Observatie van de systolische functie van geïsoleerde rechter boezems van cavia's

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een efficiënte methode voor het screenen van geneesmiddelen die de myocardiale contractiliteit verbeteren met behulp van geïsoleerde rechter boezems van cavia's.

Samenvatting

Vaak chronisch hartfalen (CHF) wordt gekenmerkt door een verminderde ventriculaire vulling en/of ejectiefunctie, wat leidt tot een onverzadigbaar hartminuutvolume en een verhoogde incidentie. De achteruitgang van de systolische functie van het hart is een sleutelfactor in de pathogenese van CHF. Systolische functie is simpelweg het vullen van zuurstofrijk bloed in de linkerhartkamer, gevolgd door het bloed dat tijdens een hartslag door het lichaam wordt gepompt. Een zwak hart en het onvermogen van de linkerventrikel om op de juiste manier samen te trekken als het hart klopt, duiden op een slechte systolische functie. Er is gesuggereerd dat veel traditionele kruiden de systolische functie van het hart bij patiënten versterken. Stabiele en efficiënte experimentele methoden voor het screenen van verbindingen die de contractiliteit van het myocard verbeteren, ontbreken echter nog steeds in het proces van etnisch geneeskundig onderzoek. Hier, met digoxine als voorbeeld, wordt een systematisch en gestandaardiseerd protocol verstrekt voor het screenen van verbindingen die de myocardiale contractiliteit verbeteren door gebruik te maken van geïsoleerde rechter atria van cavia's. De resultaten toonden aan dat digoxine de contractiliteit van het rechter atrium aanzienlijk kon verbeteren. Dit systematische en gestandaardiseerde protocol is bedoeld als methodologische referentie voor het screenen van de actieve ingrediënten van etnische geneesmiddelen bij de behandeling van CHF.

Inleiding

Hartfalen wordt veroorzaakt door een hartinfarct, myocardiopathie, hemodynamische overbelasting, ontsteking en andere oorzaken van myocardletsels, die de anatomie en activiteit van het myocard wijzigen en uiteindelijk leiden tot falen van het ventrikel pompen of vullen. Hartkloppingen, vermoeidheid en vochtophoping zijn de belangrijkste primaire klinische symptomen¹. CHF is een chronische hartfalenaandoening die in de loop van de tijd kan worden gehandhaafd, verergerd of decompensatie kan vertonen, en de incidentie en prevalentie nemen toe met de leeftijd van² jaar. De achteruitgang van de systolische hartfunctie is een sleutelfactor in de pathogenese van CHF³. De huidige medische behandeling voor de ziekte omvat voornamelijk het gebruik van antihypertensiva zoals angiotensine-converterende enzymremmers, β-adrenoceptoren (die de overmatige activering van het neurohormonale systeem remmen, namelijk het sympathische systeem en het renine-angiotensine-aldosteronsysteem), of diuretica (die congestie verminderen)⁴. De klinische tekenen van hartfalen veroorzaakt door een verminderd hartminuutvolume en -reserve worden echter niet vaak behandeld in onderzoeken naar de impact van deze medische behandelingen⁵.

Positieve inotrope geneesmiddelen zijn ontworpen om de contractiliteit van het myocard te verhogen. Hartglycosiden, fosfodiësteraseremmers en β-adrenerge receptoragonisten worden gebruikt als positieve inotrope geneesmiddelen voor de behandeling van hartfalen. Hartglycosiden zijn voornamelijk Digitalis-derivaten ; een voorbeeld is digoxine, het meest gebruikte Digitalis-derivaat en is afgeleid van Digitalis lanata (wit vingerhoedskruid)⁶. Ze binden selectief aan Na⁺/K⁺-ATPase op het celmembraan om de intracellulaire calciumconcentratie te verhogen en zo de cardiale contractiliteit en het slagvolume te verbeteren zonder de zuurstofopname te verhogen, waardoor de cardiale efficiëntie wordt verbeterd⁷. Afgezien van hartglycosiden, verhogen de meeste positieve inotrope geneesmiddelen, zoals fosfodiësteraseremmers en β-adrenerge receptoragonisten, de hartslag en het myocardiale zuurstofverbruik, terwijl ze de calciumbelasting in myocardcellen verhogen om de myocardiale contractiliteit te versterken, wat kan leiden tot klinisch ernstige aritmieën en hypotensie en dus verhoogde mortaliteit⁸. Daarom is de klinische toepassing van deze inotrope geneesmiddelen beperkt. Om complicaties veroorzaakt door verhoogde intracellulaire calciumspiegels te voorkomen, is het noodzakelijk om veiligere en zeer effectieve inotrope modulatoren te ontwikkelen voor de behandeling van CHF (Figuur 1).

In de afgelopen decennia zijn er veel onderzoeken uitgevoerd om verbindingen te genereren en te analyseren die de positieve inotrope eigenschappen van cardiale hemodynamica kunnen ondersteunen. Veel traditionele Chinese medicijnen (TCM), zoals Euodia rutaecarpa (Juss.) Onder andere Benth., Apocynum venetum L. en Sophora alopecuroides L. kunnen de contractiliteit van het myocard versterken ^9,10,11. Studies hebben aangetoond dat TCM en zijn actieve monomeren positieve inotrope effecten kunnen uitoefenen via verschillende mechanismen in vergelijking met inotrope geneesmiddelen. Bijvoorbeeld, liguzinediol, een vorm van ligustrazine gemethyleerd op C₂ en C₅ (een actief ingrediënt van Szechwan Lavas Rhizome), dat de contractiliteit van geïsoleerde rattenharten aanzienlijk verbetert door sarcoplasmatisch reticulum calciumtransiënten te versterken zonder de hartslag te verhogen, kan minder bijwerkingen hebben en een betere behandeling zijn voor CHF¹². Bovendien is matrine een alkaloïde die wordt gewonnen uit de TCM-plant Sophora flavescens Ait. Matrine kan de opregulatie van β 3-AR-eiwitexpressie remmen en de eNOS-expressie verminderen bij ratten in het hartfalenmodel, waardoor hun myocardiale contractiliteit wordt verbeterd¹³. In onderzoek naar etnische geneeskunde is er echter een gebrek aan stabiele en efficiënte experimentele methoden voor het screenen van verbindingen die de contractiliteit van het myocard kunnen verbeteren.

Het is algemeen bekend dat cavia's, in vergelijking met andere knaagdieren, elektrofysiologische en calciumverwerkingskenmerken hebben die meer lijken op die van mensen¹⁴. Aan de ene kant lijkt het elektrocardiogram van cavia's voldoende op dat van mensen, en hun beat-to-beat Ca²⁺ behandeling lijkt meer op de menselijke fysiologie dan die van ratten of muizen^15,16. Aan de andere kant hebben computationele modellen van cardiomyocyten van cavia's uitgebreid onderzoek ondergaan en omvatten ze cruciale cellulaire subsystemen, waaronder het metabolisme van energetica en reactieve zuurstofsoorten¹⁷. Daarom worden geïsoleerde rechter boezems van cavia's veel gebruikt om verbindingen te screenen die de contractiliteit van het myocard verbeteren. Hier nemen we digoxine als voorbeeld om een systematisch en gestandaardiseerd protocol te bieden voor het screenen van verbindingen die de myocardiale contractiliteit verbeteren door gebruik te maken van geïsoleerde rechter atria van cavia's. Daarom biedt dit werk een methodologische referentie voor het screenen van de actieve ingrediënten van etnische geneesmiddelen bij de behandeling van CHF.

Protocol

Het experimentele protocol werd uitgevoerd in overeenstemming met de vereisten van het Use of Laboratory Animals and Institutional Animal Care and Use Committee aan de Ningxia Medical University. Mannelijke Dunkin-Hartley-cavia's met een gewicht van 300-450 g werden gebruikt voor de huidige studie. Het effect van digoxine op contractiliteit werd waargenomen in geïsoleerde rechter boezems van de cavia's (Figuur 2).

1. Oxygenatiepreparaat voor de geïsoleerde rechter boezems van cavia's

1. Bereid de experimentele instrumenten voor, waaronder een biologisch signaalacquisitie- en verwerkingssysteem, een JH-2 spierkrachttransducer, een Magnus-bad, een L-vormige ventilatiehaak, een dikke schaar, een petrischaaltje, paraffine, enz. (zie materiaaltabel).
2. Bereid 1.000 ml Krebs-Henseleit-oplossing (K-H-oplossing) door 7,02 g NaCl (120,0 mM), 2,10 g NaHCO₃ (25,0 mM), 0,30 g KCl (4,0 mM), 0,07 g MgSO₄ (0,6 mM), 0,07 g NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,28 g CaCl₂ (2,5 mM) en 1,98 g glucose (11,0 mM) toe te voegen aan 1.000 ml dubbel gedestilleerd water, en spoel het Magnus-bad twee tot drie keer (zie tabel 1 en tabel met materialen).
   OPMERKING: Houd de temperatuur van de K-H-oplossing op 37 °C ± 1 °C.
3. Bereid 100 ml calciumarme K-H-oplossing door 0,70 g NaCl (120,0 mM), 0,21 g NaHCO₃ (25,0 mM), 0,03 g KCl (4,0 mM), 0,01 g MgSO₄ (0,6 mM), 0,01 g NaH₂PO₄ (0,6 mM), 0,01 g CaCl₂ (0,8 mM) en 0,20 g glucose (11,0 mM) toe te voegen aan 100 ml dubbel gedestilleerd water (zie Tabel 1 en Tabel met materialen).
4. Breng ongeveer 20 ml van de 37 °C K-H-oplossing in het operatiebekken (zie materiaaltabel).
5. Verdeel 5 mm dikke paraffine over de bodem van de petrischaal en vul de petrischaal met de 37 °C K-H-oplossing (zie materiaaltabel).
6. Installeer de L-vormige ventilatiehaak op het uiteinde van de latexbuis van de blaas, plaats deze in de petrischaal en stel in op 1-2 bubbels/s (zie materiaaltabel).
   OPMERKING: Pas de bubbels langzaam aan; Als de actie te snel gaat, kan de zuurstof snel opraken.

2. Bereiding van geïsoleerde rechter boezems van cavia's

1. Weeg cavia's op een weegschaal (zie Materiaaltabel).
2. Induceer anesthesie met behulp van een inductiebox met 5% isofluraan in 100% zuurstof en schakel vervolgens over op een neuskegel met 1,5%-3% isofluraan voor onderhoud (zie materiaaltabel).
3. Knip de halsslagader af met een ruwe schaar en induceer verbloeding voordat u deze op een bord legt. Open vervolgens met een schaar de thorax (te beginnen met het xiphoid-proces en scheid de zijkanten volledig om het hart bloot te leggen) en pel het hartzakje eraf.
   1. Houd het hart omhoog met de linkerhand, gebruik de rechterhand om het hart uit de wortel van de aorta te snijden en plaats het snel in het operatiebekken met de K-H-oplossing. Druk ten slotte twee tot drie keer voorzichtig met de hand op het ventrikel, knijp het ventriculaire bloed eruit en plaats het hart in het petrischaaltje.
      OPMERKING: De actie moet stevig zijn en in 2-5 minuten worden voltooid, en de temperatuur moet worden geregeld op 35 °C. De temperatuur van de K-H-oplossing moet worden geregeld op 37 °C.
4. Bevestig de punt van het hart met een naald aan de met paraffine beklede petrischaal terwijl u zuurstof toedient (60 bubbels/min).
5. Identificeer het juiste atrium.
   OPMERKING: Bij cavia's worden de boezems op hun ventrale oppervlak gescheiden door de longslagader en dorsaal door de aorta. Zowel de linker- als de rechterboezem zijn als een "omgekeerde driehoek" aan de ventrikels bevestigd, en het rechteratrium is iets kleiner dan het linker atrium en heeft ongelijke randen. Het myocardium van de rechterventrikel is dun en het bovenste uiteinde van de collaps is het rechter atrium; de linkerventrikel is meer gepuft en de verdeling van kransslagaders is rijk¹⁸ (Figuur 3).
6. Til de rand van het rechter atrium voorzichtig op met een oogheelkundige tang en snijd langs de atrioventriculaire overgang (zie Materiaaltabel).
   OPMERKING: Vermijd beschadiging van de sinusknoop en probeer dichter bij het ventrikel te snijden terwijl u langs de atrioventriculaire overgang snijdt. In deze stap kan automatische ritmische samentrekking van het rechter atrium worden waargenomen.
7. Gebruik 4-0 chirurgische hechtingen (zie Materiaaltabel) om respectievelijk de boven- en onderkant van het rechter atrium te ligate (beide uiteinden van de "diagonale lijn"), met het ene uiteinde in een lus en het andere uiteinde links met een lang draaduiteinde dat ook een lus is.
   OPMERKING: Probeer zo min mogelijk weefsels te binden bij het afbinden van beide uiteinden van de "diagonale lijn" van de atria.

3. Meting en registratie van de systolische functie van geïsoleerde rechter boezems van cavia's

1. Zet de computer aan en voer het systeem voor het verwerven en verwerken van biologische signalen in (zie materiaaltabel). Pas de versterking (50 mV), tijdconstante (DC), filter (20 Hz) en scansnelheid (1.00 s/div) aan na het bepalen van het verbindingskanaal (eerste kanaal, spanning).
2. Hang het ene uiteinde van het preparaat aan de L-vormige ventilatiehaak met de petrischaal en zuurstof naast het Magnus-bad. Hang het andere uiteinde van het monster aan de JH-2 spierkrachttransducer (zie materiaaltabel).
3. Bekijk de atrische systolische curve, stel de voorspanning in op 0,5-1,0 g en wacht tot deze is gestabiliseerd (ongeveer 30 minuten).
   OPMERKING: Vervang de K-H-oplossing elke 20 minuten. Als dit normaal is, neemt u de waargenomen curve als de standaard en markeert u "normaal". Als het scherm een beetje snel wordt gescand, moet dit worden vertraagd.
4. Dien 0,2 ml calciumarme K-H-oplossing toe en observeer gedurende 5 minuten totdat de curve niet meer afneemt.
5. Dien 0,2 ml 5% digoxine toe (zie materiaaltabel), observeer gedurende 5 minuten, was drie keer en keer dan terug naar normaal.
   OPMERKING: Markeer de administratie. Als het effect duidelijk is, scant u het scherm sneller. Wanneer de curve niet meer stijgt, dat wil zeggen wanneer de samentrekkingsamplitude niet langer toeneemt, was dan drie keer snel; Anders treedt aritmie op, wat de resultaten van de daaropvolgende drugsexperimenten zal beïnvloeden.
6. Verzamel de gegevens en sla deze op een diskette op.

Resultaten

Een afname van de myocardiale contractiliteit veroorzaakt onvoldoende hartminuutvolume, wat leidt tot CHF (Figuur 1). Dit protocol maakte het mogelijk om de effecten van verschillende geneesmiddelen op de systolische functie van geïsoleerde rechter boezems van cavia's vast te leggen en vervolgens snel te screenen op verbindingen van etnische geneesmiddelen die de myocardiale contractiliteit versterken. Na het in stappen aansluiten van het rechter atrium, de ...

Discussie

De normale ritmische activiteit van het hart vereist een geschikte fysische en chemische omgeving, net als de activiteit van geïsoleerde rechter atria. Geïsoleerde rechter boezems zijn geïsoleerd van de innervatie van het lichaam en de directe invloed van systemische humorale factoren, wat betekent dat veranderingen in de activiteit van de rechter boezems kunnen worden waargenomen bij het veranderen van de geneesmiddelen waaraan ze worden blootgesteld. De fundamentele oorzaken van bio-el...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4-0 chirurgische hechting	Yangzhou Fuda Medical Devices Co., Ltd
5% Digoxin (oplosbaar in dimethylsulfoxide)	TCI Shanghai	D1828	CAS: 20830-75-5; Zuiverheid: >96,0%
BL-420N biologische signaalverwerving en verwerkingssysteem	Chengdu Tai Meng Software Co., Ltd	1700142S
CaCl2	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24110	CAS: 10043-52-4; Zuiverheid: 96%
Glucose	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S11022	CAS: 50-99-7; Zuiverheid: 99%
Isofluraan	RWD Life Science Co., Ltd	R510-22-16
JH-2 spierkrachttransducer	Institute of Aerospace Medical Engineering, Beijing, China
KCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24120	CAS: 7447-40-7; Zuiverheid: 99,5%
Magnus bad	Shanghai Future Experimental Equipment Co., Ltd	L046525
MgSO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24253	CAS: 7487-88-9; Zuiverheid: 98%
NaCl	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24119	CAS: 7647-14-5; Zuiverheid: 99,5%
NaH2PO4	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24161	CAS: 7558-80-7; Zuiverheid: 99%
NaHCO3	Shanghai yuanye Bio-Technology Co., Ltd	S24153	CAS: 144-55-8; Zuiverheid: 99,8%
Operatiebassin	Guangzhou Telekuan Medical Instrument Co., Ltd		305 mm x 230 mm
Oogheelkundige pincet	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
Oogheelkundige operatie schaar	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd
Paraffine	Leica Biosystems	39601095
Petrischaal	Corning	430167	100 mm x 20 mm
Rodent anesthesie apparaat	Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd		ABS type (enkelkanaals)
Weegschaal	Shanghai Yueping Scientific Instrument Co., Ltd	YP1002
Chirurgische plaat	Zhengzhou Ketai Experiment Equipment Co., Ltd		21 cm x 31 cm
Weefsel schaar	Suzhou Shuanglu Medical Instrument Co., Ltd	SL0023