Het induceren van pseudopregnancy bij vrouwelijke muizen zonder de noodzaak van vasectomie bij mannen voorafgaand aan niet-chirurgische embryotransfer of kunstmatige inseminatie

Summary

De gepresenteerde cervicale manipulatiemethode kan pseudozwangerschap bij muizen induceren zonder dat het nodig is om vrouwtjes te fokken met vasectomie mannetjes. De inductie van pseudozwangerschap is vereist voor het succes van niet-chirurgische embryotransfer en niet-chirurgische kunstmatige inseminatie, die beide ook worden gepresenteerd.

Abstract

Voor het succesvol handhaven van de zwangerschap met embryotransfer of kunstmatige inseminatie, moeten vrouwelijke ontvangende muizen worden geïnduceerd in een pseudopregnant toestand. Vrouwelijke muizen worden traditioneel 's nachts gepaard met vasectomie mannetjes en de volgende ochtend wordt de aanwezigheid van een copulatieplug beoordeeld. Om de efficiëntie van het produceren van pseudopregnant vrouwtjes te verhogen, is een cervicale manipulatietechniek gestandaardiseerd om te worden gebruikt in combinatie met niet-chirurgische embryotransfer of kunstmatige inseminatietechnieken bij muizen. Het stompe uiteinde van een klein plastic staafje wordt vaginaal ingebracht om contact te maken met de baarmoederhals en wordt gedurende 30 s getrild door contact met een trimmer. De procedure is snel en vereist geen anesthesie of analgesie. Deze techniek verhoogt de betrouwbaarheid en voorspelbaarheid van het produceren van pseudopregnant vrouwtjes en elimineert volledig de behoefte aan vasectomie mannen. Voor CD1-muizen was de efficiëntie van pseudopregnancy-inductie met behulp van cervicale manipulatie 83% voor vrouwtjes in oestrus (N = 76), maar slechts 38% van de vrouwtjes in oestrus werd verstopt door vasectomie mannetjes (N = 24). Kunstmatige inseminatie bij CD1-muizen werd uitgevoerd door oestrussynchronisatie met hormonen, cervicale manipulatie en de baarmoederoverdracht van sperma. Ontvangers van kunstmatige inseminatie die cervicale manipulatie kregen (N = 76) hadden een zwangerschapspercentage van 72% en een gemiddelde nestgrootte van 8,3 pups. Deze methode kan ook worden gebruikt om pseudopregnant vrouwtjes te produceren voor niet-chirurgische embryotransfer. Daarom is het induceren van pseudozwangerschap door cervicale manipulatie een handig en efficiënt alternatief voor paring met een vasectomie bij het uitvoeren van niet-chirurgische geassisteerde voortplantingstechnieken. Het gebruik van cervicale manipulatie biedt 3V's (vervanging, vermindering en verfijning) voordelen voor geassisteerde voortplantingstechnieken door het aantal benodigde dieren te verminderen en de noodzaak voor chirurgisch veranderde mannetjes te elimineren.

Introduction

Geassisteerde voortplantingstechnologieën worden gebruikt voor de productie van genetisch gemodificeerde muismodellen, evenals het herstel van stammen uit cryopreservatie, de rederivatie van stammen uit een gecompromitteerde gezondheidstoestand en strategisch vivariumbeheer, inclusief de productie van leeftijdsgematchte cohorten. Alle geassisteerde voortplantingstechnieken bij muizen vereisen het gebruik van pseudopregnant vrouwelijke ontvangers voor embryo-ontwikkeling. Historisch gezien zijn pseudopregnant ontvangers gegenereerd door paring met steriele mannetjes, die chirurgisch vasectomie of genetisch onvruchtbaar zijn, en de aanwezigheid van een copulatieplug wordt de volgende ochtend beoordeeld¹. Onlangs is een protocol voor sonische stimulatie bij muizen ontwikkeld voor de chirurgische overdracht van pronucleaire of tweecellige muizenembryo's². We hebben ook een cervicale manipulatie (CM) protocol ontwikkeld voor gebruik bij kunstmatige inseminatie en de niet-chirurgische embryotransfer van blastocysten. De reden voor het gebruik van de procedure is om een vermindering van 3Rs van het aantal benodigde dieren te bieden (waarvoor geen mannelijke muizen meer nodig zijn) en een verfijning van de gebruikte technieken (niet langer de chirurgische vasectomieprocedure voor mannelijke muizen nodig). De beschrijving van dit protocol omvat de bijbehorende geassisteerde voortplantingstechniek om te helpen bij de integratie van CM in normale workflows. Het algemene doel van de CM-methode is om het gebruik van mannelijke muizen bij het genereren van pseudopregnant vrouwtjes te vervangen voor geassisteerde voortplantingstechnieken, waaronder kunstmatige inseminatie en embryotransfer.

Het CM-protocol dat hier wordt beschreven, is voor het eerst ontwikkeld om te helpen bij kunstmatige inseminatie bij muizen. Het kunstmatige inseminatieprotocol, zoals oorspronkelijk beschreven, bereikte een drachtpercentage van 50%, met een gemiddelde nestgrootte van 7 pups³. CD1-ontvangende muizen werden oestrus gesynchroniseerd met een lage dosis hormonen, waaronder zwangere merrie serumgonadotrofine (PMSG) en humaan choriongonadotrofine (hCG), met een interval van 47 uur voorafgaand aan inseminatie. Een voordeel van oestrussynchronisatie was dat het gebruik van het protocol tijdens normale werkuren mogelijk was. Vrouwtjes werden onmiddellijk na kunstmatige inseminatie gepaard met vasectomie en de paring werd bevestigd door de aanwezigheid van een copulatieplug. Inconsistentie in de paringssnelheid met ontvangers werd gemeld als een moeilijkheid in de procedure. Daarom werd gezocht naar alternatieven voor de paring voor de inductie van pseudopregnancy.

De huidige studie presenteert een gestandaardiseerde CM-techniek om de efficiëntie van het produceren van pseudopregnant vrouwtjes te verhogen. Voor vrouwen in oestrus of proestrus wordt het stompe uiteinde van een kleine plastic staaf vaginaal ingebracht om contact te maken met de baarmoederhals en wordt gedurende 30 s getrild door contact met een trimmer. De procedure wordt uitgevoerd op een kooi met draad. Er is geen anesthesie of analgesie vereist. De CM-techniek is handig voor het produceren van pseudopregnant vrouwtjes, die nesten kunnen produceren na niet-chirurgische kunstmatige inseminatie zonder de noodzaak van paring met vasectomie mannetjes. CM kan ook worden gebruikt voor de productie van pseudopregnant vrouwtjes als ontvangers van embryotransfer. In het bijzonder kan de CM-techniek worden gecombineerd met niet-chirurgische embryotransfer, zoals hier beschreven. Niet-chirurgische methoden zijn effectief gebleken voor de embryotransfer van blastocyststadiumembryo's bij muizen ^4,5 en ratten ^6,7. Omdat deze niet-chirurgische methode een effectief alternatief is voor chirurgische methoden, wordt het beschouwd als een 3V-verfijning van de techniek. Op basis van eerder onderzoek geven fecale corticosteronspiegels, als een maat voor stress, aan dat de niet-chirurgische aard van de procedure het stressniveau bij knaagdieren niet verhoogt ^7,8. De procedures zijn technisch minder uitdagend dan chirurgische embryotransfer en zijn veel sneller uit te voeren. Terwijl de embryo's naar de baarmoeder worden overgebracht, moeten embryo's van het juiste stadium voor baarmoederontwikkeling worden overgebracht. Voor muizen worden blastocysten overgebracht naar 2,5 dagen na coïtum (dpc) pseudopregnant ontvangers.

Voor de twee hier beschreven niet-chirurgische technieken verschilt de timing van de hormoontoediening en de CM-techniek. De timing van de CM-procedure ten opzichte van oestrus is belangrijk voor succes, omdat het natuurlijke paring vervangt voor de productie van pseudopregnant ontvangers. Door het elimineren van de noodzaak voor vasectomie mannetjes om pseudozwangerschap te induceren, biedt deze procedure 3V's voordelen door zowel het aantal benodigde dieren te verminderen als de noodzaak voor chirurgisch veranderde mannetjes te elimineren. De procedure zelf is snel (30 s) en vereist geen anesthesie of analgesie. De techniek verhoogt de betrouwbaarheid en voorspelbaarheid van het produceren van pseudopregnant vrouwtjes voor geassisteerde voortplanting aanzienlijk.

Protocol

Alle toepasselijke internationale, nationale en institutionele richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren werden gevolgd. Alle procedures die werden uitgevoerd in studies met dieren waren in overeenstemming met de ethische normen van de ParaTechs Corporation Institutional Animal Care and Use Committee en uitgevoerd volgens de normen die zijn voorgeschreven door het Office of Laboratory Animal Welfare, National Institutes of Health, Public Health Service, United States Department of Health and Human Services. Mannelijke en vrouwelijke CD1 (ICR) en vrouwelijke C57Bl / 6J-muizen van >8 weken oud werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden verkregen uit commerciële bronnen (zie tabel met materialen).

1. Cervicale manipulatieprocedure voor gebruik met kunstmatige inseminatie bij CD1-muizen

1. Gesynchroniseerde ovulatie van vrouwelijke muizen op dag 1 en dag 3
   1. Injecteer vrouwelijke muizen met 2,5 IE PMSG (zie tabel met materialen) via intraperitoneale injectie (IP) op dag 1, 0,5 uur vóór het begin van de donkere vivariumcyclus.
      OPMERKING: Elke mannelijke donor zal voldoende sperma leveren voor 10 vrouwelijke ontvangers.
   2. Injecteer de vrouwtjes met 2,5 IE hCG (zie tabel met materialen) via IP-injectie op dag 3, 1 uur vóór het begin van de donkere cyclus van het vivarium.
      OPMERKING: De timing van de injecties, spermaoverdracht en lichtcyclus ten opzichte van elkaar zijn erg belangrijk. De tijden die voor alle procedures in dit protocol zijn gespecificeerd, zijn gebaseerd op een licht/donkercyclus van 12 uur.
2. Verzameling en capacitatie van vers sperma op dag 4
   1. Bereid een druppel van 500 μL sperma pre-incubatiemedium (PM, zie tabel met materialen) in een weefselkweekschaal van 60 mm onder paraffineolie. Bereid één gerecht per mannelijke donor. Evenwicht gedurende ten minste 30 minuten bij 37 °C en 5% CO₂ voorafgaand aan het verzamelen van sperma.
   2. Op 1 uur na het begin van de vivariumlichtcyclus, euthanaseer de man (en) volgens institutionele richtlijnen. Elk mannetje levert voldoende sperma voor 10 kunstmatige inseminaties.
   3. Ontleed snel de cauda epididymides van de muis. Voer een transversale abdominale incisie boven de blaas uit met behulp van een dissectieschaar en een getande tang.
      1. De testiculaire vetkussentjes bevinden zich aan weerszijden van de blaas. Pak een van de testiculaire vetkussentjes met een gebogen tang en verwijder de testis en bijbal uit de lichaamsholte. Identificeer de cauda epididymis als een platte ovale buisvormige structuur net onder de testis.
      2. Houd de cauda bijbal vast met een gebogen tang en reseceer met een kleine, schuine schaar. Verwijder beide cauda epididymiden en breng ze over naar een absorberend weefsel om vet en bloed te verwijderen onder een ontleedmicroscoop.
   4. Breng twee cauda epididymiden in elke druppel van 500 μL gebalanceerde PM onder paraffineolie bij 37 °C. Knip het weefsel door zes incisies te maken met een kleine schaar. Als meer dan één mannelijke donor wordt gebruikt, gebruik dan één bijbal van elke donor voor elk spermamonster om de variatie tussen monsters te verminderen.
   5. Draai de schaal voorzichtig rond en laat het sperma gedurende 3 minuten het weefsel verlaten en draai eenmaal per minuut. Verwijder alle tissues.
   6. Incubeer het spermamonster gedurende 45 minuten tot 1 uur bij 37 °C en 5% CO₂ om te capaciteren.
   7. Optioneel: Meet het aantal zaadcellen en beoordeel de beweeglijkheid onder een microscoop met behulp van een hemocytometer. Voor het tellen, verdun het sperma in PM indien nodig.
3. Bevestiging van oestruscyclussynchronisatie door cytologische evaluatie
   1. Gebruik een klein, voorbevochtigd wattenstaafje (zie tabel met materialen) en verzamel voorzichtig vaginale cellen van de vaginale wand door het wattenstaafje tegen het weefsel te rollen, smeer ze in een druppel steriel water van 20 μL op een microscoopglaasje en droog ze aan de lucht.
   2. Evalueer onder een microscoop met behulp van 100x vergroting met heldere veldverlichting op de aanwezigheid van verhoornde epitheelcellen. Vrouwtjes in oestrus of late proestrus hebben verhoornde epitheelcellen aanwezig en moeten worden geselecteerd voor cervicale manipulatie.
   3. Optioneel: Noteer het gewicht van de vrouwelijke ontvangers voorafgaand aan de inseminatie.
4. Het uitvoeren van de cervicale manipulatie (CM)
   1. Plaats ongeveer 0,5 uur voorafgaand aan de inseminatie een ontvangend vrouwtje op de bovenkant van een kooi met een draadrek, zodat de muis het oppervlak van de kooibalk kan "grijpen". Grijp in de buurt van de basis van de staart met behulp van de duim en wijsvinger en hoek de staart naar boven terwijl het dier wordt gestabiliseerd (figuur 1).
      OPMERKING: De muis houdt stil voor de duur van de procedure wanneer de hanteringstechniek correct wordt uitgevoerd. Als de muis uit positie beweegt, verplaatst u zich voorzichtig en gaat u verder. Als een agressief dier als ontvanger wordt gekozen, kan het kalmerend zijn om het dier tijdens de procedure in een verrijkingstunnel te laten stappen. Het gebruik van de tunnel is optioneel, maar het kan onderzoekers helpen bij het omgaan met de dieren door afleiding te bieden tijdens deze procedure.
   2. Steek het stompe uiteinde van een klein plastic staafje (zie Materiaaltabel) vaginaal in om contact te maken met de baarmoederhals en tril gedurende 30 s door contact met een trimmer (zie Materiaaltabel).
      OPMERKING: Plaats de hengel op zijn plaats voordat u de trimmer start. Beide worden tijdens de procedure in één hand gehouden. Er is geen anesthesie of analgesie vereist.
5. Niet-chirurgische spermaoverdracht voor kunstmatige inseminatie
   1. Plaats de inseminatievoorziening (zie materiaaltabel) op een P200-pipet die is ingesteld op 40 μl en verwijder de beschermkap.
   2. Verwijder een aliquot van het capacitieve spermamonster uit de schaal bij 37 °C en 5% CO₂ en breng het over in een weefselkweekschaal van 35 mm zonder olie bij 37 °C. Het spermamonster wordt onmiddellijk gebruikt voor overdracht.
      OPMERKING: Het sperma verliest snel beweeglijkheid buiten de CO 2-incubator. Houd het gecapaciteerde spermamonster zoveel mogelijk op 37 °C en 5% CO₂.
   3. Druk de pipetzuiger tot de eerste stop, laat de katheterpunt bij 37 °C in het spermamonster zakken en laad het sperma langzaam in het overbrengapparaat. Vermijd klonten. Verwijder resterende olie van de buitenkant van het inseminatieapparaat met behulp van een absorberend weefsel. Zet de pipet apart.
      OPMERKING: De overdracht van paraffineolie naar de baarmoederhoorn moet worden vermeden. Verwijder resterende olie van de buitenkant van het inseminatieapparaat met behulp van een absorberend weefsel.
   4. Plaats het ontvangende vrouwtje op de bovenkant van de draadrekkooi. Houd de muis op zijn plaats met dezelfde hanteringstechniek die wordt gebruikt voor de CM; Grijp in de buurt van de basis van de staart met behulp van de duim en wijsvinger en hoek de staart naar boven terwijl het dier wordt gestabiliseerd.
   5. Plaats het kleine speculum (zie Tabel met materialen) in de vagina.
   6. Breng de katheter van het inseminatieapparaat in het speculum, door de baarmoederhals en in de baarmoeder. Zodra de apparaathub contact maakt met het speculum, geeft u het sperma af door de pipetzuiger naar de eerste stop te drukken. Vermijd de overdracht van extra lucht in de baarmoederhoorn.
      OPMERKING: Als de katheter niet correct is geplaatst, raakt deze het weefsel rond de baarmoederhals, waardoor deze buigt en uiteindelijk buigt. Als de katheter bij de eerste poging niet door de baarmoederhals glijdt, zet u de katheter voorzichtig terug en probeert u deze opnieuw totdat deze succesvol is. Herpositionering van het speculum kan nodig zijn.
   7. Verwijder het apparaat en speculum. Er is geen controle na de procedure vereist.
6. Optioneel: Zwangerschapscontrole op dag 10-12
   1. Gebruik gewichtstoename om de zwangerschapsstatus te bepalen. Gewichtstoename zal afhankelijk zijn van de belasting, maar een toename van ten minste 1-2 g correleert met zwangerschap.

Figuur 1: De muis-holding techniek voor cervicale manipulatie. De muis rust op een draadkooitop en is gestabiliseerd aan de staart en aan beide zijden aan de voorkant van de achterpoten. Het stompe uiteinde van een klein plastic staafje wordt vaginaal ingebracht om contact te maken met de baarmoederhals en wordt getrild door contact met een trimmer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Niet-chirurgische embryotransferprocedure voor gebruik met cervicale manipulatie bij CD1-muizen

1. Gesynchroniseerde ovulatie van de vrouwelijke muizen op dag 1 en dag 3
   1. Injecteer vrouwelijke muizen met 2,5 IE PMSG via IP-injectie op dag 1, ongeveer 6 uur na het begin van de vivariumlichtcyclus.
   2. Injecteer de vrouwtjes met 2,5 IE hCG via IP-injectie op dag 3, met een interval van 47 uur na de PMSG-injectie of ongeveer 5 uur na het begin van de vivariumlichtcyclus.
2. Bevestiging van oestruscyclussynchronisatie door cytologische evaluatie
   1. Op dag 3, ongeveer 1 uur voorafgaand aan de CM, voert u cytologie uit op de potentiële ontvangers. Gebruik een klein, voorbevochtigd wattenstaafje en verzamel voorzichtig vaginale cellen van de vaginale wand door het wattenstaafje tegen het weefsel te rollen, smeer ze in een druppel steriel water van 20 μL op een microscoopglaasje en droog ze aan de lucht.
   2. Evalueer onder een microscoop met behulp van 100x vergroting met heldere veldverlichting op de aanwezigheid van verhoornde epitheelcellen. Vrouwtjes in oestrus of late proestrus hebben verhoornde epitheelcellen aanwezig en moeten worden geselecteerd voor cervicale manipulatie.
   3. Optioneel: Noteer het gewicht van de potentiële vrouwelijke embryo-ontvangers.
3. Het uitvoeren van de CM
   1. Op dag 3, 1 uur voorafgaand aan het begin van de vivarium donkere cyclus, plaatst u een ontvangend vrouwtje op de bovenkant van een kooi met een draadrek, waardoor het dier het oppervlak van de kooibalk kan "grijpen". Grijp in de buurt van de basis van de staart met behulp van de wijsvinger en de duim en hoek vervolgens de staart omhoog terwijl het dier wordt gestabiliseerd (figuur 1).
      OPMERKING: De muis houdt stil voor de duur van de procedure wanneer de hanteringstechniek correct wordt uitgevoerd. Als de muis uit positie beweegt, verplaatst u zich voorzichtig en gaat u verder. Als een agressief dier als ontvanger wordt gekozen, kan het kalmerend zijn om het dier tijdens de procedure in een verrijkingstunnel te laten stappen.
   2. Steek het stompe uiteinde van een kleine plastic staaf vaginaal in om contact te maken met de baarmoederhals en tril het gedurende 30 s door contact met een trimmer.
      OPMERKING: Plaats de hengel op zijn plaats voordat u de trimmer start. Beide worden tijdens de procedure in één hand gehouden. Er is geen anesthesie of analgesie vereist.
4. Niet-chirurgische embryotransfer op dag 6
   1. Breng een druppel M2-medium van 20 μL (zie materiaaltabel) op het deksel van een weefselkweekschaal.
      OPMERKING: Het deksel is gekozen omdat het een kortere rand heeft en dus handig is voor toegang tot de embryo's in de druppel. Leg op geen enkel moment paraffineolie over de druppel M2, omdat het introduceren van olie in de baarmoederhoorn de embryotransfer negatief lijkt te beïnvloeden.
   2. Laad onder een microscoop en met behulp van reflecterende verlichting 10-20 blastocysten in de mediumdruppel met behulp van een standaard pipet voor het hanteren van embryo's (zie tabel met materialen).
      OPMERKING: Het optimale aantal embryo's dat moet worden overgedragen, is afhankelijk van de muizenstam en eventuele manipulaties die de embryo's hebben ondergaan. Voor gezonde ongemanipuleerde embryo's zou het terugplaatsen van 10-15 embryo's voldoende moeten zijn. Voor rederivatie of genetisch gemodificeerde embryo's is de terugplaatsing van meer embryo's geschikt.
   3. Bevestig het niet-chirurgische embryotransferapparaat (zie materiaaltabel) op een P2-pipet die is ingesteld op 1,8 μl. Verwijder het beschermkapje van de katheter.
   4. Druk de zuiger van de pipet tot de eerste stop, laat de punt van de katheter in het medium zakken en trek de embryo's langzaam in de katheterpunt van het apparaat. Verwijder de punt van het medium.
      OPMERKING: Het visualiseren van de embryo's onder lage vergroting zal het gemakkelijker maken om de embryo's in het apparaat te laden. Als de embryo's in de druppel zijn verspreid, schudt u de schaal voorzichtig van links naar rechts om de embryo's in het midden van de druppel te concentreren, of verplaatst u ze met behulp van een pipet voor het hanteren van embryo's.
   5. Stel het pipetvolume in op 2,0 μL om een kleine luchtbel aan de punt van de katheter te genereren. Leg voorzichtig de pipet met de embryo's geladen in de buurt van de muizenkooi.
   6. Plaats het ontvangende vrouwtje op de bovenkant van de draadrekkooi. Houd de muis op zijn plaats met dezelfde hanteringstechniek die wordt gebruikt voor CM; Grijp in de buurt van de basis van de staart met behulp van de wijsvinger en de duim en draai vervolgens de staart omhoog terwijl het dier wordt gestabiliseerd.
   7. Plaats een klein speculum (zie Tabel met materialen) in de vagina.
   8. Breng de katheter van het transferapparaat in het speculum, door de baarmoederhals en in de baarmoeder. Zodra de apparaathub contact maakt met het speculum, doseert u de embryo's door de pipetzuiger naar de eerste stop te drukken. Vermijd de overdracht van extra lucht in de baarmoederhoorn.
   9. Verwijder het apparaat en het speculum zonder de pipetzuiger los te laten. Er is geen controle na de procedure vereist.

Results

Omdat elektrische⁹ en^{sonic 10} cervicale stimulatie zijn gebruikt om pseudozwangerschap bij ratten te induceren, presenteert dit werk een gestandaardiseerde mechanische procedure die bij muizen kan worden gebruikt. Vaginale cytologie kan helpen bij de identificatie van vrouwtjes in verschillende stadia van oestrus. Om pseudozwangerschap bij vrouwen te bevestigen, werd dezelfde methode gebruikt. Ten eerste werden cytologieprofielen voor vrouwtjes vergeleken voor CD1- en C57Bl / 6-muizen gedurende oestruscycli, tijdens de zwangerschap en tijdens pseudopregnancy geïnduceerd door paring of CM. Vaginale swabs werden van de vrouwtjes genomen en gekleurd met behulp van een Papanicolaou-kleuringssysteem (zie tabel met materialen). De cellen werden waargenomen onder 100x vergroting met felle veldverlichting. De waargenomen cellen omvatten leukocyten, nucleated epitheliale cellen en anucleate cornified epitheliale cellen. De bepaling van de oestruscyclusfase was gebaseerd op het relatieve percentage van elk celtype^11,12. Oestrus wordt gekenmerkt door het overwicht van verhoornde epitheelcellen. Naarmate de oestrus eindigt, begint metestrus en beginnen leukocyten te verschijnen, terwijl verhoornde epitheelcellen minder duidelijk worden. Diestrus heeft een matige tot lage cellulariteit, waarbij leukocyten overheersen en nucleated epitheliale cellen beginnen te verschijnen. Proestrus onderscheidt zich door het verlies van leukocyten, een toename van nucleated epitheliale cellen en het verschijnen van verhoornde epitheelcellen. Na proestrus begint de oestrus en gaat de cyclus verder.

Om een basislijnprofiel te ontwikkelen, werd vaginale cytologie geregistreerd voor ten minste twee volledige oestruscycli voor elk vrouwtje (N = 20 voor CD1, N = 20 voor C57Bl / 6) voorafgaand aan de paring. De cycluslengtes en individuele profielen varieerden tussen de muizen; de verwachte algemene trends werden echter waargenomen. De gemiddelde lengte van een oestruscyclus voor de CD1- en C57Bl/6-muizen was 3,8 dagen, met een bereik van 3-5 dagen. De dag voordat de natuurlijke paring plaatsvond, waren alle vrouwelijke muizen in proestrus. Na de paring werd de cytologie 1,5 dag na het coïtum (dpc) opnieuw uitgevoerd totdat de oestruscyclus werd hervat. Figuur 2 toont het cytologische profiel voor pseudopregnant CD1 en C57Bl/6 vrouwtjes gepaard met vasectomie mannetjes.

Figuur 2: Cytologisch profiel voor pseudopregnant vrouwelijke muizen. De gemiddelde percentages van elk celtype voor leukocyten, nucleated epitheliale cellen en cornified epitheliale cellen worden weergegeven als een functie van dagen na coïtum (DPC) voor (A) CD1 (N = 20) en (B) C57Bl / 6 (N = 20) muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In dit werk is een CM-techniek gestandaardiseerd om de efficiëntie van het produceren van pseudopregnant vrouwtjes te verhogen. Voor vrouwen in oestrus of proestrus wordt het stompe uiteinde van een kleine plastic staaf vaginaal ingebracht om contact te maken met de baarmoederhals en wordt gedurende 30 s getrild door contact met een trimmer. De procedure wordt uitgevoerd op een kooi met draad. Er is geen anesthesie of analgesie vereist. Om de effectiviteit van de CM-procedure te bepalen, werd vaginale cytologie vergeleken voor vrouwelijke CD1 (N = 20) en C57Bl/6 (N = 20) muizen na paring met vasectomie mannetjes en na CM (totaal N = 40). Het cytologische profiel van pseudopregnancy geïnduceerd door CM was vergelijkbaar met het profiel van pseudopregnancy geïnduceerd door paring, zoals weergegeven in figuur 3.

Figuur 3: Cytologisch profiel voor pseudopregnant vrouwelijke muizen na cervicale manipulatie (CM). Het percentage van elk celtype voor leukocyten, nucleated epitheliale cellen en cornified epitheliale cellen worden weergegeven als een functie van dagen na coïtum (DPC) of dagen na cervicale manipulatie (DPCM). De gemiddelde celtypepercentages worden weergegeven voor de CD1- en C57Bl/6-muizen (N = 40) (A) gepaard met vasectomie mannetjes of (B) na CM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om te bepalen of de CM-techniek voldoende is om zwangerschap vast te stellen voor geassisteerde voortplanting, werd CM uitgevoerd als onderdeel van een niet-chirurgisch protocol voor kunstmatige inseminatie (NSAI) bij CD1-vrouwen. Het kunstmatige inseminatieprotocol omvatte oestrussynchronisatie van de vrouwtjes met een lage dosis van de hormonen PMSG en hCG voorafgaand aan spermaoverdracht. CM werd uitgevoerd vlak voor de spermaoverdracht. Voor CD1-muizen was de efficiëntie van pseudopregnancy-inductie met CM voor vrouwtjes in oestrus (N = 76) met deze techniek 83%. In een controle-experiment werd slechts 38% van de vrouwtjes in oestrus verstopt door vasectomie mannetjes (N = 24). De ontvangers van kunstmatige inseminatie die cervicale manipulatie kregen (N = 76) hadden een zwangerschapspercentage van 72% en een gemiddelde nestgrootte van 8,3 pups. Inductie van pseudopregnancy door CM is dus een handige en efficiënte vervanging voor paring met een vasectomie mannetje bij het uitvoeren van NSAI. Het gebruik van CM om CD1-ontvangers (N = 4) in oestrus voor te bereiden op de niet-chirurgische embryotransfer van verse CD1-blastocysten resulteerde in een zwangerschapspercentage van 100%. De terugplaatsing van 9-15 embryo's leverde drie gezonde nesten op met een geboortecijfer van 45% en een gemiddelde nestgrootte van 6 pups. Ter vergelijking: de CD1-ontvangers (N = 20) die werden gepaard met vasectomiemannen om pseudozwangerschap te induceren, hadden een zwangerschapspercentage van 80% en een geboortecijfer van 46% na de overdracht van 20 verse B6C3F2-blastocysten.

Resultaten voor geassisteerde voortplantingstechnieken zullen waarschijnlijk stamspecifiek zijn, aangezien variabelen zoals de dosis en timing van hormoontoediening voor superovulatie stamafhankelijk bleken te zijn¹³. Bovendien kunnen factoren zoals de leeftijd en het gewicht van de ontvanger de reactie op hormonen^{beïnvloeden 14}. In dit werk, bij het uitvoeren van de CM-procedure voor kunstmatige inseminatie, bleken alleen vrouwen in late proestrus of oestrus responsief te zijn. Over het algemeen worden de vrouwtjes, om het aantal beschikbare ontvangers in een populatie te verhogen, eerst oestrus-gesynchroniseerd met een lage dosis hormonen³. Oestrussynchronisatie met 2,5 IE PMSG en hCG was 78% effectief voor 11-14 weken oude CD1-vrouwtjes (N = 27) en 60% effectief voor 18-32 weken oude C57Bl/6 vrouwtjes (N = 22) in dit werk. De efficiëntie van pseudopregnancy-inductie met behulp van cervicale manipulatie bij CD1-vrouwen was 83% voor vrouwen in oestrus (N = 76) en 82% (N = 100) voor C57Bl / 6-vrouwen in oestrus met deze techniek.

Discussion

De 3V's is een ethisch kader voor diergebruik in onderzoek, zoals beschreven in 1959 door Russel en Burch in "The Principles of Humane Experimental Technique"¹⁵. De 3V's staan voor vervanging, vermindering en verfijning in diergebruik. De hier gemarkeerde protocollen zijn in lijn met de 3V's. De cervicale manipulatietechniek vermindert het aantal dieren dat nodig is door niet langer het gebruik van mannetjes nodig te hebben om pseudopregnant vrouwtjes te produceren. De techniek elimineert ook de noodzaak om vasectomie uit te voeren op de mannetjes, waardoor verfijning wordt geboden door pijn en angst te verminderen. De hier beschreven geassisteerde voortplantingstechnieken (kunstmatige inseminatie en embryotransfer) zijn niet-chirurgisch en bieden dus beide een 3V-verfijning door de pijn en het leed^{te verminderen 8}veroorzaakt door hun chirurgische alternatieven.

Het gebruik van pseudopregnant vrouwtjes is noodzakelijk voor het herstel van pups bij het uitvoeren van geassisteerde voortplanting bij muizen¹. De CM-procedure is een effectieve methode voor het produceren van pseudopregnant vrouwtjes, maar de synchronisatie van de fase van de oestruscyclus van de ontvangende vrouwtjes is een kritieke eerste stap in het proces. Oestrussynchronisatie kan het aantal vrouwtjes dat nodig is in de kolonie drastisch verminderen om potentiële ontvangers voor te bereiden en helpt bij het produceren van getimede pseudopregnant vrouwtjes op aanvraag. Het gebruik van een lage dosis hormonen lijkt geen schadelijke effecten te hebben op het herstel van levende nesten bij CD1-muizen. Er moet voorzichtig worden omgegaan met andere stammen om de hormoon- en concentratiecombinatie te vinden die de beste ontvangende vrouwtjes produceert voor de overgedragen embryo's of sperma. Synchronisatie kan worden bereikt met PMSG en hCG¹⁶, maar doses die superovulated vrouwtjes produceren, zijn mogelijk niet geschikt voor een langdurige zwangerschap¹⁷.

Om te bepalen of een vrouw in oestrus is, werd in dit werk een cytologische evaluatie uitgevoerd. De oestrusfase kan ook worden geëvalueerd door de observatie van de vaginale opening^11,18. Hoewel deze methode uiterst nuttig is en op zichzelf of als bevestiging kan worden gebruikt, is het subjectiever dan het gebruik van cytologie. Vaginale cytologie zonder kleuring is zowel snel als effectief voor het kiezen van vrouwtjes in oestrus omdat verhoornde epitheelcellen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd. In dit protocol wordt de cytologische evaluatie voorafgaand aan CM uitgevoerd om potentiële ontvangers te bepalen. Het is belangrijk om cytologie uit te voeren voorafgaand aan CM, omdat de procedure de neiging heeft om de cellen uit het vaginale gebied te fragmenteren, waardoor identificatie moeilijk wordt. Cytologische evaluatie voor pseudozwangerschap of zwangerschap kan worden uitgevoerd op 3,5-11,5 dagen na CM (dpcm) gedurende 3 opeenvolgende dagen. Het profiel van een oestrus fietsend vrouwtje moet minstens 1 dag hebben met aanzienlijke infiltratie van verhoornde epitheelcellen. Pseudopregnante/zwangere vrouwen moeten gedurende 3 opeenvolgende dagen een diestrusprofiel vertonen (meestal leukocyten met mogelijk lage celnummers).

Door de ontwikkeling van de CM-techniek bleken sommige muizen ontvankelijker te zijn voor de procedure dan andere. CD1 vrouwelijke muizen zijn uitstekende kandidaten vanwege hun kalme aard en uitstekende verzorgende instincten. Deze soort is gemakkelijk te hanteren en presteert goed tijdens de CM- en niet-chirurgische geassisteerde voortplantingstechnieken. C57Bl/6 muizen hebben de neiging om agressiever en minder verzorgend te zijn. Hoewel dit protocol effectief pseudopregnant C57Bl / 6-vrouwtjes produceerde die CM gebruikten, waren ze minder geneigd om consequent tolerant te zijn voor de procedure. Dit leek enigszins te correleren met de oestrusfase tijdens CM. Vrouwtjes in oestrus of proestrus waren ontvankelijker. Het gebruik van een verrijkingsbuis voor het dier om binnen te komen, gaf toegang tot de vagina voor de procedure en hielp het vrouwtje te kalmeren. De procedure zelf houdt het vrouwtje niet volledig in bedwang, dus het dier kan op elk moment wegtrekken. Als dit gebeurt, kan het dier worden verplaatst en kan de procedure worden voortgezet. De timing van de procedure stopt als het vrouwtje wegloopt en hervat wanneer de procedure wordt hervat. Cruciaal voor het succes van de procedure zijn de fase van de oestruscyclus (late proestrus en oestrus) en het contact van de staaf met de baarmoederhals. De trilling van de trimmer zorgt voor een gestandaardiseerd CM. Om contact met de baarmoederhals te garanderen, wordt zachte druk uitgeoefend op de staaf en wordt de positionering van de staaf tegen de baarmoederhals verzekerd met kleine heen-en-weer bewegingen van de staaf.

Het gebruik van CM heeft het NSAI-protocol verbeterd, omdat vrouwtjes in de juiste fase van de oestruscyclus kunnen worden gekozen voorafgaand aan spermaoverdracht en het protocol niet langer afhankelijk is van paring met vasectomie mannetjes. De synchronisatie van de kunstmatige inseminatie-oestruscyclus is zodanig getimed dat de rijping van de eicellen overeenkomt met de overdracht van sperma op de ochtend van dag 4. Cruciaal voor het succes van het protocol is de aanpassing van de timing van de ovulatie, zodat bevruchting kan plaatsvinden. Er moet voor worden gezorgd dat hCG 15-17 uur vóór de verwachte spermaoverdracht wordt toegediend, zoals wordt voorgesteld voor de timings die worden gebruikt voor in-vitrofertilisatie ¹. De kwaliteit van het spermamonster zal direct van invloed zijn op de uitkomst van kunstmatige inseminatie. Vers sperma dat gecapaciteerd is, zal het beste presteren. Gecryopreserveerd sperma van goede kwaliteit kan in vivo bevruchte embryo's produceren. Voorzichtigheid is echter geboden bij de directe overdracht van ontdooid sperma, omdat resterende cryoprotectanten die naar de baarmoederhoorn worden overgebracht, de implantatie kunnen remmen (ongepubliceerde waarnemingen).

Het gebruik van CM in combinatie met embryotransfer is conceptueel een eenvoudige aanpassing. Oestruscyclussynchronisatie vermindert het aantal vrouwtjes dat nodig is voor het produceren van de ontvangerpool. Het bepalen van het oestrusstadium voorafgaand aan CM verhoogt de kans op het verkrijgen van pseudopregnant ontvangers. Een nadeel van de methode is dat de cytologie van de ontvangers op het moment van embryotransfer zich in een stadium van flux bevindt. Alle celtypen zijn aanwezig als het vrouwtje overgaat van oestrus naar het pseudopregnancy-profiel, en pseudopregnancy wordt pas duidelijk als de cytologie gedurende enkele dagen wordt gevolgd. Op basis van het succes (>80%) van de overgang van oestrus naar pseudopregnancy voor CD1- en C57Bl/6-muizen, wordt verwacht dat deze methode geschikt is voor ontvangers van embryotransfers. De voorlopige resultaten laten goed succes zien met beperkte niet-chirurgische embryotransfer. Over het algemeen is de efficiëntie van niet-chirurgische embryotransfer vergelijkbaar met die van de chirurgische techniek^4,5, en niet-chirurgische overdracht kan chirurgische embryotransfers in het blastocyststadium vervangen. Voor embryo's in een eerder stadium is embryocultuur tot het blastocyststadium vereist. Als echter een chirurgische overdracht de voorkeur heeft, is het mogelijk om de CM-techniek aan te passen aan de juiste timing die nodig is voor geschikte pseudopregnante ontvangers². Over het algemeen zijn de embryo-ontvangers 1 dag minder ver gevorderd dan het embryo. Blastocysten worden bijvoorbeeld geoogst met 3,5 dpc van donoren en overgedragen aan 2,5 dpc-ontvangers. Daarom zal CM zodanig moeten worden uitgevoerd dat de ontvanger zich in een minder ontwikkelde pseudopregnant toestand bevindt dan de embryo's.

Kortom, de hier beschreven CM-techniek is veelbelovend voor integratie met andere geassisteerde voortplantingstechnieken voor muizen. We hebben succesvolle protocollen opgesteld voor kunstmatige inseminatie en embryotransfer met behulp van niet-chirurgische technieken. In combinatie biedt de CM-techniek 3V's voordelen, waaronder (1) een vermindering van het aantal dieren door de noodzaak van vasectomie mannetjes te elimineren en (2) een verfijning van technieken door chirurgische technieken te vervangen door niet-chirurgische alternatieven.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blastocyst stage embryos
CARD Fertiup Preincubation Medium (PM)	CosmoBio	KYD-002-EX	For sperm capacitation
Embryo handling pipette	Cook Medical	K-FPIP-1120-10BS	Flexipet is available in various diameters
Embryo handling pipette assembly	Paratechs	90010
Female mice, Crl:CD1(ICR)	Charles River Laboratories	22	>8 weeks old
Forceps	Fine Science Tools	11053-10	Toothed, for dissection
Forceps	Fine Science Tools	11052-10	Curved, for dissection
Forceps	Fine Science Tools	Dumont #5	Fine, for dissection
Hemocytometer	Fisher Scientific	267110	Optional
human Chorionic Gonadotropin (hCG)	Prospec	hor-250	For estrus synchronization
Incubator, 37 °C 5% CO2	Thermo Scientific
Incubator, 37 °C, benchtop	Cook	K-MINC-1000
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155	Absorbant tissues
M2 medium	Millipore	MR-015-D	Embryo handling medium
Male mice, Crl:CD1(ICR)	Charles River Laboratories	22	>8 weeks old
mC&I device	ParaTechs	60020	For sperm transfer, specula included
mCM rod	ParaTechs	90050	Smooth, blunt, with a diameter @3 mm
Microscope	Olympus	SZX7	20x and 40x magnification with transmitted and reflected illumination source for embryo work and dissections
Microscope	ACCU-SCOPE	3032	100x magnification with bright field illumination
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-7
mNSET device	ParaTechs	60010	For embryo transfer, specula included
Needles, 26 G	Exel	26402
Papanicolaou Staining System	VWR	76265-730	Optional
Paraffin oil	Sigma-Aldrich	18512
Pipette, P200	Corning	4074	Fits the C&I device for sperm transfer
Pipette, PR-2	Rainin	17008648	Fits the NSET device for embryo transfer
Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG)	Prospec	hor-272	For estrus synchronization
Scale	American Weigh Scales	LB-1000
Scissors	Fine Science Tools	14068-12	Dissection
Scissors	Fine Science Tools	14081-09	Angled, dissection
Swabs, Constix	Contec	SC-4	For vaginal cytology
Syringes, 1 cc	Becton Dickenson and Company	309659
Tissue culture dishes, 35 mm	Falcon	353001
Tissue culture dishes, 60 mm	Falcon	353004
Trimmer	Wahl	ChroMini T-Cut
Wire bar topped mouse cage