Method Article

Generatie van Centromeer-geassocieerde proteïne-E CENP-E-/- knock-outcellijnen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem

DOI:

10.3791/65476

⸱

June 23rd, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel rapporteert de constructie van centromeer-geassocieerde proteïne-E (CENP-E) knock-outcellen met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem en drie op fenotype gebaseerde screeningstrategieën. We hebben de CENP-E knock-out cellijn gebruikt om een nieuwe benadering vast te stellen om de specificiteit en toxiciteit van de CENP-E-remmers te valideren, wat nuttig is voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en biologisch onderzoek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het CRISPR-systeem (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 systeem is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor nauwkeurige en efficiënte genbewerking in een verscheidenheid aan organismen. Centromeer-geassocieerd eiwit-E (CENP-E) is een plus-end-gerichte kinesine die nodig is voor het vangen van kinetochoor-microtubuli, chromosoomuitlijning en controlepunt van de spoelassemblage. Hoewel de cellulaire functies van de CENP-E-eiwitten goed zijn bestudeerd, was het moeilijk om de directe functies van CENP-E-eiwitten te bestuderen met behulp van traditionele protocollen, omdat CENP-E-ablatie meestal leidt tot activering van het controlepunt van de spoelassemblage, stopzetting van de celcyclus en celdood. In deze studie hebben we het CENP-E-gen in menselijke HeLa-cellen volledig uitgeschakeld en met succes de CENP-E-/- HeLa-cellen gegenereerd met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem.

Er werden drie geoptimaliseerde op fenotypen gebaseerde screeningstrategieën vastgesteld, waaronder screening van celkolonies, fenotypes van chromosoomuitlijning en de fluorescerende intensiteiten van CENP-E-eiwitten, die de screeningsefficiëntie en het experimentele slagingspercentage van de CENP-E-knock-outcellen effectief verbeteren. Belangrijk is dat CENP-E-deletie resulteert in chromosoommislijning, de abnormale locatie van de BUB1 mitotische checkpoint serine/threonine kinase B (BubR1)-eiwitten en mitotische defecten. Verder hebben we het CENP-E knock-out HeLa-celmodel gebruikt om een identificatiemethode voor CENP-E-specifieke remmers te ontwikkelen.

In deze studie is een bruikbare benadering vastgesteld om de specificiteit en toxiciteit van CENP-E-remmers te valideren. Bovendien presenteert dit artikel de protocollen van CENP-E-genbewerking met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem, wat een krachtig hulpmiddel zou kunnen zijn om de mechanismen van CENP-E in celdeling te onderzoeken. Bovendien zou de CENP-E knock-out cellijn bijdragen aan de ontdekking en validatie van CENP-E-remmers, die belangrijke implicaties hebben voor de ontwikkeling van antitumorgeneesmiddelen, studies van celdelingsmechanismen in de celbiologie en klinische toepassingen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gemanipuleerde genoombewerking bemiddelt de gerichte modificaties van genen in een verscheidenheid aan cellen en organismen. In eukaryoten kan plaatsspecifieke mutagenese worden geïntroduceerd door de toepassing van sequentiespecifieke nucleasen die homologe recombinatie van doelwit-DNAstimuleren 1. In de afgelopen jaren zijn verschillende genoombewerkingstechnologieën, waaronder zinkvingernucleasen (ZFN's)2,3, transcriptieactivatorachtige effectornucleasen (TALEN's)4,5 en homing-meganucleasen 6,7, ontwikkeld om genomen op specifieke plaatsen te splitsen, maar deze benaderingen vereisen complexe eiwitengineering en overbodige experimentele procedures. Studies hebben aangetoond dat het type II prokaryotisch geclusterde regelmatig uit elkaar geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)/Cas-systeem een efficiënte genbewerkingstechnologie is, die specifiek RNA-geleide, plaatsspecifieke DNA-splitsing bemiddelt in een grote verscheidenheid aan cellen en soorten 8,9,10,11. De CRISPR/Cas9-gen-knock-outtechnologie heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van basisbiologie, biotechnologie en geneeskunde12.

Bacteriën en de meeste archaea hebben een op RNA gebaseerd adaptief immuunsysteem ontwikkeld dat CRISPR- en Cas-eiwitten gebruikt om virussen en plasmiden te identificeren en tevernietigen. Pyogenes van Streptococcus Cas9 (SpCas9) endonuclease bevat het RuvC-achtige Holliday junction resolvase (RuvC) en His-Asn-His (HNH) domein, dat sequentiespecifieke, dubbelstrengs breuken (DSB's) efficiënt kan mediëren door een synthetisch single-guide RNA (sgRNA) te leveren dat CRISPR-RNA's (crRNA) en transactiverend crRNA (tracrRNA) bevat14,15,16. DSB's kunnen worden gerepareerd via de indelvormende niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of homologiegerichte reparatie (HDR)-route, die meerdere mutaties introduceert, waaronder inserties, deleties of littekenloze substituties met één nucleotide, in zoogdiercellen 1,8. Zowel de foutgevoelige NHEJ als de high-fidelity HDR-route kunnen worden gebruikt om gen-knock-out te mediëren door inserties of deleties, wat frameshift-mutaties en voortijdige stopcodons kan veroorzaken10.

Kinesine-7 CENP-E is vereist voor de aanhechting van kinetochoor-microtubuli en chromosoomuitlijning tijdens celdeling 17,18,19. Antilichaammicro-injectie 20,21, siRNA-depletie22,23, chemische remming 24,25,26 en genetische deletie 27,28,29 van CENP-E leidt tot chromosoomafwijking, de activering van het controlepunt van de spoelassemblage en mitotische defecten, wat resulteert in aneuploïdie en chromosomale instabiliteit 19,30. Bij muizen resulteert CENP-E-deletie in abnormale ontwikkeling en embryonale letaliteit in de zeer vroege stadia van ontwikkeling 27,29,31. Genetische deletie van CENP-E leidt meestal tot een verkeerde uitlijning van chromosomen en celdood 26,27,29, wat een obstakel vormt bij het bestuderen van de functies en mechanismen van de CENP-E-eiwitten.

Een recente studie heeft een voorwaardelijke CENP-E knock-out cellijn vastgesteld met behulp van een Auxine-induceerbare CRISPR/Cas9-genbewerkingsmethode32, die een snelle afbraak van CENP-E-eiwitten in relatief korte tijd mogelijk maakt33. Tot op heden zijn er echter geen stabiele CENP-E knock-out cellijnen tot stand gebracht, wat een onopgeloste technische uitdaging is in de CENP-E-biologie. Gezien genetische robuustheid34, genetische compensatieresponsen 35,36,37 en complexe intracellulaire omgevingen, aangezien de directe gevolgen van volledige deletie van CENP-E complex en onvoorspelbaar kunnen zijn, is het belangrijk om CENP-E knock-outcellijnen vast te stellen voor het onderzoek naar mechanismen van chromosoomuitlijning, controlepunt van de spindelassemblage en stroomafwaartse signaalroutes.

De ontdekking en toepassingen van CENP-E-remmers zijn belangrijk voor de behandeling van kanker. Tot op heden zijn zeven soorten CENP-E-remmers gevonden en gesynthetiseerd, waaronder GSK923295 en zijn derivaten24,25, PF-277138,39, imidazo[1,2-a]pyridinesteigerderivaten40,41, verbinding-A42,43, syntelin44,45, UA6278446 en benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazoolderivaten47. Onder deze remmers is GSK923295 een allosterische en efficiënte CENP-E-remmer die zich bindt aan het motorische domein van CENP-E en CENP-E microtubuli-gestimuleerde ATPase-activiteit remt met een Ki van 3,2 ± 0,2 nM24,25. Vergeleken met de remmende effecten van GSK923295 op gekweekte kankercellen, zijn de therapeutische effecten van GSK923295 bij klinische kankerpatiënten echter niet ideaal48,49, wat ook aanleiding gaf tot bezorgdheid over de specificiteit van GSK923295 voor CENP-E. Bovendien zijn de specificiteit en bijwerkingen van andere CENP-E-remmers op de CENP-E-eiwitten belangrijke kwesties in kankeronderzoek.

In deze studie hebben we het CENP-E-gen in HeLa-cellen volledig uitgeschakeld met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem. Er zijn drie geoptimaliseerde op fenotypen gebaseerde screeningstrategieën vastgesteld, waaronder screening van celkolonies, fenotypes van chromosoomuitlijning en de fluorescerende intensiteiten van CENP-E-eiwitten, om de screeningefficiëntie en het slagingspercentage van CENP-E-genbewerking te verbeteren. Bovendien kunnen CENP-E knock-out cellijnen worden gebruikt om de specificiteit van kandidaat-verbindingen voor CENP-E te testen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Constructie van de CRISPR/Cas9 gen knock-out vectoren

  1. Selecteer de genomische doel-DNA-sequentie op het humane CENP-E-gen (GenBank Accession No. NM_001286734.2) en ontwerp het sgRNA met behulp van een online CRISPR-ontwerptool (http://crispor.tefor.net/).
  2. Voer een enkele genomische sequentie in, selecteer het genoom van "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNP's): dbSNP148", en selecteer het protospacer aangrenzende motief "20 bp-NGG-spCas9". Kies twee gidssequenties, waaronder sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' en sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', volgens de specificiteitsscores50, de voorspelde efficiëntie10 en de minimale off-targets.
  3. Bestel en synthetiseer de enkelstrengs DNA-oligonucleotiden (ssODN's). Verdun de ssODN's in ddH2O tot een eindconcentratie van 100 μM. Om de sgRNA-oligo's te fosforyleren en te gloeien, voegt u 1 μL voorwaartse oligo, 1 μL omgekeerde oligo, 0,5 μL T4-polynucleotidekinase, 1 μL T4-polynucleotidekinasebuffer en 6,5 μL RNasevrij water toe in een polymerasekettingreactie (PCR)-buis, en incubeert u de buis bij 37 °C gedurende 30 min, 95 °C gedurende 5 minuten; vervolgens afdalen tot 25 °C bij 5 °C min-1.
  4. Verteer het pX458-plasmide met behulp van het Bbs-restrictie-enzymfigure-protocol-1 . Voeg 1 μg van het pX458-plasmide, 2 μL 10x buffer G, 1 μL Bbsfigure-protocol-2 toe en voeg RNasevrije ddH2O toe aan 20 μL in een centrifugebuisje van 1,5 ml. Incubeer de buis gedurende 2 uur bij 37 °C. Zuiver vervolgens het lineaire plasmide met behulp van de DNA-gelextractiekit met kolom volgens de protocollen van de fabrikant.
  5. Ligate de sgRNA-oligo's in het pX458-plasmide (pSpCas9(BB)-2A-groen fluorescerend proteïne (GFP)-plasmide, Addgene ID. 48138). Voeg 1 μL van de gegloeide oligonucleotiden, 25 ng van het lineaire plasmide, 1 μL 10x T4 DNA-ligatiebuffer, 0,5 μL T4-DNA-ligase (350 E/μL) toe en vul aan tot 10 μL met ddH2O in een centrifugebuis van 1,5 ml. Incubeer de ligatieoplossing gedurende 2 uur bij 16 °C.
  6. Incubeer 10 μL van het geconstrueerde plasmide met de competente DH5α-cellen gedurende 30 minuten op ijs, hitteschok bij 42 °C gedurende 45 s en plaats ze onmiddellijk gedurende 5 minuten op ijs. Voeg 500 μL Luria-Bertani (LB) medium toe en zaai de cellen op een LB-plaat met ampicilline (100 μg/ml). Incubeer het gedurende 16 uur bij 37 °C en zeef de resistente klonen.
  7. Selecteer 5-10 enkelvoudige kolonies met een gesteriliseerde pipetpunt en breng ze over naar een 1 ml kweek van LB-medium met ampicilline (100 μg/ml). Incubeer de cultuur bij 37 °C en schud deze gedurende 12-16 uur bij 180 omw/min.
  8. Isoleer het plasmide-DNA met behulp van een plasmide-extractiekit volgens de protocollen van de fabrikant. Valideer het plasmide-DNA van elke kolonie door Sanger-sequencing van de U6-promotorplaats met behulp van de U6-Fwd-primer 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'.
  9. Extraheer en zuiver de plasmiden met behulp van de endovrije plasmide-DNA-kit volgens de protocollen van de fabrikant.

2. Transfectie, isolatie en screening van de CENP-E knock-out HeLa-cellen

  1. Kweek HeLa-cellen in Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  2. Incubeer de HeLa-cellen met 0,25% trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) bij 37 °C gedurende 2-3 minuten, dissocieer de cellen door voorzichtig te pipetteren en zaai de cellen vervolgens in nieuwe platen met een verdunningsverhouding van 1:4 voor celpassage.
  3. Zaai de cellen in een plaat met 12 putjes en kweek tot 60-70% samenvloeiing vóór transfectie. Transfecteer de pX458-sgRNA-plasmiden in HeLa-cellen met behulp van de reagentia waarnaar wordt verwezen volgens de protocollen van de fabrikant (zie de materiaaltabel).
    1. Meng voorzichtig 1 μg gevalideerd pX458-sgRNA-plasmide en 50 μL gereduceerd serummedium in buis A. Meng vervolgens voorzichtig 2 μL van het transfectiereagens en 50 μL gereduceerd serummedium in buis B. Incubeer buisjes A en B afzonderlijk bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
    2. Meng zowel buis A als buis B voorzichtig en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Voeg het mengsel toe aan een bord met 12 putjes, incubeer de cellen gedurende 6 uur en vervang het medium door een vers DMEM-medium.
  4. Onderzoek HeLa-cellen na 24 uur of 48 uur met behulp van een fluorescentiemicroscoop voor transfectie-efficiëntie. Na transfectie gedurende 48 uur de getransfecteerde HeLa-cellen volledig dissociëren met 0,25% trypsine/EDTA bij 37 °C gedurende 3-5 minuten, het aantal cellen tellen met behulp van een Neubauer-kamer of een geautomatiseerde celteller en de cellen in drie afzonderlijke platen met 96 putjes voor elke getransfecteerde populatie volgens seriële verdunningsmethoden10.
  5. Breng de cellen terug naar een bevochtigde incubator en kweek ze vervolgens nog 1-2 weken. Verander het kweekmedium eens in de 3 dagen. Voor de fenotype-gebaseerde screening en validatie van CENP-E knock-out, dissocieert en breidt u de cellen uit in platen met 24 of 12 putjes gedurende 5-7 dagen.
  6. Screen de gemuteerde cellen met kleinere celkoloniediameters met behulp van een omgekeerde microscoop uitgerust met 10x en 20x objectieflenzen.
    OPMERKING: CENP-E-mutaties resulteren meestal in een significante toename van het aantal delende cellen in celkolonies, wat een van de belangrijkste indicatoren kan zijn voor het screenen van de CENP-E-mutante cellen.
  7. Oogst de cellen voor DNA-extractie met behulp van de kolom dierlijke genomische DNA-extractiekit volgens de protocollen van de fabrikant. Stel de PCR-reacties als volgt in: 0,25 μL Taq-polymerase, 5 μL 10x buffer (Mg2+ plus), 4 μL dNTP-mengsels, 500 ng DNA-sjabloon, 1 μL voorwaartse oligo, 1 μL omgekeerde oligo, en pas ddH2O aan tot 50 μL. Gebruik de volgende PCR-programma-instellingen voor genamplificatie: 98 °C, 10 s; 98 °C, 10 s, 55 °C, 30 s, 72 °C, 60 s gedurende 33 cycli; 72 °C, 10 min, en vervolgens 4 °C vasthouden.
    OPMERKING: De specifieke primers voor het klonen van de doellocus worden als volgt vermeld: CENP-E target F1, 5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-E-doel R1, 5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; CENP-E-streefdoel F2, 5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-E doel R2, 5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'.
  8. Ligate het doel-DNA in de pMD18-T-vector volgens de protocollen van de fabrikant. Transfecteer het geligeerde plasmide in competente DH5α-cellen en kweek voor selectie van klonen.
  9. Voer Sanger-sequencing uit om de soorten CENP-E-knock-out te bepalen. Isoleer het plasmide-DNA met behulp van een plasmide-extractiekit volgens de protocollen van de fabrikant. Voer Sanger-sequencing uit van het plasmide-DNA van elke kolonie met behulp van de M13 voorwaartse en achterwaartse primers. M13F primer, 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3'; M13R primer, 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'.
  10. Zaai de wildtype en CENP-E mutante HeLa-cellen op glazen dekglaasjes van 12 mm in een plaat met 24 putjes. Verwijder het volledige DMEM-medium en fixeer de cellen gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde/fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur.
  11. Kleuring van de kernen met de 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Screenen en valideren van de CENP-E-mutante cellen op basis van het fenotype van chromosoomuitlijning met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een Plan Fluor 40x/ Numerical Aperture (NA) 0,75-objectief.
  12. Screenen en valideren van de CENP-E knock-out cellen met behulp van immunofluorescentiekleuring en -analyse (zie rubriek 3) van CENP-E eiwitten.

3. Immunofluorescentiekleuring en confocale microscopie met hoge resolutie

  1. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde/PBS-fixeeroplossing bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en dompel ze 2 x 5 minuten onder in 1x PBS.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de cellen in gezonde staat verkeren en dat de cellen voorzichtig worden verzameld en gefixeerd om loslating van de metafasecellen te voorkomen.
  2. Permeabiliseer de cellen met 0,25% Triton X-100/PBS bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en dompel ze onder in 1x PBS gedurende 2 x 5 minuten.
  3. Blokkeer de cellen met 1% BSA/PBST (0.1% Tween 20 in PBS) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verdun de primaire antilichamen met 1% BSA/PBST en incubeer de monsters gedurende 12 uur bij 4 °C.
  4. Gooi de primaire antilichaamoplossingen weg, spoel de cellen 3 x 5 minuten met 1x PBS en incubeer de cellen met verdunde secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  5. Gooi de secundaire antilichamen weg en spoel de cellen in 1x PBS gedurende 3 x 5 min.
  6. Kleur de kernen met DAPI bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Monteer de geleiders met het montagemedium. Verzegel de glaasjes met nagellak.
  7. Observeer en registreer de fluorescentiebeelden met behulp van een confocale scanmicroscoop die is uitgerust met een 63x/NA 1.40-objectief.

4. Chromosoomvoorbereiding en karyotype-analyse

  1. Kweek de wildtype en CENP-E-/- HeLa-cellen in volledig DMEM-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine gedurende 24 uur en incubeer vervolgens de wildtype en CENP-E-/- HeLa-cellen met 300 nM colchicine gedurende 5 uur.
  2. Incubeer de cellen met 0,25% trypsine/EDTA bij 37 °C gedurende 3 minuten en verzamel de cellen in centrifugebuisjes van 1,5 ml.
  3. Centrifugeer de cellen bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gooi de supernatanten weg, voeg 1,2 ml 0,075 mol/L KCl-oplossing toe en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
  4. Centrifugeer de cellen bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, gooi de supernatanten weg, voeg 0,2 ml van de fixeeroplossing (methanol: ijsazijn = 3:1) toe voor voorfixatie en meng voorzichtig gedurende 1 min.
  5. Centrifugeer de cellen bij 1.000 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, vang de pellets op, voeg 1,5 ml fixeeroplossing toe bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij kamertemperatuur bij 1.000 × g .
  6. Gooi de supernatanten weg, voeg 0,6 ml van de fixeeroplossingen toe en bereid een celsuspensie. Voeg 3-5 druppels van de celsuspensies toe vanaf een hoogte van 35-40 cm op de ijsglijbanen.
    NOTITIE: Houd de hoogte voor het losmaken van de celophangingen op de objectglaasjes op 35-40 cm; Anders kunnen de chromosomen te verspreid of niet van elkaar gescheiden zijn.
  7. Droog de objectglaasjes onmiddellijk af met een alcohollamp, beits de monsters gedurende 7 minuten met 10% Giemsa-kleuringsoplossing, spoel de objectglaasjes gedurende 2 minuten af met stromend water en observeer de monsters met een lichtmicroscoop die is uitgerust met een Plan Fluor 40x/NA 0,75-objectief.

5. Bepaling van de vorming van celkolonies

  1. Bereid de celsuspensies in de platen met 6 putjes voor bij een celdichtheid van 1.000-2.000 cellen/putje. Schud de platen voorzichtig om de cellen gelijkmatig te verdelen.
  2. Plaats de platen met 6 putjes in een CO2 -incubator en incubeer gedurende 2-3 weken bij 37 °C met 5% CO2 . Verander eens in de 5 dagen van kweekmedium. Neem de beelden op met een omgekeerde microscoop die is uitgerust met 10x en 20x objectieflenzen. Oogst de cellen wanneer kolonies zichtbaar zijn (honderden cellen binnen een kloon).
  3. Om de effecten van GSK923295 te bestuderen, kweekt u de cellen in de platen met 6 putjes gedurende 24 uur en voegt u 2 ml GSK923295 toe in de uiteindelijke concentraties van 10, 25, 50, 100 en 200 nM.
    OPMERKING: Verplaats de kweekschaal niet in het vroege stadium van kloonvorming om celuitscheiding te voorkomen, die nieuwe klonen kan vormen en de screening van getransfecteerde cellen kan beïnvloeden.
  4. Gooi het kweekmedium weg en fixeer de cellen met 1% PFA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Kleur de kolonies met 0,1% kristalviolette kleuroplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Spoel de monsters drie keer met 1x PBS. Neem de beelden van celkolonies op en kwantificeer de diameters van elke kolonie met behulp van ImageJ-software. Kies het selectiegereedschap Rechte lijn , klik op Analyseren, kies Meten en noteer de lengte.
  5. Spoel de kolonies met 1 ml 10% azijnzuuroplossing gedurende 5 minuten. Breng 200 μL van de supernatantoplossingen over in een plaat met 96 putjes en meet de absorptiewaarden met behulp van een microplaatspectrofotometer bij A600 nm.

6. Bepaling van de levensvatbaarheid van de cel

  1. Zaai de cellen in de platen met 24 putjes en kweek de cellen gedurende 48 uur tot een dichtheid van 80-90%.
  2. Incubeer de cellen met 100 μL 0,25% trypsine/EDTA bij 37 °C gedurende 3 minuten.
  3. Meng 400 μL PBS met de cellen met een pipetpistool. Breng 100 μL van de celsuspensies over in de plaat met 96 putjes.
  4. Voeg in elk putje 20 μl MTS-oplossing toe met een eindconcentratie van 317 μg/ml en meng voorzichtig volgens de protocollen van de fabrikant. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 1-3 uur in een CO2 -incubator.
  5. Noteer de extinctiewaarden van elk putje bij de extincantiepiek van A490 nm met behulp van een microplaatspectrofotometer. Gebruik een referentiegolflengte van A630 nm om de achtergrond af te trekken die wordt bijgedragen door celresten en niet-specifieke absorptie (levensvatbaarheid van de cel = A490 nm - A630 nm).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De CENP-E-/- HeLa-cellen zijn met succes gegenereerd met behulp van het CRISPR/Cas9-systeem (Figuur 1). De tijdlijn en de kritische experimentele stappen van deze methode zijn weergegeven in figuur 1. Eerst hebben we de CENP-E-specifieke sgRNA's ontworpen en gesynthetiseerd, de sgRNA's gegloeid en geligeerd in het pX458-plasmide, het plasmide getransfecteerd in HeLa-cellen en ze gedurende 48 uur gekweekt. De getransfecteerde cellen w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kinesine-7 CENP-E is een belangrijke regulator in de uitlijning van chromosomen en het controlepunt van de spoelassemblage tijdens celdeling 17,19,20. Genetische deletie van CENP-E resulteert meestal in de activering van het controlepunt van de spindelassemblage, het stoppen van de celcyclus en celdood 27,29,51,52.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken alle leden van het Cytoskeleton Laboratory van de Fujian Medical University voor nuttige discussies. We danken Jun-Jin Lin, Zhi-Hong Huang, Ling Lin, Li-Li Pang, Lin-Ying Zhou, Xi Lin en Min-Xia Wu van het Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor hun technische assistentie. We danken Si-Yi Zheng, Ying Lin en Qi Ke van het Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences aan de Fujian Medical University voor hun steun. Deze studie werd ondersteund door de volgende subsidies: National Natural Science Foundation of China (subsidienummer 82001608 en 82101678), Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (subsidienummer 2019J05071), de Joint Funds for the Innovation of Science and Technology, de provincie Fujian, China (subsidienummer 2021Y9160) en Fujian Medical University high-level talents scientific research start-up funding project (subsidienummer XRCZX2017025).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1.5 mL centrifuge tubeAxygenMCT-150-C
24-well plateCorning3524
4S Gelred, 10,000x in waterSangon Biotech (Shanghai)A616697
50 mL centrifuge tubeCorning430828
6 cm Petri dishCorning430166
95% ethanolSinopharm Chemical Reagent10009164
96-well plateCorning3599
Acetic acidSinopharm Chemical Reagent10000218Dissolve in H2O om een 10% werkoplossing te bereiden.
AgaroseSangon Biotech (Shanghai)A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)BeyotimeA0428Voor immunofluorescentie. Oplossen in 1% BSA/PBST. 1:500 verdunning.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)BeyotimeA0423Voor immunofluorescentie. Oplossen in 1% BSA/PBST. 1:500 verdunning.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)BeyotimeA0460Voor immunofluorescentie. Oplossen in 1% BSA/PBST. 1:500 verdunning.
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibodyAbcamab254326Voor immunofluorescentie. Oplossen in 1% BSA/PBST. 1:100 verdunning 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibodySanta Cruz Biotechnologysc-376392Voor immunofluorescentie. Oplossen in 1% BSA/PBST. 1:50 verdunning.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibodyAbcamab133583Voor immunofluorescentie. Oplossen in 1% BSA/PBST. 1:100 verdunning.
Anti-fade mounting mediumBeyotimeP0131Vertraagt het blussen van fluorescente signalen.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibodyAbcamab7291Voor immunofluorescentie. Oplossen in 1% BSA/PBST. 1:100 verdunning.
Biotek Epoch Microplate SpectrophotometerBiotek InstrumentsBiotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)Sinopharm Chemical Reagent69003435
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assayPromegaG3580
CentrifugeEppendorf5424BK745380
ColchicineSinopharm Chemical Reagent61001563
Confocal scanning microscopeLeicaLeica TCS SP8
CoverslipCITOTEST80344-1220
DAPIBeyotimeC1006
DH5α competent cellsSangon Biotech (Shanghai)B528413
DL2000 DNA markerTaKaRa3427A
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)GibcoC11995500BT
Endo-free plasmid mini kit figure-materials-1OmegaD6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification KitSangon Biotech (Shanghai)B518251
Fetal bovine serumZhejiang Tianhang Biotechnology11011-8611
Gentian violetSinopharm Chemical Reagent71019944Oplossen in PBS om 0,1% gentian violet/PBS te bereiden.
Giemsa staining solutionSinopharm Chemical Reagent71020260
GraphPad Prism version 8.0 softwareGraphPadwww.graphpad.comStatistische analyse.
GSK923295MedChemExpressHY-10299
HeLa cell lineATCCCCL-2
Humidified incubatorHeal ForceHF90/HF240
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Beeldverwerking en -analyse.
Inverted microscopeNanjing Jiangnan Novel OpticsXD-202
LB agar powderSangon Biotech (Shanghai)A507003
Lipo6000 transfection reagentBeyotimeC0526
Nikon Ti-S2 microscopeNikonTi-S2
Opti-MEM reduced serum mediumGibco31985070
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent80096618Oplossen in PBS om 4% paraformaldehyde/PBS te bereiden.
Penicillin-streptomycin solutionHyCloneSV30010
SanPrep column DNA gel extraction kitSangon Biotech (Shanghai)B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kitSangon Biotech (Shanghai)B518191
T4 DNA ligaseTaKaRa2011A
T4 polynucleotide kinaseTaKaRa2021A
TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001A
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent30188928Oplossen in PBS om 0,25% Triton X-100/PBS te bereiden.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent30189328Oplossen in PBS om 0,1% Tween 20/PBS te bereiden.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., Marraffini, L. A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology. 31 (3), 233-239 (2013).
  2. Bibikova, M., Beumer, K., Trautman, J. K., Carroll, D. Enhancing gene targeting with designed zinc finger nucleases. Science. 300 (5620), 764(2003).
  3. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  4. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: a widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  5. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333 (6040), 307(2011).
  6. Stoddard, B. L. Homing endonuclease structure and function. Quarterly Reviews of Biophysics. 38 (1), 49-95 (2005).
  7. Pâques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  8. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  9. Shmakov, S., et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Molecular Cell. 60 (3), 385-397 (2015).
  10. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  11. Jia, N., Patel, D. J. Structure-based functional mechanisms and biotechnology applications of anti-CRISPR proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (8), 563-579 (2021).
  12. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  13. Horvath, P., Barrangou, R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science. 327 (5962), 167-170 (2010).
  14. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  15. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  16. Jackson, S. A., et al. CRISPR-Cas: Adapting to change. Science. 356 (6333), eaal5056(2017).
  17. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  18. Craske, B., Welburn, J. P. I. Leaving no-one behind: how CENP-E facilitates chromosome alignment. Essays in Biochemistry. 64 (2), 313-324 (2020).
  19. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  20. Schaar, B. T., Chan, G. K., Maddox, P., Salmon, E. D., Yen, T. J. CENP-E function at kinetochores is essential for chromosome alignment. Journal of Cell Biology. 139 (6), 1373-1382 (1997).
  21. McEwen, B. F., et al. CENP-E is essential for reliable bioriented spindle attachment, but chromosome alignment can be achieved via redundant mechanisms in mammalian cells. Molecular Biology of the Cell. 12 (9), 2776-2789 (2001).
  22. Yao, X., Abrieu, A., Zheng, Y., Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. CENP-E forms a link between attachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitotic checkpoint. Nature Cell Biology. 2 (8), 484-491 (2000).
  23. Kim, Y., Heuser, J. E., Waterman, C. M., Cleveland, D. W. CENP-E combines a slow, processive motor and a flexible coiled coil to produce an essential motile kinetochore tether. Journal of Cell Biology. 181 (3), 411-419 (2008).
  24. Qian, X., et al. Discovery of the first potent and selective inhibitor of Centromere-Associated Protein E: GSK923295. ACS Medicinal Chemistry Letters. 1 (1), 30-34 (2010).
  25. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  26. Pisa, R., Phua, D. Y. Z., Kapoor, T. M. Distinct mechanisms of resistance to a CENP-E inhibitor emerge in near-haploid and diploid cancer cells. Cell Chemical Biology. 27 (7), 850.e6-857.e6 (2020).
  27. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  28. Weaver, B. A., Silk, A. D., Montagna, C., Verdier-Pinard, P., Cleveland, D. W. Aneuploidy acts both oncogenically and as a tumor suppressor. Cancer Cell. 11 (1), 25-36 (2007).
  29. Silk, A. D., et al. Chromosome missegregation rate predicts whether aneuploidy will promote or suppress tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (44), E4134-E4141 (2013).
  30. Guo, Y., Kim, C., Ahmad, S., Zhang, J., Mao, Y. CENP-E-dependent BubR1 autophosphorylation enhances chromosome alignment and the mitotic checkpoint. Journal of Cell Biology. 198 (2), 205-217 (2012).
  31. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Aneuploidy: instigator and inhibitor of tumorigenesis. Cancer Research. 67 (21), 10103-10105 (2007).
  32. Nishimura, K., Fukagawa, T. An efficient method to generate conditional knockout cell lines for essential genes by combination of auxin-inducible degron tag and CRISPR/Cas9. Chromosome Research. 25 (3-4), 253-260 (2017).
  33. Owa, M., Dynlacht, B. A non-canonical function for Centromere-associated protein-E controls centrosome integrity and orientation of cell division. Communications Biology. 4 (1), 358(2021).
  34. Barabási, A. L., Oltvai, Z. N. Network biology: understanding the cell's functional organization. Nature Reviews Genetics. 5 (2), 101-113 (2004).
  35. Rossi, A., et al. Genetic compensation induced by deleterious mutations but not gene knockdowns. Nature. 524 (7564), 230-233 (2015).
  36. Ma, Z., et al. PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components. Nature. 568 (7751), 259-263 (2019).
  37. El-Brolosy, M. A., et al. Genetic compensation triggered by mutant mRNA degradation. Nature. 568 (7751), 193-197 (2019).
  38. Kung, P. P., et al. Chemogenetic evaluation of the mitotic kinesin CENP-E reveals a critical role in triple-negative breast cancer. Molecular Cancer Therapeutics. 13 (8), 2104-2115 (2014).
  39. Kim, J. H., et al. Development of a novel HAC-based "gain of signal" quantitative assay for measuring chromosome instability (CIN) in cancer cells. Oncotarget. 7 (12), 14841-14856 (2016).
  40. Hirayama, T., et al. Synthetic studies of centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 1. Exploration of fused bicyclic core scaffolds using electrostatic potential map. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (17), 5488-5502 (2013).
  41. Hirayama, T., et al. Synthetic studies on Centromere-associated protein-E (CENP-E) inhibitors: 2. Application of electrostatic potential map (EPM) and structure-based modeling to Imidazo[1,2-a]pyridine derivatives as anti-tumor agents. Journal of Medicinal Chemistry. 58 (20), 8036-8053 (2015).
  42. Ohashi, A., et al. A novel time-dependent CENP-E inhibitor with potent antitumor activity. PLoS One. 10 (12), e0144675(2015).
  43. Ohashi, A., et al. Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells. Nature Communications. 6, 7668(2015).
  44. Ding, X., et al. Probing CENP-E function in chromosome dynamics using small molecule inhibitor syntelin. Cell Research. 20 (12), 1386-1389 (2010).
  45. Liu, X., et al. Phase separation drives decision making in cell division. Journal of Biological Chemistry. 295 (39), 13419-13431 (2020).
  46. Henderson, M. C., et al. UA62784, a novel inhibitor of centromere protein E kinesin-like protein. Molecular Cancer Therapeutics. 8 (1), 36-44 (2009).
  47. Yamane, M., et al. Identification of benzo[d]pyrrolo[2,1-b]thiazole derivatives as CENP-E inhibitors. Biochemical and biophysical research communications. 519 (3), 505-511 (2019).
  48. Lock, R. B., et al. Initial testing of the CENP-E inhibitor GSK923295A by the pediatric preclinical testing program. Pediatric Blood & Cancer. 58 (6), 916-923 (2012).
  49. Chung, V., et al. First-time-in-human study of GSK923295, a novel antimitotic inhibitor of centromere-associated protein E (CENP-E), in patients with refractory cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 69 (3), 733-741 (2012).
  50. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  51. Weaver, B. A., Cleveland, D. W. Decoding the links between mitosis, cancer, and chemotherapy: The mitotic checkpoint, adaptation, and cell death. Cancer Cell. 8 (1), 7-12 (2005).
  52. Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. Killing cells by targeting mitosis. Cell Death and Differentiation. 19 (3), 369-377 (2012).
  53. Dang, Y., et al. Optimizing sgRNA structure to improve CRISPR-Cas9 knockout efficiency. Genome Biology. 16, 280(2015).
  54. Ratz, M., Testa, I., Hell, S. W., Jakobs, S. CRISPR/Cas9-mediated endogenous protein tagging for RESOLFT super-resolution microscopy of living human cells. Scientific Reports. 5, 9592(2015).
  55. Koch, B., et al. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  56. Yan, Q., et al. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering enhanced by Drosha-mediated sgRNA-shRNA structure. Scientific Reports. 6, 38970(2016).
  57. Cheng, Y., et al. CRISPR/Cas9-mediated chicken TBK1 gene knockout and its essential role in STING-mediated IFN-β induction in chicken cells. Frontiers in Immunology. 9, 3010(2019).
  58. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  59. Zeng, W., Guo, L., Xu, S., Chen, J., Zhou, J. High-throughput screening technology in industrial biotechnology. Trends in Biotechnology. 38 (8), 888-906 (2020).
  60. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nature Biotechnology. 33 (2), 187-197 (2015).
  61. Kim, D., et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nature Biotechnology. 34 (8), 863-868 (2016).
  62. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature. 533 (7603), 420-424 (2016).
  63. Nishimasu, H., et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 361 (6408), 1259-1262 (2018).
  64. Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
  65. Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
  66. Pickar-Oliver, A., Gersbach, C. A. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (8), 490-507 (2019).
  67. Nalawansha, D. A., Gomes, I. D., Wambua, M. K., Pflum, M. K. H. HDAC inhibitor-induced mitotic arrest is mediated by Eg5/KIF11 acetylation. Cell Chemical Biology. 24 (4), 481.e5-492.e5 (2017).
  68. Kavalapure, R. S., et al. Design, synthesis, and molecular docking study of some 2-((7-chloroquinolin-4-yl) amino) benzohydrazide Schiff bases as potential Eg5 inhibitory agents. Bioorganic Chemistry. 116, 105381(2021).
  69. Calligaris, D., Lafitte, D. Chemical inhibitors: the challenge of finding the right target. Chemistry & Biology. 18 (5), 555-557 (2011).
  70. Łomzik, M., et al. Metal-dependent cytotoxic and kinesin spindle protein inhibitory activity of Ru, Os, Rh, and Ir half-sandwich complexes of Ispinesib-derived ligands. Inorganic Chemistry. 59 (20), 14879-14890 (2020).
  71. Ferro, L. S., et al. Structural and functional insight into regulation of kinesin-1 by microtubule-associated protein MAP7. Science (New York, N.Y.). 375 (6578), 326-331 (2022).
  72. Atherton, J., et al. The mechanism of kinesin inhibition by kinesin-binding protein. eLife. 9, e61481(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CENP E KnockoutCRISPR Cas9HeLa CellsGene EditingChromosome AlignmentPhenotype ScreeningMitotic DefectsFluorescence MicroscopyKaryotype AnalysisCell Cycle Arrest

Related Articles