboven beschreven moleculaire processen kan het echter nuttig zijn om, aangezien γH2AX en 53BP1-foci naar verwachting samen in de buurt van de DSB's zullen lokaliseren tijdens DDR8,9, tegelijkertijd de aanwezigheid van deze markers in een dubbele immunofluorescentie te detecteren.

Het doel van dit manuscript was dus om de geschiktheid te evalueren van de gelijktijdige kwantificering van γH2AX en 53BP1 foci om de genomische schade geïnduceerd in menselijke perifere lymfocyten door het radiomimetische middel bleomycine te beoordelen. Met behulp van dezelfde methodologie probeerden we ook de reparatiekinetiek van door bleomycine geïnduceerde DSB's af te bakenen volgens een eerder opgezette experimentele procedure10.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Pisa en geïnformeerde en ondertekende toestemming werd verkregen van elke donor.

1. Vorming van γH2AX en 53BP1 foci

  1. Bereiding van monsters en mutagene behandeling
    1. Verzamel volbloedmonsters door venapunctie van gezonde volwassen personen in bloedafnamebuizen (bijv. Vacutainer) die lithiumheparine als anticoagulans bevatten.
    2. Om een goede bewaring van het bloedmonster te garanderen, start u de procedure binnen 24 uur na de bemonstering.
    3. Voeg 300 μL van het monster toe aan een buis met 4,7 ml volledig medium (0,5% penicilline-streptomycine, 0,75% fytohemagglutinine, 10% FBS eerder geïnactiveerd, 88,75% RPMI 1640).
    4. Voeg vervolgens bleomycinesulfaat toe tot een uiteindelijke concentratie van 5 μg / ml.
      LET OP: Bleomycinesulfaat is een mutageen. Vermijd huidcontact en inademing. Bereid de oplossing en voeg het monster toe onder een kap.
    5. Stel voor elk monster een negatieve controle in (afwezigheid van mutageen).
    6. Plaats de buis in een thermostaat op 37 °C gedurende 2 uur.
  2. Fixatie
    1. Centrifugemonsters bij 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet met vortex.
    3. Voeg 5 ml hypotone oplossing (2,87 g KCl opgelost in 500 ml gedeïoniseerd water) en 400 μl prefixatieve oplossing (5:3 azijnzuur: methanol) toe om hemolyse van rode bloedcellen te veroorzaken.
    4. Centrifugemonsters bij 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 5 ml methanol bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten om de cellen te fixeren.
    6. U kunt de cellen ook bewaren bij -20 °C tot gebruik.
  3. Dia's voorbereiding
    1. Centrifugemonsters bij 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in 5 ml van een 3:1 methanol: azijnzuuroplossing. Herhaal deze stappen nog een keer.
    3. Centrifugeer de oplossing aan het einde opnieuw op 540 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Zuig het supernatant opnieuw op en laat voldoende oplossing (0,5 ml) achter om de pellet te resuspenderen, pipetteer krachtig, laat de geresuspendeerde celpellet op de dia's vallen en droog aan de lucht. Bewaar de dia's bij 4 °C.
  4. Immunofluorescentie
    OPMERKING: Immunofluorescentie is een immunologische methode voor het identificeren van specifieke celdoelen met behulp van een primair antilichaam dat het doelwit zelf bindt en een fluorescerend secundair antilichaam dat het primaire bindt en waarmee het doelwit11 kan worden gelokaliseerd. In dit geval worden een muis monoklonale anti-53BP1 (1:50) en een konijn polyklonale anti-γH2AX (1:50) gebruikt als primaire antilichamen, terwijl AlexaFluor568 anti-muis (1:400) en DyLight488 anti-konijn (1:200) worden gebruikt als secundaire antilichamen, respectievelijk.
    1. Was de dia's twee keer in 50 ml 1x PBS gedurende 5 minuten in een couplin pot (16 dia's rug-aan-rug).
    2. Bewaar ze vervolgens gedurende 30 minuten in een blokkerende oplossing (10 ml FBS, 10 ml 10x PBS, 80 ml gedeïoniseerd water, 300 μl Triton-X).
    3. Voeg aan elke dia 10 μL van elk van de twee oplossingen toe die de primaire antilichamen bevatten die in de blokkerende oplossing zijn opgelost. Bedek de dia's met paraffinetape en incubeer een nacht bij 4 °C.
    4. Voer na incubatie drie wasbeurten uit in 1x PBS gedurende 5 minuten.
    5. Voeg aan elke dia 10 μL van elk van de twee oplossingen toe die de secundaire antilichamen bevatten die in de blokkerende oplossing zijn opgelost. Bedek de dia's met paraffinetape en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
    6. Voer drie wasbeurten uit in 1x PBS gedurende 5 min.
    7. Voeg vóór de montage 2,5 μL antifade-oplossing met DAPI toe aan de dekletters om de kernen tegen te gaan.
      OPMERKING: Om de focikinetiek te beoordelen, is de procedure dezelfde als beschreven van 1,1 tot 1,4, waarbij wordt opgemerkt dat celoogst en de dubbele immunofluorescentie worden uitgevoerd op 0 h, na 2 uur na de behandeling met bleomycine en vervolgens, na het verwijderen van de mutagene stof, op 4 h, 6 h en 24 h na de behandeling.

2. Analyse door een fluorescentiemicroscoop

OPMERKING: "Fluorescentiemicroscoop" verwijst naar elke microscoop die fluorescentie gebruikt om een afbeelding te genereren. Het monster wordt verlicht met licht van een specifieke golflengte (of golflengten) dat wordt geabsorbeerd door de fluoroforen, waardoor ze licht van langere golflengtenuitzenden 12. AlexaFluor568 en DyLight 488 absorberen licht van ongeveer 568 en 488 nm en zenden licht uit van respectievelijk 603 en 520 nm. Ze zijn dus zichtbaar als rode of groene fluorescentie met behulp van respectievelijk een TRITC- of een FITC-filter.

  1. Scoor de aanwezigheid van foci in elke dia onder een 100x onderdompelingsdoel (figuur 1).
  2. Scoor 200 kernen per dia en tel het aantal γH2AX/53BP1 foci in elke kern.
  3. Express-resultaten in termen van het gemiddelde aantal foci per totaal gescoorde kernen. Deze omvatten zowel γH2AX/53BP1 positieve (met ten minste één fluorescentiesignaal) als negatieve (geen fluorescentiesignaal) kernen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Gegevens verkregen door de fluorescentiemicroscoopanalyse van perifere lymfocyten stellen ons in staat om drie hoofdaspecten te evalueren: de effectiviteit van bleomycinebehandeling bij het verhogen van het aantal γH2AX- en 53BP1-foci (en dus van DSB's) vanwege het mutagene effect, in welke mate beide foci co-gelokaliseerd zijn op de plaats van DSB's, en het tijdsverloop van γH2AX en 53BP1-foci om de reparatiekinetiek van bleomycine-geïnduceerde DSB's af te bakenen. Zoals verwacht werd een zeer hogere frequentie van zowe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Immunofluorescentieanalyse van γH2AX en 53BP1 foci is een geschikte methode voor het beoordelen van genomische schade in interfasekernen van een celsysteem. Deze procedure heeft verschillende kritieke punten die de uitkomst van de experimenten kunnen beïnvloeden, voornamelijk de middelen die worden gebruikt bij fixatie en permeabilisatie, het type antilichamen en hun verdunningsfactoren en de concentratie van het mutagene beeld.

Het behoud van eiwitintegriteit is van fundamenteel belang, omdat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn de volbloeddonoren en al het gezondheidspersoneel dat de bloedmonsters heeft genomen dankbaar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1)InvitrogenA2112453BP1 secundair antilichaam
BleoprimSanofibleomycin sulfaat (mutageen)
Penicillin-streptomycin oplossing 100XEurocloneECB3001Dantibiotica voor kweekmedium
PBS 10XTermofisher14200075Fosfaat-gebufferde zoutoplossing
FBSEurocloneEC20180LFetaal Rundserum voor immunofluorescentie
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 GeconjugeerdTermofisher#35552γH2AX secundair antilichaam
Muis anti-53BP1 monoklonaal antilichaamMerckMAB 380253BP1 primair antilichaam
Labophot 2NikonFluorescentiemicroscoop
P-histone H2AX (Ser139) konijnenantilichaamCell Signaling#2577γH2AX primair antilichaam
PhytohemagglutinineTermofisherR30852801component van kweekmedium
Prolong gold antifade reagent met DAPICell Signaling#8961Antifade oplossing met DAPI voor contrakleuring
RPMI 1640EurocloneECB9006LKweekmedium
Triton-X100SigmaT9284Nonionogene detergent voor permeabilisatie

Referenties

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853(2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617(2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. 10, Cold Spring Harbor Protocol. (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931(2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77(2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516(2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks - are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gamma H2AX53BP1 focihumane lymfocytendubbelstrengs breukenDNA schademarkersbleomycinebehandelingkwantificering van fociherstelkinetiekco lokalisatieanalyse

Gerelateerde artikelen