Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

Summary

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Abstract

Er is een toename in het gebruik van in vivo en in vitro darmmodellen voor het bestuderen van de pathofysiologie van inflammatoire darmziekten, voor de farmacologische screening van potentieel heilzame stoffen en voor toxiciteitsstudies op potentieel schadelijke voedingsbestanddelen. Relevant is dat er momenteel vraag is naar de ontwikkeling van celgebaseerde in-vitromodellen ter vervanging van diermodellen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een basis, "gezond weefsel" driedimensionaal (3D) intestinaal equivalente model met behulp van cellijnen met het dubbele voordeel van zowel experimentele eenvoud (gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem) als fysiologische complexiteit (Caco-2-enterocyten met een ondersteunende immuuncomponent van U937-monocyten en L929-fibroblasten). Het protocol omvat ook paraffine-inbedding voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten, waardoor het voordeel wordt geboden van het analyseren van meerdere visuele parameters uit een enkel experiment. Hematoxyline- en eosine-gekleurde (H&E) gekleurde secties die laten zien dat de Caco-2-kolomvormige cellen een strakke en regelmatige monolaag vormen in controlebehandelingen, worden gebruikt om de werkzaamheid van het model als experimenteel systeem te verifiëren. Door gluten als pro-inflammatoire voedselcomponent te gebruiken, omvatten de geanalyseerde parameters van secties een verminderde monolaagdikte, evenals verstoring en loslating van de onderliggende matrix (H&E), verminderde tight junction-eiwitexpressie zoals blijkt uit occludinekleuring (statistisch kwantificeerbaar) en immuunactivering van migrerende U937-cellen, zoals blijkt uit de cluster van differentiatie 14 (CD14)-kleuring en CD11b-gerelateerde differentiatie in macrofagen. Zoals aangetoond door lipopolysaccharide te gebruiken om darmontsteking te simuleren, zijn aanvullende parameters die kunnen worden gemeten verhoogde slijmkleuring en cytokine-expressie (zoals midkine) die voorafgaand aan fixatie uit het medium kunnen worden geëxtraheerd. Het driedimensionale (3D) basismodel van het darmslijmvlies en de vaste secties kunnen worden aanbevolen voor onderzoeken naar de ontstekingsstatus en de integriteit van de barrière, met de mogelijkheid om meerdere visueel kwantificeerbare parameters te analyseren.

Introduction

De intestinale epitheelbarrière, een eencellige dikke binnenbekleding die verschillende soorten epitheelcellen bevat, vormt de eerste fysieke verdedigingsbarrière of interface tussen de buitenkant en het interne milieu van het lichaam ^1,2. Enterocyten van het zuilvormige type vormen het meest voorkomende type epitheelcellen. Deze zijn verantwoordelijk voor het handhaven van de integriteit van de epitheliale barrière door interacties tussen verschillende barrièrecomponenten, waaronder tight junctions (TJ's), die een belangrijke rol spelen bij het aanhalen van de barrière ^1,3

Protocol

1. Voorbereiding van het 3D-gereconstrueerde darmslijmvliesmodel

OPMERKING: De hele procedure moet worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroomkap. Alle stappen in de procedure waarbij de celincubator wordt gebruikt, betekenen dat culturen worden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO₂ bevat (tenzij anders vermeld in het protocol_).

1. Voorafgaande voorbereiding van de cellijnen die worden gebruikt in het darmmodelsysteem
   1. Zaad L929 fibroblastcellen van muizen in een concentratie van 5 x 10⁵ in 5 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 2 mM L-glutamine, 10% foet....

Results

Het eerste belangrijke aspect is het bepalen van de aanvaardbaarheid van het basale 3D-darmequivalente slijmvlies voor experimentele doeleinden. Dit wordt uitgevoerd met de meest gebruikte kleuring in histologie- en histopathologielaboratoria, namelijk hematoxyline (kleurt nucleair materiaal diepblauw-paarse kleur) en eosine (kleurt cytoplasmatisch materiaal in verschillende tinten roze). De H&E-kleuring wordt eerst uitgevoerd op een onbehandelde controlegroep, die wordt gekweekt onder dezelfde omstandigheden en hetzelfd.......

Discussion

Het hier gepresenteerde gereconstrueerde modelsysteem voor het gereconstrueerde darmslijmvlies (figuur 6) combineert fysiologische complexiteit (meer fysiologisch relevante 3D-celculturen met een Caco-2-monolaag met een ECM-rijke lamina propria-ondersteuning die fibroblasten en monocyten bevat) met experimentele eenvoud (het gebruik van commerciële menselijke cellijnen om een gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem te produceren)¹³. Als zodanig wordt dit .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcian Blue/PAS kit	ScyTek Laboratories, Inc.	APS-1, APS-2	kit for immunohistochemical staining
Blue Trypan solution	Thermo Fisher	15250061	cell count analyses
Caco-2 colorectal adenocarcinoma cells	ATCC	ATCC HTB-37	cell line
Citro-Histo-Clear Limonene based	Histoline laboratories	R0050CITRO	reagent for paraffin embedding
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	GIBCO	11965092	cell colture reagent
Embedding Center	Histoline laboratories	TEC2900	instrument for paraffin embedding
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO	A5256701	cell colture reagent
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO	12350039	cell colture reagent
Human Midkine ELISA kit	Cohesion Biosciences	CEK1270	kit ELISA
Inverted microscope	Eclipse Ts2, Nikon	MFA34100	microscope
L929 mouse fibroblasts	ATCC	ATCC ®-CCL1	cell line
LC3-II	Novus Biologicals	NB910-40752SuperNovusPack	antibody
L-Glutamine	GIBCO	A2916801	cell colture reagent
Occludin	Novus Biologicals	NBP1-87402	antibody
Paraffin Lab-O-Wax PLUS 56 °C–58 °C	Histoline laboratories	R0040 PLUS	instrument for paraffin embedding
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070063	cell colture reagent
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15070063	cell colture reagent
rat tail collagen type I	GIBCO	A1048301	cell colture reagent
Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI)	GIBCO	21870076	cell colture reagent
Sodium pyruvate	GIBCO	11360070	cell colture reagent
Thermo Fisher Countess II FL Automated Cell Counter	Thermo Fisher	TF-CACC2FL	cell counting instrument
Transwell	Costar Corning	3413	plastic for cell colture
Trypsin	GIBCO	15090046	cell colture reagent
U937 a pro-monocytic, human myeloid leukemia cell line	ATCC	ATCC CRL-1593.2	cell line
UltraTek Alk-Phos Anti-Polyvalent (permanent red) Stain Kit	ScyTek Laboratories, Inc.	AMH080	kit for immunohistochemical staining