Method Article

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

DOI:

10.3791/65484

⸱

September 1st, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural and Food Sciences, Alma Mater Studiorum-University of Bologna

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er is een toename in het gebruik van in vivo en in vitro darmmodellen voor het bestuderen van de pathofysiologie van inflammatoire darmziekten, voor de farmacologische screening van potentieel heilzame stoffen en voor toxiciteitsstudies op potentieel schadelijke voedingsbestanddelen. Relevant is dat er momenteel vraag is naar de ontwikkeling van celgebaseerde in-vitromodellen ter vervanging van diermodellen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een basis, "gezond weefsel" driedimensionaal (3D) intestinaal equivalente model met behulp van cellijnen met het dubbele voordeel van zowel experimentele eenvoud (gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem) als fysiologische complexiteit (Caco-2-enterocyten met een ondersteunende immuuncomponent van U937-monocyten en L929-fibroblasten). Het protocol omvat ook paraffine-inbedding voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten, waardoor het voordeel wordt geboden van het analyseren van meerdere visuele parameters uit een enkel experiment. Hematoxyline- en eosine-gekleurde (H&E) gekleurde secties die laten zien dat de Caco-2-kolomvormige cellen een strakke en regelmatige monolaag vormen in controlebehandelingen, worden gebruikt om de werkzaamheid van het model als experimenteel systeem te verifiëren. Door gluten als pro-inflammatoire voedselcomponent te gebruiken, omvatten de geanalyseerde parameters van secties een verminderde monolaagdikte, evenals verstoring en loslating van de onderliggende matrix (H&E), verminderde tight junction-eiwitexpressie zoals blijkt uit occludinekleuring (statistisch kwantificeerbaar) en immuunactivering van migrerende U937-cellen, zoals blijkt uit de cluster van differentiatie 14 (CD14)-kleuring en CD11b-gerelateerde differentiatie in macrofagen. Zoals aangetoond door lipopolysaccharide te gebruiken om darmontsteking te simuleren, zijn aanvullende parameters die kunnen worden gemeten verhoogde slijmkleuring en cytokine-expressie (zoals midkine) die voorafgaand aan fixatie uit het medium kunnen worden geëxtraheerd. Het driedimensionale (3D) basismodel van het darmslijmvlies en de vaste secties kunnen worden aanbevolen voor onderzoeken naar de ontstekingsstatus en de integriteit van de barrière, met de mogelijkheid om meerdere visueel kwantificeerbare parameters te analyseren.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De intestinale epitheelbarrière, een eencellige dikke binnenbekleding die verschillende soorten epitheelcellen bevat, vormt de eerste fysieke verdedigingsbarrière of interface tussen de buitenkant en het interne milieu van het lichaam 1,2. Enterocyten van het zuilvormige type vormen het meest voorkomende type epitheelcellen. Deze zijn verantwoordelijk voor het handhaven van de integriteit van de epitheliale barrière door interacties tussen verschillende barrièrecomponenten, waaronder tight junctions (TJ's), die een belangrijke rol spelen bij het aanhalen van de barrière 1,3. De TJ-structuur bestaat uit intracellulaire plaque-eiwitten, zoals zonula occludens (ZO) en cinguline, die samenwerken met transmembraaneiwitten, waaronder occludines, claudines en junctionele adhesiemoleculen (JAM's) die een ritsachtige structuur vormen die de naburige cellen nauw met elkaar verbindt. De transmembraaneiwitten reguleren de passieve paracellulaire diffusie van kleine verbindingen en sluiten toxische grote moleculen uit.

Potentieel giftige voedselverbindingen en voedselcontaminanten stimuleren de productie van inflammatoire cytokines die de epitheliale permeabiliteit verstoort, immuuncellen activeert en chronische darmweefselontsteking veroorzaakt 5,6,7. Daarentegen is gemeld dat verschillende antioxiderende en ontstekingsremmende fytochemicaliën de expressie van inflammatoire cytokines verminderen en de integriteit van de intestinale TJ-barrière verbeteren door het herstel van de expressie en assemblage van TJ-eiwitten 4,6,8. Vandaar dat de regulering van de integriteit van de epitheliale barrière door zowel nuttige als schadelijke verbindingen heeft geleid tot een toename van het gebruik van zowel in vivo als in vitro modellen die gericht zijn op het nabootsen van de darmbarrière voor farmaceutische screening en toxiciteitsstudies. Dit is met name relevant gezien de toenemende belangstelling voor het begrijpen van de pathofysiologie van intestinale darmziekten (IBD), necrotiserende enterocolitis en kanker, die kunnen worden gesimuleerd in experimentele modellen 8,9,10.

Er is vraag naar de ontwikkeling van op cellen gebaseerde in-vitromodellen om de doelstelling van de "3V's" in dierproeven te bereiken. Deze omvatten vervangende alternatieven voor het gebruik van dieren, vermindering van het aantal gebruikte dieren en verfijning in het toepassen van methoden die het leed verlichten 11,12,13. Bovendien zijn de onderliggende moleculaire, cellulaire en fysiologische mechanismen tussen menselijke en muizenmodellen (knaagdieren zijn de meest gebruikte soorten) onderscheidend, wat leidt tot controverse over de werkzaamheid van de muizenmodellen als voorspellers van menselijke reacties12,13. Talrijke voordelen van in vitro menselijke cellijnmodellen zijn onder meer doelbeperkte experimenten, directe observatie en continue analyse13.

Monolagen van het eencellige type in tweedimensionale (2D) culturen hebben als krachtige modellen gediend. Deze kunnen echter niet precies de fysiologische complexiteit van menselijke weefsels reproduceren 8,13,14. Als gevolg hiervan worden 3D-kweeksystemen ontwikkeld met steeds grotere verbeteringen om de fysiologische complexiteit van zowel gezonde als zieke darmweefsels samen te vatten als toolboxen voor risicobeoordeling van de volgende generatie13,14. Deze modellen omvatten 3D Transwell-steigers met diverse cellijnen, organoïdeculturen en microfluïdische apparaten (darm-op-chip) met behulp van zowel cellijnen als organoïden (afkomstig van zowel gezonde als zieke weefsels)8,13,14.

Het 3D-protocol voor het equivalent van de darm "gezond weefsel" dat in de huidige studie werd gepresenteerd, was gebaseerd op het vinden van een evenwicht tussen fysiologische complexiteit en experimentele eenvoud13. Het model is representatief voor een 3D Transwell-steiger, bestaande uit drie cellijnen (enterocyten [de gouden standaard colonadenocarcinoom Caco-2-lijn] met een ondersteunende immuuncomponent [U937-monocyten en L929-fibroblasten]), die een gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem vormen dat van toepassing is op de voorlopige screening van voedingsmoleculen die van belang zijn voor de integriteit van de darmepitheliale barrière en de immuunrespons. Het protocol omvat paraffine-inbedding voor lichtmicroscopische evaluatie van de integriteit van de epitheliale barrière met behulp van vaste intestinale equivalenten. Het voordeel van de huidige aanpak is dat meerdere delen van de ingebedde weefsels kunnen worden gekleurd voor meerdere parameters uit een enkel experiment.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van het 3D-gereconstrueerde darmslijmvliesmodel

OPMERKING: De hele procedure moet worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroomkap. Alle stappen in de procedure waarbij de celincubator wordt gebruikt, betekenen dat culturen worden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO2 bevat (tenzij anders vermeld in het protocol).

  1. Voorafgaande voorbereiding van de cellijnen die worden gebruikt in het darmmodelsysteem
    1. Zaad L929 fibroblastcellen van muizen in een concentratie van 5 x 105 in 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 2 mM L-glutamine, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (pen-streptomycine) in een F25-kolf en kweek het 4 dagen voor de constructie van de darmmodellen in een incubator. Verwijder na 48 uur het medium met behulp van een pipet. Voeg vervolgens vers medium (5 ml) toe en incubeer de cellen verder gedurende 48 uur.
      NOTITIE: De cellen moeten voor 80% samenvloeiend zijn voordat ze worden gebruikt.
    2. Zaad Caco-2-cellen (concentratie van 2 x 106) in 10 ml DMEM-medium (met 10% FBS en 1% Pen-Streptokokken) in een F75-celkolf en kweek deze 4 dagen voor de constructie van het darmslijmvliesmodel in een incubator. Vervang na 48 uur het medium zoals beschreven in stap 1.1.1 en incubeer verder gedurende 48 uur tot een confluentie van 80%.
      OPMERKING: De cellen moeten zich in een actieve proliferatiefase bevinden: niet te schaars en niet te confluent. Een samenvloeiing van 50-60% wordt aanbevolen. De cellen mogen niet de dag voor het maken van het model worden gezaaid, omdat dit de proliferatieve capaciteit van de cellen zou kunnen vertragen, die dan niet perfect wortel zou schieten in het gereconstrueerde 3D-model.
    3. Voeg U937-cellen die groeien in suspensie (concentratie van 1 x 106) toe aan 10 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-medium (met 2 mM L-glutamine, 1% natriumpyruvaat, 10% FBS en 1% pen-streptokokken) in een F75-celkolf 2 dagen voorafgaand aan de modelopstelling en plaats gedurende 48 uur in een incubator.
  2. Voorbereiding van de Transwell co-culture plaatinzetstukken
    1. Kies een plaat met 24 putjes met inzetstukken met filters van 0,4 μm.
      OPMERKING: Het 0,4 μm-filter is een standaardkeuze in onderzoeken naar geneesmiddelentransport. De filtergroottes van 3 μm en 8 μm worden niet aanbevolen om mogelijke verliezen van de in collageen ingebedde cellen te voorkomen.
    2. Hydrateer met behulp van een pipet de Transwell-filters (hierna membrane-inserts genoemd) met 500 μL Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) onder en boven het filterinzetstuk.
    3. Sluit de multiwell-plaat en plaats deze minimaal 2 uur in een incubator.
      OPMERKING: De membraaninzetstukken kunnen maximaal 24 uur in de HBSS blijven. Deze bewerking kan de dag voor het bouwen van het model worden uitgevoerd. Het is belangrijk dat de membraaninzetstukken volledig gehydrateerd zijn en dat het filter niet uitdroogt, omdat dit het voor het monster moeilijker kan maken om goed te hechten.
    4. Haal de platen na 2 uur (of 24 uur) uit de couveuse. Zuig de HBSS voorzichtig van boven en onder de membraaninzetstukken op met een pipet en laat deze 10 minuten drogen.
  3. Bereiding van de celvrije collageen lamina propria van het basis 3D darmmodelsysteem (DAG 1)
    1. Bereid een celvrije collageenoplossing in een steriel buisje van 50 ml op ijs dat de volgende componenten in DMEM bevat: 10% foetaal runderserum (FBS), 200 mM L-glutamine, 1% natriumbicarbonaat en 1,35 mg/ml type 1 rattenstaartcollageen.
      OPMERKING: Al deze componenten moeten op ijs worden bewaard en met gekoelde pipetpunten aan de DMEM worden toegevoegd. Het Type 1 rattenstaartcollageen moet als laatste worden toegevoegd, omdat dit polymeriseert bij toenemende temperatuur en pH. De hoeveelheid celvrije collageenoplossing die wordt bereid, hangt af van het aantal benodigde darmequivalenten.
    2. Voeg 250 μL van de oplossing toe aan elk plaatinzetstuk (boven het membraanfilter) voor het aantal geselecteerde darmequivalenten en plaats het deksel over de plaat met meerdere putjes. Laat de collageenoplossing polymeriseren bij kamertemperatuur (RT) onder de laminaire stroomkap.
      OPMERKING: Afgezien van de overgang naar een meer vaste fase, blijkt polymerisatie ook uit een kleurverandering van geel naar roze. De polymerisatie is meestal binnen 10-15 minuten voltooid.
  4. Voorbereiding, celtelling en toevoeging van fibroblast (L929) en monocyten (U937) cellen aan het modelsysteem (DAG 1)
    1. Verwijder de L929-celkweek (stap 1.1.1) uit de incubator. Zuig het medium met behulp van een vacuümpomp op, vervang het door 5 ml steriele fosfaatbufferzoutoplossing (PBS; zonder Ca en Mg) en spoel de cellen.
    2. Zuig de PBS op met behulp van een vacuümpomp. Voeg 2 ml van een vooraf bereide trypsine-EDTA-oplossing toe (0,05% trypsine en 0,02% EDTA in PBS) en plaats 3-5 minuten in een incubator.
    3. Gebruik een omgekeerde microscoop (bijvoorbeeld een Eclipse Ts2, Nikon) om vast te stellen of de cellen loskomen van het adhesieoppervlak. Als dit gebeurt, voeg dan onmiddellijk 2 ml DMEM (met 10% FBS) toe om de trypsinereactie te blokkeren en spoel de cellen.
    4. Breng de celoplossing over in een steriele buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 645 x g . Gebruik een vacuümpomp om het supernatant op te zuigen.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort. Het effect van DMEM werd getest op de L929- en U937-cellen en er werd niet aangetoond dat het nadelige effecten had op de groei.
    5. Voeg 1 ml DMEM toe aan de pellet en suspendeer de cellen.
      OPMERKING: De cellen moeten homogeen in de oplossing worden gesuspendeerd.
    6. Verwijder 20 μL van de cellen in DMEM en voeg 20 μL Trypan blauwe oplossing toe. Verwijder 20 μL van het mengsel en evalueer de celdichtheid microscopisch met behulp van een celtelkamer.
    7. Verwijder de U937-celkweek (stap 1.1.3) uit de incubator. Centrifugeer de celoplossing bij 645 x g gedurende 5 minuten. Gebruik een vacuümpomp om het supernatans op te zuigen om verstoring van de pellet te voorkomen.
    8. Suspendeer de cellen in 1 ml RPMI. Net als bij de L929-cellen, moet u ervoor zorgen dat de cellen homogeen in de oplossing zijn gesuspendeerd.
    9. Bepaal op dezelfde manier de celdichtheid zoals gerapporteerd in stap 1.4.6.
    10. Bereid een collageenoplossing zoals beschreven in stap 1.3.1.
      OPMERKING: Bij de hoeveelheid oplossing die moet worden gemaakt, moet rekening worden gehouden met 450 μL voor elk inzetstuk (of model).
    11. Bereid een oplossing van DMEM voor die een telling bevat van respectievelijk 50.000 L929-cellen en 15.000 U937-cellen in een volume van 50 μL voor elk te construeren darmequivalente model.
      OPMERKING: Het aantal cellen is een kritische factor. Te veel van beide celtypen zouden resulteren in een lamina propria die te vol zit met cellen die niet adequaat georganiseerd zouden zijn. Een inferieur aantal fibroblasten (die collageen genereren) zou resulteren in een minder compacte lamina propria, terwijl te weinig monocyten de immuunrespons op prikkels zouden belemmeren. Op voorwaarde dat het juiste aantal cellen aanwezig is binnen elk aliquot van 50 μL, kan een totaal volume van 600 μL worden bereid voor de 12 filterinzetstukken die in elke plaat met 24 putjes aanwezig zijn.
    12. Voeg in stap 1.4.10 elk aliquot van 50 μl met de cellen toe aan 450 μl collageenoplossing. Meng.
    13. Bedek de voorgecoate celvrije collageenlamina propria met 500 μL van de collageenbevattende celoplossing voor elk model.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de volumes snel aan elke bijsluiter toe te voegen, en daarom is het raadzaam om het aantal gereconstrueerde darmslijmvliesmodellen te beperken tot 12 of minder tegelijk.
    14. Sluit de plaat en plaats deze gedurende 2 uur in een incubator om de oplossing te laten opstijven.
  5. Voorbereiding, celtelling en toevoeging van epitheliale Caco-2-cellen aan het darmmodel (DAG 1)
    1. Haal de Caco-2 celkweek (stap 1.1.2) uit de incubator. Herhaal de procedures uit stap 1.4.1 met 10 ml PBS voor de eerste spoeling. Voeg vervolgens 5 ml van een vooraf bereide trypsine-EDTA-oplossing toe (0,05% trypsine en 0,02% EDTA in Ca- en Mg-vrij PBS) en plaats gedurende 5-8 minuten in een incubator.
    2. Herhaal stap 1.4.3 (maar gebruik 5 ml DMEM om de trypsinereactie te blokkeren) tot en met 1.4.6 om de cellen te tellen met behulp van de celtelkamer.
    3. Bereid een oplossing van DMEM met een telling van 150.000 Caco-2-cellen in 50 μL.
      OPMERKING: Het aantal gebruikte cellen is een kritiek punt. Het overschrijden van 150.000 cellen kan resulteren in een compacte, ongeorganiseerde epitheellaag, terwijl met te weinig (minder dan 100.000) de cellen moeite hebben om te groeien en het basale membraan niet voldoende bedekken, waardoor een discontinue darmepitheellaag ontstaat. Zorg ervoor dat de cellen effectief zijn opgehangen. De punt van een pipet van 200 μl kan worden gebruikt om een homogene verdeling te garanderen. Aangezien er op elk moment 12 modellen kunnen worden geconstrueerd, kan een celoplossing van 600 μL worden bereid.
    4. Voeg na de in stap 1.4.14 vereiste 2 uur 50 μl Caco-2-cellen gesuspendeerd in DMEM toe aan het midden van elk basaalmembraan. Sluit het deksel van de multi-well plaat.
    5. Incubeer gedurende 10 minuten onder de steriele laminaire stroomkap. Breng vervolgens over naar de couveuse gedurende 30 minuten.
    6. Bereid een DMEM-oplossing met 10% FBS en 1% Pen/Streptokokken.
      NOTITIE: Bereid een oplossing voor die voldoende is om een volume van 1 ml per model te gebruiken.
    7. Voeg 500 μL van het medium toe boven het gereconstrueerde model en 500 μL onder het filter.
      NOTITIE: Voorzichtigheid is geboden bij het toevoegen van het medium boven het filter om te voorkomen dat de cellen losraken of worden belast.
    8. Sluit het platensysteem met meerdere putjes en plaats het in de couveuse.
  6. Modelvoorbereiding/vorming en gebruik (DAG 2 tot DAG 6)
    1. DAG 2: Verwijder de oplossing voorzichtig zowel boven het gereconstrueerde model als onder het filter met behulp van een pipet. Vervang door verse 500 μL verse DMEM (10% FBS en 1% Pen/Streptokokken) boven en onder het filter.
    2. DAG 3: Herhaal zoals hierboven in stap 1.6.1.
    3. DAG 4: Herhaal zoals hierboven in stap 1.6.1.
      OPMERKING: Dit darmmodel is een statisch cellulair model; Om de afgifte van moleculen en de groei en stimulatie van cellen te bevorderen, is het daarom erg belangrijk dat het medium elke dag wordt vervangen.
    4. DAG 5: Op dit punt is het model volledig gevormd/ontwikkeld. Gebruik deze modellen voor verdere studies.
      NOTITIE: De beste tijd om het model te gebruiken is na 5 dagen. Hoewel de cellen langer in een incubator kunnen worden gehouden, is de kans groter dat de epitheelcellen ongecontroleerd groeien naarmate er meer tijd verstrijkt, wat resulteert in een ongeorganiseerde en compacte laag die moeilijk te gebruiken is.
    5. Incubeer de modellen na 5 dagen met toxische (gluten of lipopolysaccharide [LPS]) of heilzame componenten (polyfenolen) die van belang zijn. Voeg deze toe aan het bovenste gedeelte van het gereconstrueerde model dat in het DMEM-medium is opgehangen.
      OPMERKING: De geschikte concentratie van elke component van belang moet worden berekend en gesuspendeerd in een DMEM-medium. Niet-behandelde controles die alleen DMEM-medium bevatten, moeten worden opgezet voor vergelijking met de experimentele modellen.
    6. Incubeer de controle- en experimentele modellen gedurende 24 uur in een incubator.
    7. DAG 6: Verwijder het medium boven en onder het filter met een pipet.
      OPMERKING: Het medium kan worden opgeslagen voor volgende enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-type tests om de afgifte van inflammatoire cytokines te meten. Hiervoor moet het medium worden toegevoegd aan steriele injectieflacons en worden bewaard bij -20 ° C voor verdere analyse.

2. Paraffine-inbedding van de gereconstrueerde darmslijmvliesmodellen

NOTITIE: De hele procedure moet worden uitgevoerd onder een chemische zuurkast. Elke stap en de respectieve tijdsbesteding moeten strikt worden nageleefd. Om deze reden is het belangrijk om alle reagentia van tevoren klaar te hebben.

  1. Stel de paraffinemachine in op 58 °C zodat deze klaar is voor gebruik.
  2. Breng de membraaninzetstukken over naar schone putjes met behulp van een tang in een steriele plaat met 24 putjes.
  3. Voeg 500 μL 37% gebufferde formaline in PBS toe boven het filter en 1 ml onder het filter. Sluit het deksel en laat het 2 uur onder de chemische zuurkast staan bij RT.
    OPMERKING: Als alternatief kan 4% gebufferde formaline gedurende 1 uur bij RT worden gebruikt.
  4. Verwijder de formaline en voeg HBSS-oplossing zowel boven als onder het filter toe. Verwijder vervolgens de HBSS.
  5. Maak de lamina propria los van het membraaninzetstuk.
    OPMERKING: De cellen van het darmslijmvlies komen meestal heel gemakkelijk los van het membraaninzetstuk, omdat ze niet aan het laatste vastzitten. Bovendien blijven de twee monstercompartimenten (apicaal en basaal) bevestigd, waardoor de 3D-structuur behouden blijft. Als ze om de een of andere reden niet gemakkelijk kunnen worden losgemaakt, is het belangrijk om een steriel wegwerpscalpelmesje te gebruiken om het darmslijmvlies uit het membraaninzetstuk te verwijderen. Het membraaninzetstuk kan worden doorgesneden, waardoor het loskomt van het plastic. Zorg ervoor dat u het monster nooit met het scalpel aanraakt. Het motief voor het verwijderen van het membraaninzetstuk uit de in collageen ingebedde cellen is dat dit filter kan losraken in de daaropvolgende fixatie- of paraffine-inbeddingsfasen, waardoor vergelijkingen tussen darmslijmvliesmodellen onevenredig worden. Bovendien hebben de membraaninzetstukken in het ingebedde gedeelte een andere consistentie, wat het snijden kan verstoren.
  6. Plaats de bekers van 100 ml onder de chemische zuurkast, elk correct geëtiketteerd om één gereconstrueerd darmslijmvliesmodelsysteem op te nemen. Voeg 25 ml 35% ETOH toe aan elk bekerglas en voeg vervolgens het gereconstrueerde darmslijmvlies toe. Incubeer gedurende 10 min.
  7. Vervang de 35% ethanol door 25 ml 50% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
  8. Vervang de 50% ethanol door 25 ml 70% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
  9. Vervang de 70% ethanol door 25 ml 80% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
  10. Vervang de 80% ethanol door 25 ml 95% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
  11. Vervang de 95% ethanol door 25 ml 100% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
  12. Vervang de 100% ethanol door nog eens 25 ml 100% ethanol en incubeer gedurende 10 minuten.
  13. Plaats bekers van 100 ml onder de zuurkast, elk correct geëtiketteerd om één model te bevatten dat wordt onderzocht. Voeg 50 ml xyleen of een histologisch klaringsmiddel toe gedurende 10-20 minuten.
    OPMERKING: Histo-Clear (histologisch klaringsmiddel) wordt aanbevolen omdat het middel de helderheid en levendigheid van acidofiele vlekken verbetert. De opruimtijd kan variëren van het ene gereconstrueerde darmslijmvliesmonster tot het andere en moet elke 2-3 minuten worden gecontroleerd op transparantie in uiterlijk.
  14. Zodra de monsters transparant zijn, plaatst u ze in een metalen cassettehouder die vervolgens gedurende 45 minuten in vloeibare paraffine in de verwarmde machine wordt ondergedompeld.
  15. Vervang de paraffine en laat de monsters nog 45 minuten in de verwarmde machine staan.
  16. Verwijder de houder van de tissuecassette en plaats deze op ijs om af te koelen. Wanneer de gekoelde monsterblokken loskomen van de metalen houder, kunnen deze verder worden gekoeld bij kamertemperatuur.
  17. Sla de blokken op bij RT.
    NOTITIE: Als het doel is om secties onmiddellijk voor te bereiden, kunnen de blokken bij 4 ° C worden geplaatst, zodat ze bij gebruik goed gekoeld zijn.
  18. Snijd secties van 4 μm met behulp van een microtoom.
  19. Leg de gesneden delen op glaasjes en droog ze 24 uur in een oven op 37 ° C.
  20. De dia's zijn klaar voor gebruik. Bewaar ze bij RT totdat H&E histologische kleuring of immuunhistochemische reactie kleuring (antigeen-antilichaamtype) wordt uitgevoerd.
    1. Voor histochemische kleuring van het immuunsysteem, selecteert u de antilichamen die van belang zijn (hetzij voor de studie van TJ-eiwitten zoals occludine, hetzij voor activering, migratie en differentiatie van monocyten) en detecteert u expressie (via kleuring) met behulp van commerciële kits.
    2. Meet op dezelfde manier slijm met behulp van de Alcian blue en periodic acid-Schiff (PAS) kleuringskit.
    3. Kwantificeer de gekleurde TJ-eiwitten van belang, zoals occludine, door het percentage positieve pixels te berekenen op microfoto's die met de microscoop zijn genomen.
    4. Analyseer foto's van de cellen met behulp van beeldanalysesoftware (bijv. ImageJ2-software [Wayne Rasband, versie 2.9.0/1.53t]).
      1. Om de analyse van de pixels uit te voeren, verwerkt u de digitale afbeeldingen tot 300 pixels/inch en converteert u ze naar 8 bits. Verwerk vervolgens de binaire afbeeldingen met de plug-in Color Deconvolution om de kleuring van het eiwit van belang te analyseren, in dit geval de permanente rode kleuring van occludine.
      2. Sla de geselecteerde afbeelding op als een tiff en onderwerp deze aan een "opschonen"-procedure om artefacten te verwijderen met een grafische editor (bijv. Adobe PhotoshopCC [versie 20.0.4]).
      3. Meet daarna alle interessegebieden met de toepassing Analyseer deeltje van ImageJ2 en rapporteer de gegevens als het aantal pixels.
        OPMERKING: Elk experiment moet in drievoud worden uitgevoerd, waarbij voor elke replicatie drie interne replicatievelden worden geanalyseerd. Voor het kwantificeren van slijm kan hetzelfde principe van het meten van de pixels worden toegepast op de beelden die worden gemaakt van respectievelijk het paars-magenta gekleurde neutrale mucines en het helderblauw gekleurde zure slijm.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het eerste belangrijke aspect is het bepalen van de aanvaardbaarheid van het basale 3D-darmequivalente slijmvlies voor experimentele doeleinden. Dit wordt uitgevoerd met de meest gebruikte kleuring in histologie- en histopathologielaboratoria, namelijk hematoxyline (kleurt nucleair materiaal diepblauw-paarse kleur) en eosine (kleurt cytoplasmatisch materiaal in verschillende tinten roze). De H&E-kleuring wordt eerst uitgevoerd op een onbehandelde controlegroep, die wordt gekweekt onder dezelfde omstandigheden en hetzelfd...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde gereconstrueerde modelsysteem voor het gereconstrueerde darmslijmvlies (figuur 6) combineert fysiologische complexiteit (meer fysiologisch relevante 3D-celculturen met een Caco-2-monolaag met een ECM-rijke lamina propria-ondersteuning die fibroblasten en monocyten bevat) met experimentele eenvoud (het gebruik van commerciële menselijke cellijnen om een gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem te produceren)13. Als zodanig wordt dit ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met dank aan de Umberto Veronesi Foundation voor een fellowship ter ondersteuning van het werk van onderzoekers.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alcian Blue/PAS kitScyTek Laboratories, Inc.APS-1, APS-2kit voor immunohistochemische kleuring
Blue Trypan oplossingThermo Fisher15250061celtelling analyses
Caco-2 colorectale adenocarcinoomcellenATCCATCC HTB-37cel lijn
Citro-Histo-Clear op basis van limoneenHistoline laboratoriesR0050CITROreagens voor paraffine inbedding
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)GIBCO11965092cel kweek reagens
Embedding CenterHistoline laboratoriesTEC2900instrument voor paraffine inbedding
Foetaal Rund Serum (FBS)GIBCOA5256701cel kweek reagens
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)GIBCO12350039cel kweek reagens
Human Midkine ELISA kitCohesion BiosciencesCEK1270ELISA kit
Invers microscoopEclipse Ts2, NikonMFA34100microscoop
L929 muis fibroblastenATCCATCC ®-CCL1cel lijn
LC3-IINovus BiologicalsNB910-40752SuperNovusPackantilichaam
L-GlutamineGIBCOA2916801cel kweek reagens
OccludinNovus BiologicalsNBP1-87402antilichaam
Paraffine Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °CHistoline laboratoriesR0040 PLUSinstrument voor paraffine inbedding
Penicilline-StreptomycineGIBCO15070063cel kweek reagens
Penicilline-StreptomycineGIBCO15070063cel kweek reagens
rat tail collageen type IGIBCOA1048301cel kweek reagens
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)GIBCO21870076cel kweek reagens
NatriumpyruvaatGIBCO11360070cel kweek reagens
Thermo Fisher Countess II FL Automatisch CeltellerThermo FisherTF-CACC2FLceltelling instrument
TranswellCostar Corning3413plastic voor cel kweek
TrypsineGIBCO15090046cel kweek reagens
U937 een pro-monocyte, humane myeloide leukemie cel lijnATCCATCC CRL-1593.2cel lijn
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent rood) Kleuring KitScyTek Laboratories, Inc.AMH080kit voor immunohistochemische kleuring

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
  2. Schoultz, I., Keita, ÅV. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909(1909).
  3. Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17(2022).
  4. Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357(2020).
  5. Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135(2021).
  6. Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611(2021).
  7. Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172(2020).
  8. Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
  9. De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761(2021).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155(2022).
  11. Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc (2023).
  12. Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030(2020).
  13. Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038(2022).
  14. Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
  15. Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn's disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
  16. Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131(2023).
  17. Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591(2020).
  18. Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3(2018).
  19. Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

3D Intestinal ModelIn Vitro IntestineCaco 2 CellsU937 MonocytesL929 FibroblastsParaffin EmbeddingTight Junction ProteinsGluten Induced InflammationOccludin StainingImmune Cell Migration

Related Articles